Artykuł metodologiczny

Modele interakcji gen-środowisko w celu ujawnienia mechanizmów podatności w chorobie Parkinsona

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50960

⸱

7 stycznia 2014

 ,  ,  , 
1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

W tym artykule

Podsumowanie

Izoenzymy lipooksygenazy (LOX) mogą generować produkty, które mogą zwiększać lub zmniejszać stan zapalny układu nerwowego i neurodegenerację. Badanie interakcji gen-środowisko może zidentyfikować efekty specyficzne dla izoenzymu LOX. Wykorzystanie modelu 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP) uszkodzenia nigrostriatalnego w dwóch liniach transgenicznych z niedoborem izoenzymów LOX pozwala na porównanie wpływu izoenzymów LOX na integralność dopaminergiczną i stan zapalny.

Streszczenie

Aktywność lipooksygenazy (LOX) jest związana z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera, ale jej wpływ na patogenezę choroby Parkinsona (PD) jest mniej zrozumiały. Modele interakcji gen-środowisko są użyteczne w demaskowaniu wpływu określonych szlaków komórkowych na toksyczność, której nie można zaobserwować przy użyciu wyłącznie genetycznego lub toksycznego modelu choroby. Aby ocenić, czy różne izoenzymy LOX selektywnie przyczyniają się do neurodegeneracji związanej z PD, myszy transgeniczne (tj. z niedoborem 5-LOX i 12/15-LOX) mogą być prowokowane toksyną, która naśladuje uszkodzenie komórek i śmierć w zaburzeniu. Tutaj opisujemy zastosowanie neurotoksyny, 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyna (MPTP), która powoduje zmianę nigrostriatalną, aby wyjaśnić wyraźny wkład izoenzymów LOX w neurodegenerację związaną z PD. Zastosowanie MPTP u myszy i naczelnych jest dobrze ugruntowane, aby podsumować uszkodzenie nigrostriatalne w PD. Zakres zmian wywołanych przez MPTP mierzy się za pomocą analizy HPLC dopaminy i jej metabolitów oraz półilościowej analizy Western blot prążkowia pod kątem hydroksylazy tyrozynowej (TH), enzymu ograniczającego szybkość syntezy dopaminy. Aby ocenić markery stanu zapalnego, które mogą wykazywać selektywną wrażliwość izoenzymową LOX, przeprowadza się kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP) i immunohistochemię Iba-1 na odcinkach mózgu zawierających istotę czarną, a analizę GFAP Western blot przeprowadza się na homogenatach prążkowia. To eksperymentalne podejście może dostarczyć nowych informacji na temat interakcji gen-środowisko leżących u podstaw zwyrodnienia nigrostriatal i PD.

Wprowadzenie

Wykorzystanie modeli interakcji gen-środowisko dostarcza podejścia do naśladowania czynników ryzyka, które prawdopodobnie wpływają na idiopatyczną chorobę Parkinsona (PD) i daje możliwość dostrzeżenia mechanistycznych spostrzeżeń, które prawdopodobnie nie zostaną wyjaśnione przy użyciu samego systemu genetycznego lub toksycznego1,2. Tutaj ilustrujemy ten punkt i opisujemy zastosowanie mysiego modelu zwyrodnienia nigrostriatalnego 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP) w celu lepszego zrozumienia selektywności aktywności izoenzymu lipooksygenazy (LOX) na zapalenie nerwów i toksyczność4. Podczas gdy rola izoenzymów LOX została szeroko oceniona w zaburzeniach obwodowych5,6, a także w chorobach OUN, w tym udarze7 i chorobie Alzheimera8,9, rola rodziny izoenzymów w funkcji nigrostriatalnej i zwyrodnieniu związanym z chorobą Parkinsona nie jest dobrze poznana i wymaga badań. Neurotoksyna MPTP wykazuje preferencyjne zwyrodnienie szlaku nigrostriatal i rekapituluje wyczerpanie dopaminy w prążkowiu i utratę komórek dopaminergicznych nigral, które leżą u podstaw zaburzeń motorycznych u pacjentów z PD10. Chociaż model ten nie odtwarza pełnej kadry zachowań niemotorycznych i motorycznych PD oraz szczerej patologii ciał Lewy'ego α-synukleinowo-dodatnich, był przydatny do wyjaśnienia nowych celów mechanistycznych, które przyczyniają się do uszkodzenia nigrostriatal i do testów translacyjnych na wczesnym etapie, ponieważ jest to najlepiej scharakteryzowany nieinwazyjny model dostępny do niezawodnego wytwarzania śmierci komórek nikralnych, której towarzyszy utrata dopaminy w prążkowiu11-15. Szerokie zastosowanie myszy MPTP, z paradygmatami od ostrych, podostrych do przewlekłych16-18, pozwoliło na standaryzację dawkowania w celu uzyskania łagodnego do ciężkiego uszkodzenia nigrostriatale19,20 z aktywacją różnych mechanizmów toksyczności w zależności od schematu leczenia18,21,22. W związku z tym pozwala to na ukierunkowanie "okna uszkodzenia", które może skutkować wzmocnieniem lub zmniejszeniem uszkodzenia nigrostriatal w zależności od zastosowanego środka terapeutycznego lub modelu transgenicznego23-25.

