Artykuł metodologiczny

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50950

⸱

20 grudnia 2013

 ,  ,  , 
1Lehrstuhl für Angewandte Physik and Center for Nanoscience, Ludwig-Maximilians-Universität

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Streszczenie

Celulozomy to dyskretne kompleksy multienzymatyczne używane przez podzbiór beztlenowych bakterii i grzybów do trawienia substratów lignocelulozowych. Składanie enzymów na niekatalitycznym białku rusztowania jest kierowane przez interakcje między rodziną powiązanych par receptor-ligand składających się z oddziałujących modułów kohezyny i dokeryny. Niezwykle silne wiązanie między modułami kohezyny i dokeryny powoduje stałe dysocjacji w niskim zakresie od pikomolarnego do nanomolowego, co może utrudniać dokładne pomiary poza szybkością przy użyciu konwencjonalnych metod masowych. Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek (SMFS) z mikroskopem sił atomowych mierzy reakcję poszczególnych biomolekuł na siłę i w przeciwieństwie do innych metod manipulacji pojedynczymi cząsteczkami (tj. pęsety optycznej) jest optymalna do badania oddziaływań receptor-ligand o wysokim powinowactwie ze względu na jej zdolność do badania reżimu dużej siły (>120 pN). Tutaj przedstawiamy nasz kompletny protokół badania zespołów białek celulozomalnych na poziomie pojedynczej cząsteczki. Korzystając z topologii białek pochodzących z natywnego celulosomu, pracowaliśmy z białkami fuzyjnymi enzym-dockerin i moduł-kohezyna wiążąca węglowodany (CBM-kohezyna), z których każde zawierało dostępną wolną grupę tiolową na zmodyfikowanej reszcie cysteiny. Przedstawiamy nasz protokół immobilizacji powierzchni specyficzny dla danego miejsca, wraz z naszą procedurą pomiaru i analizy danych w celu uzyskania szczegółowych parametrów wiązania dla kompleksu o wysokim powinowactwie. Pokazujemy, jak określić ilościowo siły rozwijające pojedynczą subdomenę, złożone siły zrywające, odchylenia kinetyczne i potencjalne szerokości studni wiążącej. Dalej opisano skuteczne zastosowanie tych metod w charakterystyce oddziaływania kohezyna-dokeryna odpowiedzialnego za tworzenie wielodomenowych kompleksów celulolitycznych.

Wprowadzenie

Celulosomy to duże kompleksy multienzymatyczne wyświetlane na powierzchni beztlenowych bakterii celulolitycznych (np. C. thermocellum), które wyewoluowały, aby skutecznie depolimeryzować lignocelulozę ściany komórkowej roślin do rozpuszczalnych oligosacharydów1. Główną cechą celulozoomów jest oddziaływanie kohezyna-dokeryna o wysokim powinowactwie. W najbardziej znaczącym paradygmacie wysoce konserwatywny moduł dokeryny 60-75 aminokwasów typu I jest wyświetlany na C-końcowym końcu różnych enzymów bakteryjnych. Moduł dokeryny kieruje składanie synergicznych kombinacji enzymów na niekatalityczne białko rusztowania ("rusztowanie"), które składa się z poliproteiny domen kohezyny specyficznych dla modułu dockerin typu I. Na wyższych poziomach architektura celulosomu może stać się bardzo złożona, obejmując alternatywne pary kohezyny i dokeryny (np. typ II, typ III), które zakotwiczają struktury na powierzchni komórki i umożliwiają montaż rozgałęzionych struktur zawierających wiele rusztowań2. Różne typy kohezyny-dockeriny, pomimo powiązanych struktur, wykazują zróżnicowaną specyficzność wiązania, hamując reaktywność krzyżową z niezamierzonymi rusztowaniami lub składnikami innych gatunków bakterii wytwarzających celulozomy. Podczas gdy podejścia bioinformatyczne z powodzeniem zidentyfikowały tysiące unikalnych składników celulozomalnych na poziomie genetycznym, znanych jest stosunkowo niewiele struktur białkowych, a mechanizmy działania w określaniu specyficzności kohezyny i dockeriny pozostają aktywnym obszarem badań w dziedzinie biologii strukturalnej.

