Generowanie chimer poduszeczek tłuszczowych węzłów chłonnych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych

Summary

Opisano wytwarzanie chimer węzłów chłonnych/poduszeczek tłuszczowych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych. Metoda polega na izolacji węzłów chłonnych od nowonarodzonych myszy i embrionalnych poduszeczek tłuszczowych, wytworzeniu chimerycznych poduszek tłuszczowych węzłów chłonnych i ich przeniesieniu pod torebkę nerkową myszy gospodarza.

Abstract

Zrąb jest kluczowym elementem struktury i funkcji węzłów chłonnych. Niewiele jednak wiadomo o jego pochodzeniu, dokładnym składzie komórkowym i mechanizmach rządzących jego powstawaniem. Węzły chłonne są zawsze zamknięte w tkance tłuszczowej i niedawno wykazaliśmy znaczenie tej zależności dla powstawania zrębu węzłów chłonnych. Komórki prekursorowe adipocytów migrują do węzła chłonnego podczas jego rozwoju i po zaangażowaniu receptora Lymphotoxin-b wyłączają adipogenezę i różnicują się w limfoidalne komórki zrębu (Bénézech i wsp.¹⁴). Opierając się na potencjale zrębu limfatycznego tkanki tłuszczowej, przedstawiamy metodę wykorzystującą chimerę węzła chłonnego/poduszeczki tłuszczowej, która umożliwia śledzenie linii prekursorów komórek zrębu węzłów chłonnych. Pokazujemy, jak wyizolować węzły chłonne noworodka i zarodkową tkankę tłuszczową EYFP⁺ oraz wykonać chimerę poduszeczki tłuszczowej LN/EYFP⁺. Po przeniesieniu pod torebkę nerkową myszy gospodarza, węzeł chłonny zawiera lokalne komórki prekursorowe tkanki tłuszczowej i kończy jej tworzenie. Analizę potomstwa komórek poduszeczek tłuszczowych EYFP⁺ w powstałych węzłach chłonnych można przeprowadzić za pomocą analizy cytometrycznej cytometrycznej trawionych enzymatycznie węzłów chłonnych lub za pomocą analizy immunofluorescencyjnej kriosekcji węzłów chłonnych. Wykorzystując poduszeczki tłuszczowe z różnych modeli myszy z nokautem, metoda ta zapewni skuteczny sposób analizy pochodzenia różnych populacji komórek zrębu węzłów chłonnych.

Introduction

Węzły chłonne (LN) są kluczowymi organami układu odpornościowego położonymi w strategicznych miejscach ciała, wzdłuż sieci naczyń limfatycznych. Umożliwiają one filtrację antygenów i patogenów oraz zapewniają miejsce prezentacji antygenu do limfocytów i indukcji adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. Zrąb, który tworzy podstawową strukturę LN i koordynuje ruch różnych hematopoetycznych uczestników adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, ma kluczowe znaczenie dla funkcji tych narządów. Różne populacje komórek zrębu dostarczają niezbędnych i specyficznych wskazówek dotyczących ruchów, lokalizacji, przeżycia, proliferacji i dojrzewania składnika krwiotwórczego układu odpornościowego^1-3. Dorosłe komórki zrębu LN dzielą się na trzy kategorie: komórki śródbłonka krwi, komórki śródbłonka limfatycznego i fibroblasty. Te trzy kategorie obejmują populacje niejednorodne. Populacje fibroblastyczne zawierają fibroblastyczne komórki siatkowate (FRC), pęcherzykowe komórki dendrytyczne (FDC), brzeżne komórki siatkowate (MRC), podczas gdy fibroblasty tworzące torebkę, rdzeń i inne komórki, które nie są jeszcze zidentyfikowane^1-5. Pochodzenie i mechanizmy rządzące dojrzewaniem różnych populacji komórek zrębu LN są niejasne, a brak specyficznych markerów umożliwiających mapowanie losów określonych populacji komórek zrębu LN sprawia, że ich badanie jest szczególnie trudne. Jednak pełne zrozumienie ontogenezy komórek zrębu LN jest niezbędne do zrozumienia adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych, mechanizmów przyczyniających się do tolerancji i leżących u podstaw rozwoju sztucznych LN.