Również niezbędne dla badań biologii translacyjnej i odkrywczej są techniki używane do oceny uszkodzeń oraz dowody dostarczane przez te metody. Dla mysiego modelu MPTP, ustalonymi wskaźnikami do oceny zmian są pomiar markerów tonu dopaminergicznego prążkowia, w tym dopaminy i jej metabolitów za pomocą HPLC, oraz analiza Western blot hydroksylazy tyrozyny (TH), enzymu ograniczającego szybkość syntezy dopaminy, oraz wskaźniki zdarzeń zwyrodnieniowych, takich jak aktywacja gleju przy użyciu analizy Western blot i immunohistochemii4. Chociaż są to klasyczne procedury neurochemiczne, biochemiczne i histologiczne, techniki te zapewniają krytyczne i powtarzalne odczyty zakresu uszkodzeń w obrębie nigrostriatalnej ścieżki dopaminergicznej, wskazują mechanizmy toksyczności i okazały się cennymi narzędziami w zrozumieniu zdarzeń zwyrodnieniowych w PD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Wszystkie procedury i metody opieki nad zwierzętami powinny być zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC). Opisane tutaj badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez IACUC SRI International.

1. Pozyskiwanie i utrzymywanie myszy z niedoborem LOX

  1. Kup myszy z niedoborem 5-LOX lub 12/15-LOX oraz odpowiednie grupy kontrolne dopasowane szczepem i płcią w wieku 7-8 tygodni i odczekaj kilka dni na aklimatyzację w placówce po przybyciu.
  2. Utrzymuj myszy w pomieszczeniach grupowych w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność i podawaj jedzenie i wodę pitną ad libitum.

2. Środki ostrożności MPTP, przechowywanie, przygotowanie, dekontaminacja i utylizacja

Uwaga: Wykazano, że zatrucie MPTP spowodowane dożylnym narażeniem u ludzi powoduje parkinsonizm10; MPTP jest wysoce lipofilowy i może łatwo przekroczyć barierę krew-mózg26. Należy podjąć środki ostrożności w celu zapewnienia bezpiecznego obchodzenia się z produktem, detoksykacji i usuwania. Jego metabolizm obejmuje wiele etapów, w tym konwersję do 1-metylo-4-fenylo-2,3-dihydropirydyny przez enzym monoaminooksydazę B (MAO-B)27. Inhibitory MAO-B mogą być stosowane w przypadku przypadkowego zatrucia człowieka.

  1. Upewnij się, że personel przeszedł odpowiednie szkolenie w zakresie bezpieczeństwa i obsługi przed rozpoczęciem korzystania z MPTP, zgodnie z zaleceniami Komitetu ds. Zdrowia i Bezpieczeństwa instytucji. Każda instytucja może ustanowić i wdrożyć własne standardowe procedury operacyjne dotyczące stosowania MPTP, w oparciu o zalecenia wyczerpująco przedstawione w literaturze17,22.
  2. Przed przygotowaniem należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym: jednorazowy fartuch laboratoryjny lub kombinezon na całe ciało, podwójne rękawice nitrylowe, maskę chirurgiczną, osłonę włosów, okulary ochronne i jednorazowe ochraniacze na buty. Podczas przygotowywania MPTP, paradygmatu iniekcji i 72 godziny po wstrzyknięciu w przypadku pracy ze zwierzętami i/lub ściółką należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
  3. Wykonaj obliczenia przed przygotowaniem. Należy przestrzegać wytycznych instytucjonalnych dotyczących objętości dawkowania; Podawanie 100-150 μl jest zwykle stosowane w przypadku myszy o wadze 25-30 g.
    1. Aby przygotować roztwór MPTP o stężeniu 3 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej, należy zastosować współczynnik korygujący (1,211 MPTP-HCl: 1,0 zasady wolnej od MPTP); stężenie MPTP-HCl w podłożu soli fizjologicznej wynosi 3,633 mg/ml.
    2. Przed przystąpieniem do obchodzenia się z neurotoksyną należy przygotować cały sprzęt, materiały eksploatacyjne i odczynniki potrzebne do przygotowania MPTP i ewentualnego odkażenia wycieku.
  4. Wyjmij fiolkę źródłową MPTP-HCl z odpowiedniego miejsca przechowywania.
    Uwaga: MPTP powinien być przechowywany w temperaturze RT w zamkniętej fiolce w pojemniku wtórnym i przechowywany w zamkniętej szafce, oznaczonej "MPTP".
    1. Przykryj obszar wokół łuski podkładkami lub ręcznikami papierowymi zwilżonymi 10% roztworem wybielacza, aby zmniejszyć ryzyko rozlanego proszku. Na wszelki wypadek trzymaj w pobliżu chusteczki i 10% roztwór wybielacza.
    2. Za pomocą wagi analitycznej umieszczonej w dygestorii odważyć 50 mg MPTP-HCl do szklanej fiolki z wtórnym zabezpieczeniem zawierającym 10% tkanki nasączonej wybielaczem. Oznaczyć szklaną fiolkę "MPTP" stężeniem i datą.
    3. Zamknij fiolkę źródłową i przetrzyj zewnętrzną stronę 10% wybielaczem.
  5. Powoli dodawać 13,763 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej do fiolki i całkowicie zamknąć w celu wymieszania. (Roztwór to 3,633 mg / ml MPTP-HCl.)
    1. W kapturze ostrożnie wysterylizuj roztwór MPTP przez filtrację za pomocą filtra 0,22 μm do oznakowanej fiolki do wstrzykiwań w wtórnym pojemniku z 10% tkanką nasączoną wybielaczem. Wyczyść rozlane płyny chusteczką nasączoną wybielaczem.
    2. Ostrożnie wyrzuć ostre przedmioty i fiolkę do odpowiednio oznakowanego pojemnika stanowiącego zagrożenie biologiczne. Roztwór MPTP należy przechowywać w fiolce w pojemniku wtórnym z tkanką nasączoną wybielaczem do transportu do sali zabiegowej dla zwierząt.
      Uwaga: nie należy autoklawować roztworu MPTP do sterylizacji, ponieważ jego odparowanie stanowi zagrożenie wdychania.
  6. Zwróć fiolkę źródłową MPTP do dodatkowego pojemnika i umieść w miejscu przechowywania. Odkażaj szpatułkę, wagę analityczną i powierzchnię kaptura przez 10 minut przy użyciu 10% wybielacza.

