Generowanie chimer poduszeczek tłuszczowych węzłów chłonnych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych

Summary

Opisano wytwarzanie chimer węzłów chłonnych/poduszeczek tłuszczowych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych. Metoda polega na izolacji węzłów chłonnych od nowonarodzonych myszy i embrionalnych poduszeczek tłuszczowych, wytworzeniu chimerycznych poduszek tłuszczowych węzłów chłonnych i ich przeniesieniu pod torebkę nerkową myszy gospodarza.

Abstract

Zrąb jest kluczowym elementem struktury i funkcji węzłów chłonnych. Niewiele jednak wiadomo o jego pochodzeniu, dokładnym składzie komórkowym i mechanizmach rządzących jego powstawaniem. Węzły chłonne są zawsze zamknięte w tkance tłuszczowej i niedawno wykazaliśmy znaczenie tej zależności dla powstawania zrębu węzłów chłonnych. Komórki prekursorowe adipocytów migrują do węzła chłonnego podczas jego rozwoju i po zaangażowaniu receptora Lymphotoxin-b wyłączają adipogenezę i różnicują się w limfoidalne komórki zrębu (Bénézech i wsp.¹⁴). Opierając się na potencjale zrębu limfatycznego tkanki tłuszczowej, przedstawiamy metodę wykorzystującą chimerę węzła chłonnego/poduszeczki tłuszczowej, która umożliwia śledzenie linii prekursorów komórek zrębu węzłów chłonnych. Pokazujemy, jak wyizolować węzły chłonne noworodka i zarodkową tkankę tłuszczową EYFP⁺ oraz wykonać chimerę poduszeczki tłuszczowej LN/EYFP⁺. Po przeniesieniu pod torebkę nerkową myszy gospodarza, węzeł chłonny zawiera lokalne komórki prekursorowe tkanki tłuszczowej i kończy jej tworzenie. Analizę potomstwa komórek poduszeczek tłuszczowych EYFP⁺ w powstałych węzłach chłonnych można przeprowadzić za pomocą analizy cytometrycznej cytometrycznej trawionych enzymatycznie węzłów chłonnych lub za pomocą analizy immunofluorescencyjnej kriosekcji węzłów chłonnych. Wykorzystując poduszeczki tłuszczowe z różnych modeli myszy z nokautem, metoda ta zapewni skuteczny sposób analizy pochodzenia różnych populacji komórek zrębu węzłów chłonnych.

Introduction

Węzły chłonne (LN) są kluczowymi organami układu odpornościowego położonymi w strategicznych miejscach ciała, wzdłuż sieci naczyń limfatycznych. Umożliwiają one filtrację antygenów i patogenów oraz zapewniają miejsce prezentacji antygenu do limfocytów i indukcji adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. Zrąb, który tworzy podstawową strukturę LN i koordynuje ruch różnych hematopoetycznych uczestników adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, ma kluczowe znaczenie dla funkcji tych narządów. Różne populacje komórek zrębu dostarczają niezbędnych i specyficznych wskazówek dotyczących ruchów, lokalizacji, przeżycia, proliferacji i dojrzewania składnika krwiotwórczego układ....

Protocol

Myszy były hodowane i utrzymywane w warunkach SPF w Jednostce Usług Biomedycznych na Uniwersytecie w Birmingham, zgodnie z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych i lokalnej komisji etyki. Wszystkie procedury opisane w niniejszym protokole są objęte licencją projektu zatwierdzoną zarówno przez lokalną komisję etyczną, jak i Ministerstwo Spraw Wewnętrznych.

1. Izolacja noworodków

1. Poświęć nowonarodzone myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
2. Przekrój głowę i otwórz ciało nożyczkami od góry okolicy klatki piersiowej do dołu okolicy brzusznej i ostrożnie usuń wszystkie wnętrzności (serce, płuca, wątrobę, jel....

Results

Trzy tygodnie po przeszczepie, chimera LN/poduszeczki tłuszczowej zostaje odzyskana z nerki. Chimera jest teraz bardzo podobna do normalnego LN we własnej poduszce tłuszczowej, a LN jest widoczna w środku tkanki tłuszczowej (ryc. 1). Jeśli LN nie może zostać zidentyfikowany, możliwe, że został utracony podczas przeszczepu nerki. Oceniając rolę genów potencjalnie ważnych w rozwoju LN, odzyskane LN mogą pozostać bardzo małe i trudniejsze do znalezienia. Dzieje się tak w przypadku, gdy tkanka tłuszczowa mys.......

Discussion

W artykule przedstawiono metodę oznaczania i ilościowego określania udziału komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej w rozwoju LN oraz dwie techniki pozwalające na analizę ich potomstwa. Rozwarstwianie embrionalnych poduszeczek tłuszczowych i noworodków LN jest delikatne i wymaga umiejętności manualnych zdobytych przez wiele ćwiczeń przed wygenerowaniem właściwej chimery LN - poduszeczki tłuszczowej. Aby kontrolować jakość rozwarstwień, można przeprowadzić analizę cytometryczną przepływową na poduszeczkach tłuszczowych.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-merkaptoetanol	Sigma	M3148
50 mm Sterilin Petri Szalka Appleton	Woods	SC265
90 mm Sterilin Petri Szalka Appleton	Woods	SC260
Szkiełka samoprzylepne	Surgipath	00202
Anty-mysz CD31 eFluor 450	eBioscience	48-0311
Anty-mysz CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
Anty-mysia CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
Anty-mysia IgM rodamina Red	Stratech	715-296-020-JIR
Anty-mysia podoplanina PE/Cy7	Biolegend	127411
Anty-mysia podoplanina oczyszczona	eBioscience	14-5381
Kolagenaza D	Roche
DMEM Medium	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Dumont #5 Kleszcze Inox Biologie	FST	11252-20	Bardzo cienkie kleszcze do preparacji zarodków i noworodków
Roztwór EDTA 0,5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogenesis
Surowica bydlęca płodu	Sigma	F9665
Hartowane nożyczki do drobnej tęczówki proste 11 cm	FST	14090-11	Małe nożyczki do preparacji
Roztwór HEPES	Sigma	H0887
Filtry membranowe izoporowe 0,8 μ m ATTP	Millipore	ATTPO 1300
Roztwór L-glutaminy	Sigma	G7513
MEM Nieistotny roztwór aminokwasów (100x)	Sigma	M7145
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Penicylina-Streptomycyna	Sigma	P4458
Plastikowe pudełko z pokrywką	Watkins and Doncaster	E6052	Pudełko na kanapki do hodowli narządów in vitro. Wywierć dwa otwory w pokrywie, aby umożliwić wymianę gazową w inkubatorze CO2.
RPMI 1640 Medium	Sigma	R0883
Gąbki Vulkan Underwrap	Patterson Medical	004383
Stereomikroskop	Leica	LEICA MZ95	Mikroskop preparacyjny z zoomem
Thermomixer	Eppendorf	5436
Vectashield Medium montażowe z DAPI	Vector Laboratories	H-1200