Od czasu wynalezienia mikroskopu sił atomowych (AFM) przez Binniga i wsp.3, różne tryby operacyjne AFM zostały opracowane i stale ulepszane, w tym obrazowanie bezkontaktowe, obrazowanie w trybie oscylacji4 i spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek (SMFS)5,6. SMFS przekształcił się w szeroko stosowaną technikę bezpośredniego badania pojedynczych białek7-11, kwasów nukleinowych12-15 i syntetycznych polimerów16-19. W typowym eksperymencie SMFS mającym na celu zbadanie wiązania receptor-ligand20,21, końcówka wspornika AFM jest modyfikowana za pomocą jednego z partnerów wiążących, podczas gdy płaska powierzchnia szkła jest modyfikowana za pomocą komplementarnego partnera wiążącego. Zmodyfikowany wspornik styka się z powierzchnią, co pozwala partnerom na związanie. Podstawa wspornika jest następnie wycofywana ze stałą prędkością, a siła jest mierzona za pomocą metody optycznego odchylenia dźwigni. Wynikowe ślady danych siła-odległość wykazują piki przypominające piłokształtne, jeśli ustanowiono wiązanie. W przypadkach, gdy partnerzy wiążący są połączeni z wieloma domenami białkowymi, każdy pik w śladzie siły-odległości może być skorelowany z rozwijaniem się pojedynczej domeny białkowej lub pofałdowanej poddomeny, podczas gdy ostatni pik odpowiada zerwaniu interfejsu wiązania białka. Określone pozycje elementów odpornych na siłę mogą być wykorzystane jako odcisk palca do identyfikacji różnych domen białkowych będących przedmiotem zainteresowania. Metoda ta może być stosowana do badania ważnych aminokwasów biorących udział w fałdowaniu i stabilizacji białek. W literaturze opisano wiele modeli dotyczących charakterystycznego zachowania wydłużenia siły obserwowanego w eksperymentach SMFS. Do najczęściej stosowanych modeli należą łańcuch swobodnie przegubowy (FJC) model22, łańcuch ślimakowy (WLC) model18,23-25 oraz łańcuch swobodnie obracający się (FRC) model25,26.

W naszej poprzedniej pracy11 użyliśmy spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki do zbadania interakcji modułów kohezyny i dockeriny. W tym miejscu przedstawiono eksperymentalny protokół funkcjonalizacji powierzchni szkła i kantylu za pomocą konstruktów białkowych enzym-dokeryna i CBM-kohezyna. Prezentujemy również protokół SMFS oparty na AFM, w tym procedury akwizycji i analizy danych. Opisany protokół można łatwo uogólnić na inne układy molekularne i powinien okazać się szczególnie przydatny dla badaczy zainteresowanych parami ligandów receptorów o wysokim powinowactwie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Schemat geometrii rozciągania wykorzystanej w niniejszej pracy do badania oddziaływania cohesin-dockerin przedstawiono na Rysunku 1A. Opisany tutaj protokół immobilizacji białek służący do funkcjonalizacji wspornika i szkiełka podstawowego jest zmodyfikowaną wersją procedury opublikowanej wcześniej27. Białka wyeksprymowano z wektorów plazmidowych w E. coli z zastosowaniem konwencjonalnych metod. Białka zaprojektowano z dostępną dla rozpuszczalnika grupą tiolową, którą wykorzystano w połączeniu z chemią maleimidową do przywiązania białka za pomocą stabilnego wiązania tioetrowego do powierzchni szkiełka podstawowego oraz wspornika. Wprowadzone reszty cysteiny w obu białkach fuzyjnych CBM-cohesin i ksylanaza-dockerin znajdowały się po stronie N-końcowej białek, z dala od interfejsu wiązania cohesin-dockerin11. Szczegółowy przegląd wiązań chemicznych zastosowanych w immobilizacji białek przedstawiono na Rysunku 1B.