3. Administracja MPTP

  1. Przygotuj jednorazowe klatki ze standardowymi perforowanymi pokrywami z mikroizolatorem zawierającymi poliestrowe wkładki z filtrem oznaczone "MPTP" (minus druciany grill spożywczy), jednorazowe wkładki do klatek, wstępnie zwilżone granulki żywności i hydrożel jako źródło wody. Zważyć wszystkie zwierzęta i zanotować objętość 3 mg/ml MPTP w roztworze soli fizjologicznej wymaganą do wstrzyknięcia 15 mg/kg.
    Uwaga: Metabolity MPTP są wykrywalne w wydalinach przez 3 dni po wstrzyknięciu28,29; jednak myszy wydzielają n-tlenek MPTP, nietoksyczną pochodną, która nie przenika przez błony ze względu na swoją hydrofilowość30.
    1. Nosząc wszystkie środki ochrony osobistej wymienione powyżej i trzymając myszy nad jednorazową podkładką absorpcyjną, wstrzyknąć nośnik soli fizjologicznej lub roztwór MPTP w dawce 15 mg/kg do jamy dootrzewnowej (i.p.), codziennie przez 4 dni za pomocą jednorazowej strzykawki tuberkulinowej w rozmiarze 26G.
    2. Nie zamykać strzykawki po użyciu; wyrzucić do dedykowanego i oznakowanego pojemnika na ostre przedmioty MPTP. Utrzymuj 10% wybielacza i chusteczki w pobliżu, aby usunąć wszelkie przypadkowe krople.
  2. Umieść zwierzęta, którym wstrzyknięto MPTP, w jednorazowych klatkach, do 5 myszy w klatce i trzymaj je na otwartych stojakach. Nie używaj wentylowanych szaf.
    1. Tabliczki z tabliczkami MPTP należy umieścić na stojaku zawierającym myszy i drzwiach pomieszczenia do 72 godzin po ostatnim wstrzyknięciu.
      Uwaga: upewnij się, że temperatura w pomieszczeniu mieszkalnym wynosi od 22,2 do 24,4oC, ponieważ myszy doświadczają przejściowej hipotermii do 12 godzin po zatruciu MPTP. Rozdział 31
      2. Po
    2. każdym użyciu należy odkazić powierzchnię roboczą wybielaczem (patrz krok 2.8), usunąć resztki roztworu MPTP przez dodanie objętości odpowiadającej 10% wybielaczowi i wyrzucić zawartość jako niebezpieczne biologicznie odpady płynne.
    3. Wyrzuć wszystkie zużyte środki ochrony osobistej do specjalnego pojemnika na odpady. W razie potrzeby spryskaj 10% wybielaczem przed wyrzuceniem.
  3. Regularnie sprawdzaj zwierzęta i codziennie odświeżaj źródło pożywienia i wody podczas paradygmatu iniekcji i 72 godziny po ostatnim wstrzyknięciu. Uwaga: chociaż nie przewiduje się zanieczyszczenia w obszarze bezpośrednio otaczającym zewnętrzną część klatki, obszar ten jest traktowany roztworem wybielacza jako środek ostrożności (zgodnie z opisem w kroku 2.8). W tym okresie należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się ze wszystkimi myszami i sprzętem.
    1. Trzy dni po ostatnim wstrzyknięciu należy wyrzucić wszystkie klatki i wkładki do odpowiednio oznakowanej torby chroniącej przed zagrożeniem biologicznym. Wznowić stosowanie zwykłych środków ochrony indywidualnej i normalnych warunków trzymania zwierząt; Usuń tabliczki na drzwiach i półkach.