Do tej pory badania nad pochodzeniem i rozwojem komórek zrębu LN ograniczały się głównie do bezpośredniej oceny rozwoju LN u zarodków i noworodków u myszy dzikich i różnych szczepów myszy z nokautem^6-9. Podejścia te są ograniczone przez letalność embrionalną i okołoporodową niektórych szczepów myszy przenoszących delecje w genach ważnych dla rozwoju LN. Co więcej, niektóre geny niezbędne do rozwoju tkanki limfatycznej są również zaangażowane w szeroki zakres procesów biologicznych, jak ma to miejsce w przypadku RANK^10-11 lub NF-κB2¹². Aby rozwiązać te problemy, przeprowadzono izolację i przeszczepienie embrionalnych LN pod torebkę nerkową myszy gospodarza^12-13. Technika ta pozwala na przykład na transfer genetycznie zmodyfikowanych embrionalnych LN w środowisku typu dzikiego w celu oceny rozwoju narządów oraz rekrutacji i organizacji komórek gospodarza. Jednak wzrost zarodka LN przeszczepionego pod torebką nerkową dorosłego gospodarza jest upośledzony, co ogranicza stosowanie tej techniki.

LN i złogi tłuszczu są anatomicznie ściśle powiązane i rozwijają się jednocześnie podczas embriogenezy. Niedawno wykazaliśmy, że asocjacja LN / tkanka tłuszczowa odgrywa kluczową rolę w dostarczaniu komórek progenitorowych komórek zrębu dla LN. W szczególności sygnalizacja przez LTβR kontroluje los komórek prekursorowych adipocytów poprzez blokowanie adipogenezy i zamiast tego promowanie dojrzewania w kierunku fenotypu komórek zrębu LN¹⁴. W tym miejscu opisujemy metodę opartą na generowaniu chimer poduszeczek tłuszczowych LN, które pozwalają na śledzenie komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej w rozwijającym się LN. Metoda ta będzie przydatna do określenia udziału tkanki tłuszczowej w różnych populacjach komórek zrębu LN, a w połączeniu z wykorzystaniem tkanek z genetycznie zmodyfikowanych szczepów myszy, pozwoli lepiej zrozumieć mechanizmy kontrolujące różnicowanie różnych podzbiorów komórek zrębu LN.

Protocol

Myszy były hodowane i utrzymywane w warunkach SPF w Jednostce Usług Biomedycznych na Uniwersytecie w Birmingham, zgodnie z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych i lokalnej komisji etyki. Wszystkie procedury opisane w niniejszym protokole są objęte licencją projektu zatwierdzoną zarówno przez lokalną komisję etyczną, jak i Ministerstwo Spraw Wewnętrznych.

1. Izolacja noworodków

1. Poświęć nowonarodzone myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
2. Przekrój głowę i otwórz ciało nożyczkami od góry okolicy klatki piersiowej do dołu okolicy brzusznej i ostrożnie usuń wszystkie wnętrzności (serce, płuca, wątrobę, jelito, nerki, pęcherz moczowy) z jamy brzusznej.
3. Przenieść ciało na 90-milimetrową szalkę Petriego zawierającą pożywkę RF10 (pożywka RPMI1640 uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy). Począwszy od tego etapu, tkanki będą przechowywane w sterylnych warunkach i przenoszone w kapturze do hodowli tkankowych.
4. Przenieść ciało na nową szalkę Petriego o średnicy 90 mm zawierającą RF10.
5. Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie oderwij otrzewną od skóry w okolicy pachwinowej. LN pachwinowy znajduje się na przecięciu trzech naczyń krwionośnych w poduszce tłuszczowej.
6. Ostrożnie wyjmij LN. Upewnij się, że cała tkanka tłuszczowa została usunięta. Przenieść LN na płytkę Petriego o średnicy 50 mm zawierającą pożywkę RF10. Trzymaj chusteczki na lodzie, kontynuując procedurę.

2. Izolacja poduszek tłuszczowych E18.5

1. Aby wygenerować zarodki myszy w 18,5 dniu ciąży (E18,5), zaplanuj ciążę w czasie, umieszczając samicę i samca myszy w klatce na noc. Oddziel myszy rano i sprawdź, czy nie ma czopów pochwowych (dzień ciąży E0,5).
   1. Poddaj eutanazji zatkane samice w 18,5 dniu ciąży przez zwichnięcie szyjki macicy.
   2. Usuń zarodki i umieść je na szalce Petriego o średnicy 90 mm zawierającej RF10.
2. Począwszy od tego etapu, tkanki powinny być przenoszone przy użyciu sterylnej techniki w kapturze do hodowli tkankowej. Pod mikroskopem preparacyjnym przekrój głowę, otwórz zarodki nożyczkami od okolicy klatki piersiowej do dna jamy brzusznej i ostrożnie usuń wszystkie wnętrzności (serce, płuca, wątrobę, jelito, nerki, pęcherz moczowy) z jamy ciała.
3. Oczyść ciało ze wszystkich pozostałych tkanek trzewnych i umyj je w PBS, aby wyeliminować wszelkie ślady krwi, które mogłyby utrudnić sekcję.
4. Przenieść czyste ciała na świeżą szalkę Petriego o średnicy 90 mm zawierającą RF10.
5. Ostrożnie odłącz otrzewną od skóry w okolicy pachwinowej. LN pachwinowy znajduje się na przecięciu trzech naczyń krwionośnych w poduszce tłuszczowej.
6. Ostrożnie wyjmij LN i wyrzuć go. Bardzo ważne jest całkowite usunięcie LN, aby upewnić się, że poduszeczka tłuszczowa używana do chimer nie jest zanieczyszczona żadnymi limfoidalnymi komórkami zrębu.
7. Usunąć pachwinową poduszkę tłuszczową i przenieść ją na płytkę Petriego o średnicy 50 mm zawierającą pożywkę RF10. Trzymaj chusteczki na lodzie, kontynuując procedurę.