1. Przygotowanie próbki

  1. Bufory
    1. Przygotować bufor solny Tris uzupełniony wapniem (TBS): 25 mM TRIS, 75 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7,2
    2. Przygotować bufor boran sodu: 50 mM Na2B4O7, pH 8,5
      Schemat blokowy procesu przedstawiający etapy przygotowania próbek znajduje się na Rysunku 2.
      Podczas pracy z belkami dwuwarstwowymi (cantilevers) i szkiełkami podstawowymi zaleca się stosowanie pęset samoblokujących.
  2. Aminosilanizacja szkiełka podstawowego (około 1,5 h)
    1. Umieścić szkiełko podstawowe (średnica 24 mm, grubość 0,5 mm) w uchwycie z PTFE.
    2. Poddać szkiełko podstawowe sonikacji w mieszaninie etanol : woda ultrapure (1:1 (v/v)) przez 15 min.
    3. Opłukać szkiełko podstawowe wodą ultrapure.
    4. Umieścić szkiełko podstawowe w roztworze piranha (1:1 H2SO4 (stężony) : H2O2 (30%) (v/v)) na 30 min, a następnie dokładnie opłukać wodą ultrapure. Osuszyć szkiełko podstawowe pod delikatnym strumieniem N2. Uwaga: roztwór piranha jest niezwykle żrący. Wymagana jest ochrona oczu i skóry.
    5. Zanurzyć szkiełko podstawowe w mieszaninie etanol : woda ultrapure : 3-aminopropyl dimethyl ethoxysilane (45:5:1 (v/v)). Umieścić na wytrząsarce w temperaturze pokojowej (RT) przez 60 min (około 50 rpm).
    6. Zanurzać szkiełko podstawowe kolejno w etanolu i wodzie ultrapure (po 2 razy każdy). Osuszyć szkiełko podstawowe pod delikatnym strumieniem N2.
    7. Wypalić szkiełko podstawowe w piekarniku (80 °C przez 30 min).
    8. Silanizowane szkiełka podstawowe można przechowywać w atmosferze argonu do 6 tygodni.
  3. Aminosilanizacja belek dwuwarstwowych (około 1,5 h)
    UWAGA: Przedstawiony protokół funkcjonalizacji końcówki jest odpowiedni dla krzemowych belek dwuwarstwowych.
    1. Umieścić belki dwuwarstwowe na czystym szkiełku przedmiotowym. Poddać działaniu UV-ozonu przez 15 min.
    2. Zanurzyć belki dwuwarstwowe na 3 min w mieszaninie etanol : 3-aminopropyl dimethyl ethoxysilane (1:1 (v/v)) z katalityczną ilością (0,25% (v/v)) wody ultrapure.
    3. Opłukać belki dwuwarstwowe przy delikatnym mieszaniu, kolejno przez 60 s w zlewkach z toluenem, etanolem i wodą ultrapure. Ostrożnie osuszać belki dwuwarstwowe na papierze filtracyjnym pomiędzy płukaniem.
    4. Umieścić belki na czystym szkiełku przedmiotowym i wypalić (80 °C przez 30 min).
  4. Redukcja mostków dwusiarczkowych białka (około 3 h)
    Wszystkie roztwory należy przygotować tak, aby uzyskać około 30 µl rozcieńczonego białka na jedną belkę dwuwarstwową i 20 µl rozcieńczonego białka na jedno szkiełko podstawowe. Roztwory białek należy mieszać z żelem redukującym mostki dwusiarczkowe Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) w stosunku 1:2 (v/v).
    1. Przygotować alikwoty kulek redukujących mostki dwusiarczkowe TCEP w mikroprobówkach. Zaleca się odcięcie końcówek mikropipet nożyczkami w celu poszerzenia otworu przy pipetowaniu zawiesiny kulek TCEP.
    2. Przepłukać zawiesinę kulek TCEP 1 ml buforu TBS i wirować przy 850 rcf przez 3 min.
    3. Ostrożnie usunąć i odrzucić nadsącz za pomocą mikropipety.
    4. Powtórzyć kroki 1.4.2-1.4.3 dwa razy.