4. Pobieranie tkanek

  1. Eutanazja zwierząt przez zwichnięcie szyjki macicy 7 dni po ostatnim wstrzyknięciu MPTP. Natychmiast przeprowadź sekcję mózgu na lodzie za pomocą wstępnie schłodzonej formy mózgowej z 1-milimetrowymi szczelinami w płaszczyźnie koronalnej.
  2. Wypreparuj prążkowie z plastra przodomózgowia o grubości 2 mm na poziomie spoidła przedniego.
    1. Usuń otaczające obszary korowe i podkorowe za pomocą skalpela. Zamroź tkankę prążkowia z każdej półkuli w oddzielnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml do analizy neurochemicznej lub biochemicznej.
  3. Zablokuj śródmózgowie/tyłomózgowie w płaszczyźnie czołowej na poziomie przedniego podwzgórza i zanurz tkankę w 4% wodnym roztworze formaldehydu.

5. Przetwarzanie tkanek

  1. Proces biochemiczny
    1. Homogenizować tkankę prążkowia z jednej półkuli za pomocą ultradźwiękowego rozdrabniacza komórek w 200-μl buforze do lizy Tris-EDTA (25mM zasada Tris, 1mM EDTA, 1:100 proteaza i koktajle inhibitorów fosfatazy) przez 10 impulsów przy 10-12 Hz i odwirowywać przez 10 minut w temperaturze 4oC przy 1000xg.
    2. Ostrożnie odessać supernatant i rozpuść osad w 150 μl buforu do lizy. Frakcje są używane do analizy biochemicznej metodą SDS-PAGE i Western blotting.
      Uwaga: w ciągu 1 godziny od przygotowania należy zużyć bufor zawierający inhibitory proteazy i fosfatazy ze względu na niestabilność w roztworach wodnych.
  2. Proces dla neurochemii
    1. Do HPLC należy wykorzystać prążkowie wypreparowane z innej półkuli z każdej próbki przechowywanej w temperaturze -80 °C. Rozmrozić tkanki prążkowia w probówkach do mikrofuge na lodzie, dodać 500 μl 0,3N kwasu nadchlorowego (PCA) i homogenizować za pomocą sonicatora.
      Uwaga: Aby przygotować 100 ml 0,3 N PCA, odmierz 90 ml ddH2O, dodaj do 100 ml cylindra z podziałką, dodaj 2,58 ml 70% PCA i doprowadź do oznaczenia 100 ml. Ten bufor próbki może być przechowywany w temperaturze 4°C przez okres do jednego miesiąca.
    2. Sonikować tkankę prążkowia w 500 μl lodowatego 0,3 N PCA, przez 10 impulsów przy 10-12 Hz i umieścić na lodzie. Aby zapewnić jednorodność, należy poddać próbki sonikacji po raz drugi przez 10 sekund, a następnie odwirować przez 12 minut w temperaturze 4oC przy 16 100xg.
    3. Natychmiast zdekantować supernatant do 1,5 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80°C. Wysuszyć frakcję granulek na powietrzu w kapturze.
    4. Utrzymać supernatant w temperaturze -80 °C do momentu użycia do pomiaru dopaminy i jej metabolitów, kwasu 3,4-dihydroksyfenylooctowego (DOPAC) i kwasu homowanilooctowego (HVA) metodą HPLC z detekcją elektrochemiczną.
    5. Po wyschnięciu rozpuść frakcję osadu w 0,5 N NaOH (500 μL) i krótko sonigatelizować. Odtworzoną frakcję osadu należy przechowywać w temperaturze 4°C do czasu użycia do oznaczenia białka całkowitego metodą Lowry'ego.
  3. Proces immunohistochemiczny
    1. Zanurz bloki środkowej i tylnej części mózgu przez noc w 4% wodnym roztworze formaldehydu i krioprotektor w stopniowanych roztworach sacharozy (10% w buforowanej fosforaną soli fizjologicznej (0,01 M PBS; 0,138 M NaCl, 0,0027 M KCl i ddH2O, pH 7,4) przez 24 godziny, a następnie 30% w PBS do momentu, aż tkanka opadnie) w temperaturze 4 °C. Krótko osusz bloki kriochronione w celu usunięcia nadmiaru roztworu sacharozy, zamrażać na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.
    2. Mikrotomowe sekcje bloków mózgowych zawierających środkową i tylną część mózgu w kriostacie.
      1. Usunąć tkanki z temperatury -80°C, równoważyć w temperaturze -16°C przez 1 godzinę w kriostacie i umieścić w pożywce do zatapiania tkanek.
      2. Zbierz skrawki koronalne o grubości 40 μm do roztworu krioprotektantu (0,01 M PBS z 30% sacharozą, 30% glikolem etylenowo, pH 7,4) w temperaturze -16°C. Zbierz tkankę szeregowo do 6 probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w odstępach 240 μm i przechowuj w temperaturze -20 °C.