3. Generacja Chimery LN-fat Pad

1. Przygotowanie systemu do hodowli narządów in vitro ¹⁵.
   1. Przygotowanie gąbek i filtrów: Można to zrobić z wyprzedzeniem, a gąbki i filtry przechowywać w sterylnej postaci na szalce Petriego w okapie hodowlanym.
      1. Pokrój Vulkan Underwrap na 1-1,5 cm² kawałki
      2. Gotuj biszkopty przez 2 godziny w wodzie destylowanej.
      3. Pozostaw gąbki do wyschnięcia na kilka godzin w kapturze do hodowli komórkowych.
      4. Gotuj filtry przez 20 minut.
      5. Pozostaw filtry do wyschnięcia na kilka godzin w kapturze do hodowli komórkowych.
   2. Przygotuj pożywkę DMEM uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, 10 mM HEPES, 1x MEM Nieistotny roztwór aminokwasów, 50 mM 2-merkaptoetanolu, 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy.
   3. Dodać 2 ml pożywki na szalce Petriego o średnicy 50 mm.
   4. Ułóż jedną biszkopt na dnie szalki Petriego. Zwilż obie strony gąbki, zanurzając je w podłożu.
   5. Umieść jeden filtr na gąbce. Filtr jest umieszczony na granicy faz ciecz-powietrze.
2. Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie ponownie powiąż jednego nowonarodzonego LN z jedną embrionalną poduszką tłuszczową.
3. Umieść chimerę LN-fat pad na wierzchu filtra.
4. Przenieś szalkę Petriego do prostokątnego plastikowego pudełka z kilkoma otworami w pokrywie i zawierającym wodę na dnie, aby zapewnić wilgotność.
5. Uszczelnij pokrywę do pudełka taśmą. Pozostaw dwa otwory w pokrywie otwarte.
6. Przenieść pudełko do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ . Pozwól pudełku zrównoważyć się przez 2 godziny, zanim uszczelnisz otwory w pokrywie taśmą.
7. Inkubować tkanki przez co najmniej 2 dni, aby LN mógł przyczepić się do poduszeczki tłuszczowej i mógł zostać przeniesiony pod torebkę nerkową.

4. Przeniesienie chimery poduszeczki tłuszczowej LN pod torebkę nerkową myszy gospodarzy

1. Zbierz chimery poduszeczek tłuszczowych LN z filtra i przenieś je pod torebkę nerkową myszy gospodarza. Sposób transferu torebki nerkowej został już opisany ¹⁶.

5. Izolacja przenoszonych LN

1. Po 3-4 tygodniach pod torebką nerkową chimery poduszeczek tłuszczowych LN są gotowe do zbioru. Poddaj myszy eutanazji gospodarza zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.
2. Usuń nerkę z myszy gospodarza.
3. Pod mikroskopem preparacyjnym wyizoluj chimerę poduszeczki tłuszczowej LN i wypreparuj LN.

6. Trawienie enzymatyczne przenoszonych LN do analizy cytometrycznej przepływowej

1. Wykonaj jedno nacięcie w LN małymi nożyczkami, aby enzymy mogły przeniknąć do narządu i ułatwić trawienie.
2. Umieścić jeden LN w 1,5 ml Eppendorf zawierającym 600 μl buforu wytrawiającego (RPMI 1% FCS, 2,5 mg/ml Kolagenaza D, 100 μg/ml DNazy I).
3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C na mieszającym bloku termicznym. Pipetuj w górę i w dół, aby pomóc w dysocjacji tkanek co 10 minut.
4. Dodaj 6 μl EDTA 0,5 M do probówki i pipetuj w górę iw dół, aby zakończyć dysocjację tkanek.
5. Wirować przez 5 minut przy 490 x g.
6. Zawiesić osad komórkowy w roztworze barwiącym (PBS, 0,1% BSA, 5% surowicy szczura i 5% surowicy myszy) zawierającej kombinację przeciwciał pierwszorzędowych.
7. Inkubować przez 30 minut na lodzie.
8. Umyć dwukrotnie w PBS
9. W razie potrzeby inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 20 minut.
10. Umyć 2x w PBS.
11. Analiza na cytometrze przepływowym.