    5. Nanieść stężony roztwór białka (1-10 mg/ml) na kulki TCEP (1:2 białko : zawiesina kulek TCEP (v/v)) i delikatnie wymieszać, mieszając końcówką mikropipety. Unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza.
    6. Umieścić mieszaninę białka i zawiesiny kulek TCEP na rotatorze na 2,5 h.
  5. PEGylacja szkiełek podstawowych i belek dwuwarstwowych (około 1,5 h)
    1. Przed modyfikacją łącznikami NHS-PEG-maleimide, namoczyć aminosilanizowane belki dwuwarstwowe i szkiełka podstawowe w buforze boranu sodu (pH 8,5) przez 45 min w celu deprotonowania grup amin pierwszorzędowych na powierzchni.
    2. Upewnić się, że proszek NHS-PEG-maleimide został ogrzany do RT przed otwarciem nakrętki i odważeniem odpowiedniej ilości do przygotowania roztworu 25 mM. Niewykorzystany NHS-PEG-maleimide należy przechowywać w atmosferze argonu w temperaturze -20 °C. Wymagane jest około 30 µl roztworu polimeru na jedną belkę dwuwarstwową oraz 90 µl na 2 szkiełka podstawowe (ułożone warstwowo).
    3. Po odważeniu 5 kDa NHS-PEG-maleimide dodać bufor boranu sodu i wymieszać w wortexie, aby uzyskać roztwór 25 mM.
      Uwaga: Roztwór należy zużyć jak najszybciej ze względu na niezwykle krótki okres półtrwania NHS przy pH 8,5. Wymieszanie w wortexie i przeniesienie cieczy na belki dwuwarstwowe/szkiełka podstawowe powinno zostać zakończone w ciągu 1-2 min.
    4. Inkubować belki dwuwarstwowe w kroplach 30 µl roztworu NHS-PEG-maleimide w szalce Petriego. W przypadku szkiełek podstawowych nanieść 90 µl roztworu NHS-PEG-maleimide na jedno szkiełko podstawowe, a następnie nałożyć na nie drugie szkiełko, tworząc „kanapkę” ze szkiełek podstawowych z roztworem NHS-PEG-maleimide w środku.
    5. Inkubować belki dwuwarstwowe/szkiełka podstawowe z roztworem NHS-PEG-maleimide w atmosferze nasyconej wodą w RT przez 1 h.
  6. Koniugacja białka (około 2 h)
    Krytyczne: Zminimalizować ekspozycję PEGylowanych belek dwuwarstwowych i szkiełek podstawowych na powietrze.
    1. Wirować roztwory kulek TCEP/zredukowanego białka przy 100 rcf przez 1 min i zebrać nadsącz.
    2. Rozcieńczyć roztwór białka buforem TBS. Dążyć do uzyskania stężenia białka podczas koniugacji powierzchniowej w zakresie 0,5-2 mg/ml. Odstawić zredukowane i rozcieńczone roztwory białek na kilka minut na czas płukania belek dwuwarstwowych i szkiełek podstawowych.
    3. Opłukać belki dwuwarstwowe i szkiełka podstawowe w trzech kolejnych zlewkach z wodą ultrapure.
    4. Ostrożnie usunąć pozostałą ciecz ze szkiełek podstawowych, delikatnie dotykając krawędzi papierem filtracyjnym pod delikatnym strumieniem N2. Ostrożnie usunąć pozostałą ciecz z belek dwuwarstwowych, dotykając ich papierem filtracyjnym. Natychmiast nanieść rozcieńczony roztwór białka.
    5. Zamontować szkiełka podstawowe w odpowiednim uchwycie na próbki, który jest kompatybilny z instrumentem AFM.
    6. Inkubować PEGylowane szkiełka podstawowe i belki dwuwarstwowe z odpowiednimi rozcieńczonymi roztworami białek w RT przez 1-2 h.
    7. Opłukać belki dwuwarstwowe w trzech kolejnych zlewkach z buforem TBS, aby usunąć niezwiązane białka. Przepłukać szkiełka podstawowe za pomocą pipety co najmniej 10 razy.
    8. Przechowywać belki dwuwarstwowe i szkiełka podstawowe w buforze TBS przed pomiarem.