6. Immunoblotting

  1. Oznaczyć stężenie białka we frakcji supernatantu prążkowia (przygotowanej zgodnie z opisem w sekcji 5.1) za pomocą testu BCA.
  2. Obliczyć rozcieńczenie wymagane dla każdej próbki, aby uzyskać 10 μg na studzienkę dostarczoną w 20 μl objętości.
  3. Rozcieńczyć białko sklarowanego osadu 4X buforem Laemmli i buforem homogenizacyjnym, aby uzyskać 10 μg białka w roztworze buforowym 1X Laemmli. Przykładowe obliczenia:
    1. Określ końcowe stężenie białka i wymaganą objętość. W takim przypadku wymagane jest 10 μg w 20 μl (0,5 mg/ml).
    2. Określić końcową objętość potrzebnego roztworu białkowego. Chociaż do załadunku potrzebne jest 20 μl, należy przygotować dodatkową objętość (30 μl).
    3. Ponieważ znana jest końcowa objętość i stężenie, a stężenie frakcji supernatantu białkowego jest znane (określone za pomocą testu BCA), należy obliczyć wymaganą objętość supernatantu białkowego, korzystając z równania:
      Vsupernatant = (Vkońcowy x Ckońcowy)/C supernatant
      Tak więc, dla stężenia białka sklarowanego nad osadem wynoszącego 1,5 mg/ml,
      Vsupernatant = (30 μl x 0,5 mg/ml)/1,5 mg/ml
      Supernatant V = 10 μl
    4. Obliczyć ilość 4X buforu Laemmli potrzebną do uzyskania 1x stężenia w 30 μl objętości (30 μl / 4 = 7,5 μl). Uwaga: 4X bufor Laemmli musi być rozcieńczony do 1X mocy w przygotowaniu próbki.
    5. Obliczyć ilość buforu homogenizacyjnego potrzebną do doprowadzenia objętości do 30 μl (i uzyskania pożądanego końcowego stężenia białka 0,5 mg/ml):
    6. Przygotować próbkę przez wirowanie, a następnie pipetowanie 10 μl supernatantu białkowego do 12,5 μl buforu homogenizacyjnego. Dodać 7,5 μl 4X buforu Laemmli, aby uzyskać 30 μl roztworu roboczego próbki o stężeniu 0,5 mg/ml.
  4. Przygotować wszystkie próbki zgodnie z opisaną procedurą, odwirować i gotować przez 5 minut
    Uwaga: Użyj zakręcanych probówek do mikrowirówek, aby zapobiec wyciekom i otwieraniu pod wpływem ciśnienia podczas gotowania.
  5. Po 5 minutach natychmiast ułóż na lodzie. Załadować 20 μl roztworu roboczego próbki do dołka żelowego (10 μg białka). Oddziel próbki białka za pomocą SDS-PAGE na 12% żelu tris-glicyny.
    1. Użyj wstępnie wybarwionej drabinki białkowej, aby potwierdzić masę cząsteczkową. Działający bufor to 25 mM zasady Tris, 192 mM glicyny, 0,1% SDS i ddH2O, pH 8,3.
    2. Oddzielić białka za pomocą elektroforezy: uruchomić pod napięciem 80 V w celu oczyszczenia studzienek (10 min) i 125 V (około 1 godziny; do całkowitego oddzielenia drabinki białkowej) w celu rozdzielenia białek.
  6. Przeprowadzić transfer białka do nitrocelulozy za pomocą membrany nitrocelulozowej 0,2 μm w buforze transferowym Tris-glicyna (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,04% SDS, 20% metanolu iddH2O, pH 8,3) przez noc przez 40 V w 4°C.
  7. Przemyć bloksy nitrocelulozowe w 1x soli fizjologicznej Tris (TS; 25mM Tris, 0,9% NaCl w ddH2O, pH 7,4) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować w Pąsku S przez 5 minut, a następnie płukać w ddH2O, aby zapewnić przybliżoną weryfikację równoważnego obciążenia białkami. Zeskanuj obraz, aby zachować rekord dla notebooka i usunąć plamę za pomocą PBS.
    Uwaga: Alternatywnie, przemyć blot w Milli-Q lub ddH2O zawierającym HCl (0,2%) przez około 5 minut. Skanuj w poszukiwaniu rekordu. Usunąć barwnik Ponceau S z błony przez kolejny etap inkubacji (tj. umieścić w buforze blokującym).
  8. Blokować bloty w 5% beztłuszczowym mleku w proszku w TS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i inkubować 24 godziny w temperaturze 4ºC z króliczą hydroksylazą antytyrozynową (1:1000), anty-β-aktyną (1:200); anty-GFAP (1:1000) w 5% mlekiem-TS.
  9. Przemyć bloty 3 x 5 min w TS z 0,05% Tween-20 i 1 x 5 min w TS, a następnie inkubować w przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z HRP (1:5000 w TS zawierającym 5% mleka), dopasowanym do gatunku pierwszorzędowego, przez 2 godziny w RT.
  10. Przygotować podłoże chemiluminescencyjne z równych objętości roztworów luminolu i nadtlenku i stosować przez 1-3 min. W ciemni umieść kleksa w plastikowym rękawie do naświetlania filmu i naświetl na kliszy; Film jest następnie wywoływany za pomocą automatycznego procesora.
  11. Strip blot z dostępnym w handlu buforem odpędzającym w temperaturze 37°C przez 30 min, przemyć 3x 10 min w TS z 0,05% Tween-20 i 1x 10 min w TS, a następnie ponownie zbadać w celu kontroli obciążenia lub innego interesującego białka.
  12. Określ ilościowo sygnały za pomocą oprogramowania Image J do pomiarów gęstości optycznej i znormalizuj do wewnętrznej kontroli obciążenia β–aktyny.