7. Analiza przeniesionych LN za pomocą immunofluorescencji

1. Utrwalanie w celu konserwacji EYFP podczas procesu zamrażania i kriosekcji: Umieść LN w roztworze PBS, 4% PFA i 10% sacharozy i pozostaw na 3-4 godziny.
2. Umieść jedną małą kroplę zimnego związku OCT na małym kawałku folii aluminiowej. Unikaj pęcherzyków powietrza. Ostrożnie umieść LN bez płynu w środku kropli.
3. Zamrozić narząd, umieszczając folię aluminiową na suchym lodzie.
4. Wytnij odcinki o grubości 8-10 μm na dodatkowych szkiełkach samoprzylepnych za pomocą kriostatu. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 2 godziny przed przechowywaniem ich w temperaturze -20 °C.
5. Procedury barwienia mogą się różnić w zależności od zastosowanych przeciwciał pierwotnych i mogą być zoptymalizowane na podstawie poniższego protokołu. Wybarwić skrawki roztworem barwiącym (PBS, 1% BSA) zawierającym kombinację przeciwciał pierwszorzędowych.
6. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
7. Prać dwukrotnie w PBS przez 5 minut
8. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę.
9. Prać dwa razy w PBS przez 5 minut.
10. Zamontuj slajdy w nośniku montażowym zawierającym DAPI.
11. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego.

Results

Trzy tygodnie po przeszczepie, chimera LN/poduszeczki tłuszczowej zostaje odzyskana z nerki. Chimera jest teraz bardzo podobna do normalnego LN we własnej poduszce tłuszczowej, a LN jest widoczna w środku tkanki tłuszczowej (ryc. 1). Jeśli LN nie może zostać zidentyfikowany, możliwe, że został utracony podczas przeszczepu nerki. Oceniając rolę genów potencjalnie ważnych w rozwoju LN, odzyskane LN mogą pozostać bardzo małe i trudniejsze do znalezienia. Dzieje się tak w przypadku, gdy tkanka tłuszczowa mys...

Discussion

W artykule przedstawiono metodę oznaczania i ilościowego określania udziału komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej w rozwoju LN oraz dwie techniki pozwalające na analizę ich potomstwa. Rozwarstwianie embrionalnych poduszeczek tłuszczowych i noworodków LN jest delikatne i wymaga umiejętności manualnych zdobytych przez wiele ćwiczeń przed wygenerowaniem właściwej chimery LN - poduszeczki tłuszczowej. Aby kontrolować jakość rozwarstwień, można przeprowadzić analizę cytometryczną przepływową na poduszeczkach tłuszczowych...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-merkaptoetanol	Sigma	M3148
50 mm Sterilin Petri Szalka Appleton	Woods	SC265
90 mm Sterilin Petri Szalka Appleton	Woods	SC260
Szkiełka samoprzylepne	Surgipath	00202
Anty-mysz CD31 eFluor 450	eBioscience	48-0311
Anty-mysz CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
Anty-mysia CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
Anty-mysia IgM rodamina Red	Stratech	715-296-020-JIR
Anty-mysia podoplanina PE/Cy7	Biolegend	127411
Anty-mysia podoplanina oczyszczona	eBioscience	14-5381
Kolagenaza D	Roche
DMEM Medium	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Dumont #5 Kleszcze Inox Biologie	FST	11252-20	Bardzo cienkie kleszcze do preparacji zarodków i noworodków
Roztwór EDTA 0,5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogenesis
Surowica bydlęca płodu	Sigma	F9665
Hartowane nożyczki do drobnej tęczówki proste 11 cm	FST	14090-11	Małe nożyczki do preparacji
Roztwór HEPES	Sigma	H0887
Filtry membranowe izoporowe 0,8 μ m ATTP	Millipore	ATTPO 1300
Roztwór L-glutaminy	Sigma	G7513
MEM Nieistotny roztwór aminokwasów (100x)	Sigma	M7145
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Penicylina-Streptomycyna	Sigma	P4458
Plastikowe pudełko z pokrywką	Watkins and Doncaster	E6052	Pudełko na kanapki do hodowli narządów in vitro. Wywierć dwa otwory w pokrywie, aby umożliwić wymianę gazową w inkubatorze CO2.
RPMI 1640 Medium	Sigma	R0883
Gąbki Vulkan Underwrap	Patterson Medical	004383
Stereomikroskop	Leica	LEICA MZ95	Mikroskop preparacyjny z zoomem
Thermomixer	Eppendorf	5436
Vectashield Medium montażowe z DAPI	Vector Laboratories	H-1200