2. Pozyskiwanie danych

W niniejszej pracy wykorzystano zbudowany na zamówienie AFM28 sterowany kontrolerem MFP-3D AFM firmy Asylum Research za pomocą autorskiego oprogramowania Igor Pro. Ugięcie dźwigara jest mierzone metodą optycznego odchylenia wiązki29. Przedstawione tutaj protokoły przygotowania próbek i analizy danych mają zastosowanie niezależnie od użytego modelu AFM. Model AFM powinien być jednak odpowiedni do pomiarów w cieczach i zapewniać dostępny zakres prędkości piezoelektryka z w osi z w przedziale około 200-5 000 nm/sec.

  1. Zamocuj funkcjonalizowaną belkę i szklaną powierzchnię w AFM. Przez cały czas trwania procedury powierzchnia powinna pozostać pokryta buforem. Podczas montażu belki należy zminimalizować ekspozycję na powietrze. Po prawidłowym ustawieniu wiązki lasera pozostaw system do wyrównania na co najmniej 30 min, aby zredukować efekty dryftu, i w razie potrzeby dokonaj ponownej kalibracji.
  2. Zarejestruj widmo szumu termicznego przy belce oddalonej od powierzchni, tzn. w przypadku braku efektów tłumienia.
  3. Użyj małoinwazyjnej metody, takiej jak podejście akustyczne, aby zlokalizować powierzchnię bez uszkodzenia wierzchołka belki przed pomiarem. Jeśli to możliwe, zbliż belkę do powierzchni ręcznie i użyj słuchawek, aby odsłuchać szum termiczny z surowego sygnału ugięcia z kontrolera AFM. Gdy tylko belka zbliży się do powierzchni, słyszalna jest wyraźna zmiana dźwięku.
    Uwaga: Wierzchołek belki powinien znajdować się teraz w odległości 2-5 µm od powierzchni. Charakter zmiany dźwięku zależy od użytej belki. Częstotliwość rezonansowa belki użytej w tej pracy wynosi w wodzie około 25 kHz, co wykracza poza zakres słyszalności człowieka. Ze względu na efekty tłumienia w pobliżu powierzchni, rezonans przesuwa się w stronę niższych częstotliwości, wprowadzając rezonans belki w zakres słyszalny. W związku z tym odczuwalny jest pozorny wzrost częstotliwości i natężenia dźwięku.
    W przypadkach, gdy wyjście audio sygnału ugięcia jest niedostępne, do powierzchni można zbliżyć się za pomocą piezoelektryka z osi z, gdy włączone jest aktywne sprzężenie zwrotne sygnału ugięcia. Gdy tylko sygnał ugięcia wzrośnie o określoną wartość w wyniku wciśnięcia w powierzchnię, zbliżanie zostaje zatrzymane.
  4. Wyznacz odwrotną czułość dźwigni optycznej (InvOLS), która reprezentuje odległość przemieszczenia wierzchołka (w nm) na wolt sygnału ugięcia. Zrób to, wciskając wierzchołkiem belki w powierzchnię. Zaleca się ustawienie napięcia set-point ugięcia odpowiadającego przemieszczeniu wierzchołka belki o około 3 nm.
  5. Wyznacz stałą sprężystości belki poprzez dopasowanie funkcji odpowiedzi prostego oscylatora harmonicznego do widma szumu termicznego, zgodnie z twierdzeniem o równopodziale energii30,31.
  6. Uruchom rutynę eksperymentalną. W tej pracy zastosowano następujący zestaw parametrów pomiarowych: prędkość zbliżania: 3 000 nm/sec; siła wciskania: 180 pN; czas przebywania na powierzchni: 10 msec; prędkości oddalania: 0,2, 0,7, 2,0, 5,0 µm/sec z odpowiednimi częstotliwościami próbkowania 2 000, 5 000, 15 000, 20 000 Hz; odległość oddalania: 500 nm.
    Uwaga: Częstotliwość próbkowania nie powinna być ustawiona wyżej niż 10 punktów/nm, aby uniknąć nadpróbkowania i utrzymać rozmiary danych na rozsądnym poziomie.
  7. Po każdym pomiarze siły i odległości (force-distance trace), przesuń etapy piezoelektryczne w osiach x i y, aby w każdej krzywej siła-odległość wystawić belkę na nowy obszar powierzchni. Technika ta pozwala na próbkowanie większego obszaru powierzchni szkiełka podstawowego podczas pomiarów długoterminowych.
  8. Podczas pomiarów długoterminowych stosuj okresowe zerowanie stopnia ugięcia (tzn. pozycji fotodiody) oraz wysokości obudowy piezoelektryka z osi z w przypadku, gdy sygnał ugięcia dryfuje poza zakres lub nastąpi utrata kontaktu z powierzchnią.
  9. Po zakończeniu serii pomiarowej wykonaj kolejny pomiar InvOLS z użyciem znacznie większej siły wciskania niż stosowana przed pomiarami, aby uzyskać bardziej precyzyjną wartość InvOLS.
  10. Zarejestruj kolejne widmo szumu termicznego z dala od powierzchni. Wyznacz stałą sprężystości na koniec serii eksperymentalnej.

3. Analiza danych

Schemat blokowy na Rysunku 3 przedstawia proces analizy danych. Wszystkie manipulacje danymi należy przeprowadzić przy użyciu odpowiedniego pakietu oprogramowania, takiego jak Igor Pro lub MATLAB. W pierwszej kolejności należy przekonwertować surowy sygnał z detektora na jednostki siły oraz skorygować przesunięcie i dryft. Następnie, wykorzystując modele elastyczności biopolimerów, należy zlokalizować bariery energetyczne w ścieżkach rozfałdowania oraz zidentyfikować poddomeny białkowe. Na koniec wyznacza się parametry kinetyczne i energetyczne oddziaływania receptor-ligand.

  1. Konwersja jednostek i korekcja danych
    1. Pomnożyć surowy sygnał ugięcia (wolty) przez InvOLS (nm/volt) oraz stałą sprężystości (pN/nm), aby przeliczyć napięcie detektora na jednostki siły.
    2. Przesunąć dane tak, aby nieobciążona belka miała wartość siły równą zero pN, najpierw obliczając średnią wartość siły z ostatnich 10% śladu siła-odległość (pozyskanych w największej odległości od powierzchni), a następnie odejmując tę średnią od wszystkich wartości siły w śladzie danych.
    3. Przesunąć każdy ślad w kierunku x tak, aby pierwszy punkt przecięcia z osią odległości znajdował się w odległości 0 nm.
    4. Wartość InvOLS zależy od pozycji plamki lasera na belce. Nawet niewielki dryft w optycznym systemie odczytu może spowodować zauważalne zmiany InvOLS, gdy rozmiar powierzchni styku belki jest porównywalny z rozmiarem plamki lasera. Należy to skorygować poprzez analizę szumu sygnału ugięcia przy zerowej sile. Przy założeniu stałych warunków otoczenia, szum sygnału ugięcia jest wprost proporcjonalny do InvOLS.
      1. Zmierz wartość średnia kwadratowa (RMS) ugięcia (poziom szumu przy zerowej sile) dla ostatnich 10% każdego śladu siła-odległość.
      2. Nanieść szum w funkcji numeru krzywej i zastosować odpowiedni dopasowanie. Zazwyczaj najlepiej sprawdzi się dopasowanie wykładnicze w formie Wzór na zanik wykładniczy, N(n_i)=N_0 * e^(-kn_i), reprezentacja matematyczna., gdzie N to szum, ni to numer krzywej, a N0 i k to parametry dopasowania. Dla niektórych zestawów danych odpowiednie może być również dopasowanie liniowe.
      3. Wyznaczyć czynnik skalujący (SF) dla każdej krzywej:

        Równanie 1:
        równanie równowagi statycznej; (SF)=(N₀e^(-knᵢ)+C)/(N₀e^(-knₓ)+C); wzór matematyczny
        gdzie ni jest numerem krzywej, nf końcowym numerem krzywej, a C jest przesunięciem.
      4. Następnie podzielić wszystkie wartości siły w każdej pojedynczej krzywej przez czynnik skalujący. Procedura ta skaluje każdą krzywą zgodnie ze stosunkiem wartości szumu RMS aktualnej krzywej do wartości szumu RMS końcowego śladu, który został pozyskany bezpośrednio przed pomiarem InvOLS.
      5. Przeprowadzić korekcję ugięcia, aby przekształcić oś odległości (z) w rozciągnięcie molekularne (z*). Uwzględnia to wygięcie belki pod wpływem siły, co skraca odległość między końcówką belki a próbką w stosunku do wartości raportowanej przez pozycję czujnika z-piezo.

        Równanie 2:
        Równanie równowagi statycznej, z* = z - F/k, wzór; obliczenia fizyczne, analiza siły
        Gdzie z to zmierzona pozycja czujnika z, F to siła działająca na belkę, a k to stała sprężystości.
  2. Analiza długości konturowej
    Długość konturowa białka to maksymalna rozciągnięta długość łańcucha polipeptydowego. Stan sfałdowania białka odnosi się do jego geometrii i odległości między końcami, determinowanych przez strukturę drugorzędową i trzeciorzędową. Długość konturowa białka jest bezpośrednio powiązana z jego stanem sfałdowania9,25,32. Pozycja konkretnych pęknięć w śladach siła-rozciągnięcie różni się znacząco ze względu na polidyspersyjność łączników PEG, a także parametry zewnętrzne, takie jak temperatura, właściwości buforu i szybkości obciążania. Utrudnia to bezpośrednią analizę danych, ale można temu zaradzić poprzez przekształcenie danych siła-rozciągnięcie w przestrzeń długości konturowej. Technika ta umożliwia uśrednianie ogromnych zestawów danych i pozwala na wykorzystanie automatycznego rozpoznawania wzorców do identyfikacji charakterystycznych zdarzeń rozfałdowania. Możliwe jest zatem sortowanie poszczególnych śladów siły w zależności od wykazanego rodzaju oddziaływania. Do przekształcenia danych siła-rozciągnięcie w przestrzeń długości konturowej stosuje się następującą, opisaną wcześniej procedurę25.
    1. Rozwiązanie modelu WLC (Równanie 3)23 dla długości konturowej L przy stałej długości persystencyjnej p prowadzi do Równania 4, które określa długość konturową L(x,u). Tutaj x to odległość, a u=F*p/kBT, gdzie kB to stała Boltzmanna, a T to temperatura. Pod uwagę można brać tylko rozwiązania rzeczywiste. Dodatkowe ograniczenia to x, F>0, L>0, x>0;

      Równanie 3:
      Wzór siła-rozciągnięcie, F(x,L), równanie fizyki polimerów, ilustrujące sprężystość entropową.