7. Neurochemia

  1. Tkankę do analizy przygotowuje się w sposób opisany powyżej w sekcji 5.2. Proszę zapoznać się z Tabelą 1, aby zapoznać się z przepisem na fazę ruchomą.
    Uwaga: Wszystkie odczynniki muszą mieć czystość ≥99,0% i być klasy HPLC. Zapewnij integralność bufora za pomocą czystych, dedykowanych naczyń szklanych i mieszadeł. Ruchomy bufor fazowy należy zużyć w ciągu siedmiu dni od przygotowania.
    1. Zważyć diwodorofosforan i kwas cytrynowy, dodać 1 l ddH2O i wymieszać w 2-litrowym cylindrze miarowym. Przefiltruj roztwór przez membranę GSTF 0,22 μm.
      Uwaga: Maksymalizuje to ekstrakcję zanieczyszczeń w fosforanie i kwasie cytrynowym, co pomaga zminimalizować prądy tła.
    2. Dodaj OBS, a następnie roztwór acetonitrylu i EDTA. Dodać ddH2O klasy HPLC do około 1900 ml przed dostosowaniem pH do 3,0 kwasem fosforowym.
    3. Dodać stopień HPLC ddH2O do oznaczenia 2 L, a następnie przelać do kolby 2 L. Dodaj dedykowane mieszadło i odgazuj fazę ruchomą, mieszając ją w próżni przez > 10 minut.
  2. Przygotuj wzorce dla dopaminy, a DOPAC i HVA dla krzywych standardowych. Roztwory podstawowe wzorców przygotowuje się w stężeniu 1 mg/ml w 0,3 N PCA.
    1. Odważyć 12,4 mg dopaminy-HCl i dodać 10,0 ml 0,3 N PCA, aby uzyskać 1 mg / ml dopaminy.
    2. Odważyć 10,0 mg DOPAC i dodać 10,0 ml 0,3 N PCA, aby uzyskać 1 mg/ml DOPAC.
    3. Odważyć 10,0 mg HVA i dodać 10,0 ml 0,3 N PCA, aby uzyskać 1 mg/ml HVA.
  3. Przygotować robocze roztwory wzorcowe z roztworów podstawowych. Wzorce pięciopunktowe służą do generowania krzywej stężenia.
    1. Do pomiaru dopaminy w prążkowiu należy przygotować wzorcowe stężenia 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml i 200 ng/ml.
    2. W przypadku DOPAC prążkowia należy przygotować standardowe stężenia 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml i 40 ng/ml.
    3. Dla HVA prążkowia należy przygotować wzorcowe stężenia 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml i 80 ng/ml.
    4. Wygeneruj pięciopunktowe wzorce: rozcieńczyć 1 mg/ml roztworu podstawowego dopaminy do 5 μg/ml za pomocą 0,3N PCA. Rozcieńczyć 1 mg/ml roztworu podstawowego DOPAC do 1 μg/ml używając 0,3N PCA i rozcieńczyć 1 mg/ml roztworu podstawowego HVA do 2 μg/ml używając 0,3N PCA.
    5. Przenieść 1 ml 5 μg/ml dopaminy, 1 ml 1 μg/ml DOPAC i 1 ml 2 μg/ml HVA do kolby miarowej o pojemności 25 ml i doprowadzić objętość do oznaczenia 25 ml za pomocą 0,3 N PCA.
      Uwaga: Mieszane wzorce w kolbie miarowej zawierają najwyższe stężenie spośród wzorców pięciopunktowych: 200 ng/ml dopaminy, 40 ng/ml DOPAC i 80 ng/ml HVA.
    6. Przenieść 1 ml zmieszanych wzorców do czystych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Wykonaj czterokrotne rozcieńczenie szeregowe w stosunku 1:1, aby wygenerować kolejne czteropunktowe wzorce.
      1. Na przykład, do 250 μl mieszanych wzorców, dodać 250 μl buforu próbki i dokładnie odwirować, aby uzyskać mieszane wzorce przy 50% pierwotnych stężeń; powtarzać proces, aż do osiągnięcia pożądanych rozcieńczeń.
  4. Przygotować system HPLC (pompa, automatyczny podajnik próbek, kolumna z odwróconymi fazami (C18, 150×3,2 mm, 3 μm)). Przedmuchnąć pompę świeżą fazą ruchomą, aby zastąpić wszystkie poprzednie roztwory w systemie HPLC i uwięzione pęcherzyki powietrza świeżą fazą ruchomą. Schłodzić automatyczny podajnik próbek do temperatury 4°C. Podgrzej kolumnę do 35°C, co zmniejszy całkowite ciśnienie.
    1. Ustaw napięcie odpowiednio na -150 mV i 220 mV dla pierwszej i drugiej elektrody detektora elektrochemicznego. Równoważyć system przez co najmniej 2 godziny, a najlepiej przez noc, fazą ruchomą przy natężeniu przepływu 0,2 ml/min.
      Uwaga: Podczas równoważenia ogniwa powinny być włączone, a odczyt linii bazowej monitorowany. Stabilny odczyt wskazuje, że system jest gotowy do użycia. Przez dwie godziny fazy równowagi pozwól, aby faza ruchoma trafiła do pojemnika na odpady zamiast poddawać ją recyrkulacji. Po tym okresie faza ruchoma może być poddana recyklingowi przez noc w celu zrównoważenia.
    2. Po zakończeniu równoważenia dostosować natężenie przepływu fazy ruchomej do 0,6 ml/min. Wstrzyknąć po 20 μl każdego z pięciopunktowych wzorców.
  5. Rozmrozić próbki prążkowia na lodzie i wstrzyknąć 2 x 20 μl każdej próbki do systemu HPLC. Stosuj wzorce na początku i losowo w każdym zestawie próbek prążkowia.
  6. Użyj oprogramowania do analizy obszaru pod pikami dopaminy, DOPAC i HVA wytwarzanymi przez wzorce i próbki. Zidentyfikuj anality na podstawie czasu retencji i zmierz, porównując obszar pod pikiem z obszarem krzywej 5-punktowej dla odpowiedniego wzorca.
  7. Przygotować frakcję osadu zgodnie z opisem w sekcji 5.2.3. Wykonaj test białka Lowry'ego na osadzie prążkowia. Uwaga: Ten test zmierzy ilość białka obecnego w próbkach prążkowia w mg / ml; Informacje te służą do określenia stężenia gazu/mg analitu.

8. Immunohistochemia

  1. Podwójna immunofluorescencja GFAP/TH
    1. Wyjąć probówki z podciętym śródmózgowiem z zamrażarki o temperaturze -20°C i przynieść, do RT. Usunąć skrawki tkanek zawierające istotę czarną z roztworu kriokonserwantu umieszczonego na tacy zawierającej PBS.
    2. Umieść skrawki tkanek we wkładkach polistyrenowych z dnem z siatki poliestrowej w celu uzyskania swobodnej immunochemii. Prać 3 x 5 min w PBS.
    3. Przenieść skrawki na 96-dołkową płytkę ze 180 μl roztworu blokowego (5% normalnej surowicy osła, 1% PVP, 1% BSA i 0,3% Triton X-100 w PBS) w każdym dołku. Inkubacja 40 min w RT.
      Uwaga: Wszystkie etapy mycia i inkubacji są wykonywane z lekkim mieszaniem na wytrząsarce.
    4. Przenieść skrawki do studzienek zawierających pierwszorzędowy roztwór przeciwciała (180 μl na studzienkę). Inkubować w pierwotnym koktajlu przeciwciał, króliczym anty-GFAP (1:1000) i owczym anty-TH (1:400) rozcieńczonym w PBS z 1% BSA i 0,3% TX-100, przez 24 godziny w temperaturze 4°C. IgG z gatunku pierwotnego służy jako negatywna kontrola immunostainingu.
    5. Inkubować w wtórnym koktajlu przeciwciał (1:200 anty-królik 568 i 1:200 FITC anty-owce osła w PBS z 0,1% TX-100). Użyć folii do ochrony roztworu przed światłem podczas przygotowywania i inkubacji; inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
      1. W przypadku kontroli ujemnej należy inkubować skrawki IgG z gatunków pierwotnych rozcieńczone do tego samego stężenia, jakie zastosowano dla przeciwciał pierwszorzędowych.
      2. Myć 2 x PBS i 1 x TS przez 5 minut każdy w RT. Zamontuj skrawki tkanek na szkiełkach podstawowych w podłożu montażowym za pomocą barwnika Hoechst i szkiełka nakrywkowego.
    6. Inkubować w wtórnym koktajlu przeciwciał (1:200 anty-królik 568 i 1:200 FITC anty-owce osła w PBS z 0,1% TX-100). Użyć folii do ochrony roztworu przed światłem podczas przygotowywania i inkubacji; inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    7. Myć 2 x PBS i 1 x TS przez 5 minut każdy w RT. Zamontuj skrawki tkanek na szkiełkach podstawowych w podłożu montażowym za pomocą barwnika Hoechst i szkiełka nakrywkowego.
    8. Szkiełka należy chronić przed światłem i utlenianiem do czasu obrazowania, przechowując je w pudełku z szkiełkami w temperaturze 4°C.
    9. Najpierw przeanalizuj kontrolę ujemną, aby określić poziom fluorescencji tła, a następnie oceń pod kątem dodatniej immunoreaktywności za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  2. Immunohistochemia Iba1 z wytrącaniem chromagenu
    1. Wyjąć probówki z podciętym śródmózgowiem z zamrażarki o temperaturze -20°C i przynieść, do RT. Usunąć skrawki tkanek zawierające istotę czarną z roztworu kriokonserwantu umieszczonego na tacy zawierającej PBS.
    2. Umieść skrawki tkanek we wkładkach polistyrenowych w celu uzyskania swobodnej immunochemii. Umyć skrawki 3 x 5 minut w PBS i umieścić je bezpośrednio w 12-dołkowej płytce zawierającej wstępnie podgrzany 10 mM monohydrat kwasu cytrynowego o pH 9,0, 80°C przez 30 minut, w celu pobrania epitopu.
    3. Schłodzić płytę 20 min w RT. Wróć sekcje do wkładów i umyj 3 x 5 min w PBS.
    4. Przenieść skrawki na 96-dołkową płytkę zawierającą 180 μl roztworu blokującego (10% normalnej surowicy koziej, 1% BSA w PBS) na studzienkę i inkubować 40 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Przenieść skrawki do studzienek zawierających 180 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego (1:1000 w 1% BSA-PBS). Inkubować przez noc w temperaturze 4°C.
    6. Przenoszenie przekrojów do wkładek. Przemyć 3 x 5 min PBS i zastosować biotynylowane przeciwciało drugorzędowe (1:200 w 1,5% normalnej surowicy-PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    7. Przygotuj roztwór ABC 30 minut przed użyciem. Przemyć 3 x 5 min PBS i przenieść do roztworu ABC na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    8. Przygotuj roztwór DAB w kapturze. Myć 2x 5 min w PBS i 1x 5 min w TS, a następnie inkubować sekcje w DAB.
      1. Wywoływanie przez 3-4 min. Kontrola ujemna powinna pozostać jasna.
        Uwaga: wykonaj ten krok w dygestorium, ponieważ DAB jest znanym czynnikiem rakotwórczym. Roztwór 0,2M nadmanganianu potasu w ddH2O do odkażania należy przechowywać w pobliżu na wypadek przypadkowych wycieków.
    9. Krótko wypłukać sekcje w ddH2O, a następnie w TS 3 x 5 min. Zamontuj sekcje na szkiełkach plus i wysusz na powietrzu przez noc w dygestorium.
    10. Odkazić odpady DAB o równej objętości 0,2 M nadmanganianu potasu w ddH2O, odwirować i inkubować w dygestorium przez noc przed umieszczeniem w odpowiednio oznakowanym pojemniku na odpady DAB w dygestorium.
      Uwaga: Roztwór wybielacza nie eliminuje mutagennych właściwości DAB.
      1. Odkazić przedmioty przeznaczone do ponownego użycia (np. wkłady styropianowe) i umyć detergentem.
    11. Lekko odwodnić/zabarwić fioletem krezylowym (CV). Wszystkie etapy odwadniania/mycia trwają 3 min: etanol 70%, 95%, 100%, 95%, ddH2O, CV (30 sekund), ddH20 x 2, 95% etanol + lodowaty kwas octowy (0,1%) x 2, 100% etanol i ksylen.
    12. Szkiełko nakrywkowe w podłożu montażowym distyreno-toluenowo-ksylenowym i schnąć w dygestorium.
    13. Obserwuj dodatnią immunoreaktywność pod mikroskopem świetlnym. IgG z gatunku pierwotnego służy jako negatywna kontrola immunobarwiąca.