      Równanie 4:
      Równowaga statyczna, L(x,u), złożony wzór, schemat edukacyjny, interpretacja wyrażenia analitycznego.
      gdzie,
      Równanie funkcji wielomianowej \( g(u) \), analiza matematyczna, obliczenia symboliczne.
    2. Nanieść przekształcone punkty danych na wykres siły w funkcji długości konturowej. Zastosować próg siły wynoszący około 10 pN, aby wyeliminować szum. Oddziaływania nieswoiste można wykluczyć, stosując filtr długości górnoprzepustowy. Stworzyć histogram długości konturowych.
    3. Przeprowadzić korelację wzajemną33 uzyskanych histogramów z histogramem wzorcowym i przesunąć go wzdłuż osi x, aby skorygować polidyspersyjność PEG. Wykorzystać wynikowe wartości korelacji do pomiaru podobieństwa poszczególnych śladów danych. W ten sposób ślady danych można posortować do zdefiniowanych klas, aby uprościć dalszą analizę.
    4. Użyć podobnej techniki do znalezienia powtarzających się cech w pojedynczym śladzie za pomocą autokorelacji, np. w przypadku wielokrotnego rozfałdowania domen Ig.
    5. Posortować ślady ręcznie, aby zbadać inne zdarzenia rozfałdowania.
  3. Analiza szybkości obciążania
    Wyodrębnić informacje kinetyczne i energetyczne dotyczące dysocjacji receptor-ligand poprzez zastosowanie odpowiednich modeli do spektrum siły, t.j. wykresu siły pęknięcia w funkcji ln(szybkości obciążania).
    1. Dla danej prędkości przeciągania wyznaczyć siłę pęknięcia i szybkość obciążania dla interesujących zdarzeń pęknięcia:
      1. Wykonać dopasowanie liniowe do śladu siła-czas w sąsiedztwie interesującego zdarzenia pęknięcia. Wyznaczyć szybkość obciążania z nachylenia linii dopasowanej do piku. Powtórzyć tę procedurę dla każdego śladu wykazującego interesujące zdarzenie pęknięcia.
      2. Wyznaczyć najbardziej prawdopodobną siłę pęknięcia, stosując dopasowanie Gaussa do histogramu sił pęknięcia. Możliwe jest zastosowanie alternatywnych funkcji dopasowania.
      3. Wyznaczyć najbardziej prawdopodobną szybkość obciążania.
    2. Powtórzyć kroki 3.3.3.1 - 3.3.3.3 dla wszystkich prędkości przeciągania.
    3. Nanieść najbardziej prawdopodobne siły pęknięcia w funkcji logarytmu naturalnego z najbardziej prawdopodobnych szybkości obciążania, aby uzyskać spektrum siły.
    4. Zastosować odpowiedni model teoretyczny do spektrum siły w celu wyodrębnienia parametrów kinetycznych i energetycznych (Rysunek 4C). W wielu przypadkach można zastosować liniowy model Bella-Evansa20,34, który pozwoli na uzyskanie dobrych szacunków dla koff, szybkości dysocjacji w przypadku braku siły, oraz Dx, odległości do stanu przejściowego wzdłuż współrzędnej reakcji, jak pokazano w Równaniu 5.

      Równanie 5:
      statyczne równanie siły ⟨F⟩, k_B T/Δx, analiza wzoru dla eksperymentów z fluktuacjami termicznymi

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisaną procedurę wykorzystaliśmy do zbadania pary kohezyna-dokeryna typu I z C. thermocellum. Po pomyślnym związaniu pary kohezyna-dokeryna, zarejestrowane profile siła-odległość wykazały charakterystyczne wzorce pików. Typowy profil przedstawiono na Rysunku 4a. Każdy pik na profilu reprezentuje rozfałdowanie jednej subdomeny białka, a ostatni pik odpowiada dysocjacji kompleksu receptor-ligand.

W przypadku kompleksu CBM-kohezyna-dokeryna-ksylanaza badanego w niniejsz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby uzyskać znaczące dane z eksperymentów spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek, kluczowe jest uzyskanie dobrze zdefiniowanych i powtarzalnych geometrii ciągnięcia. Zastosowany tutaj protokół skutkuje specyficzną dla miejsca immobilizacją kompleksów białkowych w zdefiniowanej geometrii ciągnięcia.

Wsporniki użyte w tym badaniu zostały wybrane ze względu na ich czułość na siłę i wysoką częstotliwość rezonansu w wodzie. Co więcej, mała krzywizna końcówki wynosząca około 10 nm jest korzystna ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy potwierdzają finansowanie z grantu Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych dla Hermanna Gauba. Michael A. Nash z wdzięcznością dziękuje za dofinansowanie z programu Society in Science - The Branco Weiss Fellowship. Autorzy dziękują Edwardowi A. Bayerowi, Yoavowi Barakowi i Danielowi B. Friedowi z Weizmann Institute of Science za hojne dostarczenie białek użytych w tym badaniu. Autorzy dziękują Hermannowi E. Gaubowi, Eliasowi M. Puchnerowi i Stefanowi W. Stahlowi za pomocne dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-aminopropylodimetyloetoksysilanABCR GmbHAB110423
5 kDa NHS-PEG-maleimideRapp Polymer13 5000-65-35
TCEP Żel redukujący dwusiarczekThermo Scientific, Pierce77712www.thermoscientific.com/pierce
Tris(hydroksymetylo)aminometan
BioLever mini wsporniki z azotku krzemuOlympusBL-AC40TS-C2Miękkie dozowniki
XYZ Siłowniki piezoelektrycznePhysik Instrumente GmbH
Podczerwień " szerokie spektrum" Laser na podczerwieńSuperlum
MFP-3D AFM KontrolerAsylum Research
Igor Pro 6.31WavemetricsAkwizycja i analiza danych
Chlorek
sodu Chlorek
Miernik
Boran
Pęseta
Okulary nakrywkoweThermo Scientific, Menzel-Glä serŚrednica 24 mm, grubość 0,5 mm
na próbkę PTFEwykonany na zamówienie
Kąpiel
Czystość analityczna etanolu
Kwas siarkowy (stężony)czystość analityczna
Nadtlenek wodoru (30%)czystośćanalityczna
Wytrząsarka orbitalna
Czystość analitycznatoluenu
Bibuła
Szkiełka
Mikroprobówki Mikropipety
Wirówka przystosowanado mikroprobówek
Rotator
szalki
Zlewki
Mikroskop
wapniapH soduUchwyt sonicyjnafiltracyjnapodstawowePetriego optyczny

Bibliografia

  1. Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).
  2. Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. From Cellulosomes to Cellulosomics. Chem. Rec. 8 (6), 364-377 (2008).
  3. Binnig, G., Quate, C. F. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).
  4. Garcı́a, R., Perez, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf. Sci. Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
  5. Engel, A., Müller, D. J. Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 715-718 (2000).
  6. Li, H., Cao, Y. Protein Mechanics: From Single Molecules to Functional Biomaterials. Acc. Chem. Res. 43 (10), 1331-1341 (2010).
  7. Florin, E. -L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  8. Oberhauser, A., Hansma, P., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2), 468-472 (2001).
  9. Puchner, E. M., Gaub, H. E. Force and function: probing proteins with AFM-based force spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 19 (5), 605-614 (2009).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J., Gaub, H. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Sci. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Stahl, S. W., Nash, M. A., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin–dockerin complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  12. Boland, T., Ratner, B. D. Direct measurement of hydrogen bonding in DNA nucleotide bases by atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5297-5301 (1995).
  13. Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E. B-S Transition in Short Oligonucleotides. Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007).
  14. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).
  15. Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. Cytosine methylation alters DNA mechanical properties. Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).
  16. Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
  17. Giannotti, M. I., Vancso, G. J. Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy. Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).
  18. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Phys. Rev. Lett. 94 (4), 10-1103 (2005).
  19. Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Stimuli-Responsive Oligo(ethylene glycol) Copolymer to Gold. ACS Nano. 6 (12), 10735-10742 (2012).
  20. Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy. Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).
  21. Morfill, J., Neumann, J., et al. Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide. Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).
  22. Ortiz, C., Hadziioannou, G. Entropic Elasticity of Single Polymer Chains of Poly(methacrylic acid) Measured by Atomic Force Microscopy. Macromolecules. 32 (3), 780-787 (1999).
  23. Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, F. Entropic Elasticity of l-phage DNA. Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).
  24. Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28 (26), 8759-8770 (1995).
  25. Puchner, E. M., Franzen, G., Gautel, M., Gaub, H. E. Comparing Proteins by Their Unfolding Pattern. Biophys. J. 95 (1), 426-434 (2008).
  26. Livadaru, L., Netz, R. R., Kreuzer, H. J. Stretching Response of Discrete Semiflexible Polymers. Macromolecules. 36 (10), 3732-3744 (2003).
  27. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nat. Protoc. 5 (6), 975-985 (2010).
  28. Gumpp, H., Stahl, S. W., Strackharn, M., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Ultrastable combined atomic force and total internal fluorescence microscope. Rev. Sci. Instrum. 80 (6), 063704 (2009).
  29. Gustafsson, M. G. L., Clarke, J. Scanning force microscope springs optimized for optical-beam deflection and with tips made by controlled fracture. J. Appl. Phys. 76 (1), 172 (1994).
  30. Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).
  31. Proksch, R., Schäffer, T. E., Cleveland, J. P., Callahan, R. C., Viani, M. B. Finite optical spot size and position corrections in thermal spring constant calibration. Nanotechnology. 15 (9), 1344-1350 (2004).
  32. Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds. Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).
  33. Dietz, H., Rief, M. Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition. Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).
  34. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys. J. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  35. Dietz, H., Rief, M. Protein structure by mechanical triangulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).
  36. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments. Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).
  37. Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia si atomowychoddzia ywanie kohezyny z dokerynmonta celulosomusi y rozwijania bia ekdynamiczne widmo simodel Bella Evansaimmobilizacja specyficzna wzgl dem miejscawi zanie receptor ligandkinetyczne sta e dysocjacji

Powiązane artykuły