9. Statystyki

  1. Ocena różnic między średnimi za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) w celu porównania różnic między genotypem oraz za pomocą dwukierunkowej ANOVA w celu porównania różnic między genotypem a leczeniem toksycznymi. Wykorzystaj analizę post hoc HSD Tukeya, gdy różnice są obserwowane za pomocą testów ANOVA (p≤0,05).
    Uwaga: eksperymenty (z n = 6-9 myszy/grupę) przeprowadza się co najmniej dwa razy, aby zapewnić odtwarzalność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ten model ekspozycji na toksynę może wywołać istotny i wykrywalny 20% spadek poziomu dopaminy w prążkowiu u zwierząt wstrzykniętych MPTP w porównaniu do zwierząt wstrzykniętych solą fizjologiczną. Należy zauważyć, że różne partie MPTP mogą powodować nieco większe lub mniejsze uszkodzenia; dlatego w celu uzyskania lepszej precyzji zaleca się przeprowadzenie wstępnego eksperymentu na myszach typu dzikiego przed zastosowaniem nowej partii neurotoksyny u myszy transgenicznych. Stosowanie łagodnych do umiarkowanych uszkodzeń ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Projekt tego badania interakcji gen-środowisko pozwolił nam uzyskać nowe informacje na temat podwójnej natury izoenzymu 5-LOX w szlaku nigrostriatalnym. Wykonując HPLC w celu pomiaru monoamin prążkowia po leczeniu solą fizjologiczną lub MPTP u transgeników pozbawionych izoenzymu 5-LOX i ich rodzeństwa z miotu typu dzikiego, byliśmy w stanie zauważyć, że jego niedobór wydaje się być ochronny w warunkach toksycznych (Figura 1), ale w normalnych warunkach brak enzymu obniża poziom dopaminy w prążkowiu i moż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca ta została sfinansowana przez National Institutes of Health NIGMS 056062.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorowodorek 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetra-hydropirydyny (MPTP-HCL)Sigma-AldrichM0896do modelowania PD
4% roztwór formaldehydu (paraformaldehydu), buforowany fosforanem (PFA)Amerykański BUP0157 naukowy MasterTech doutrwalania zanurzeniowego
Odczynnik ACS kwasu nadchlorowego, 70% (PCA)Sigma-Aldrich244252do ekstrakcji
kwasem HPLCTris BaseSigma-AldrichT1503do homogenizacji tkanek
Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego dwuwodna (EDTA)Sigma-AldrichE1644do homogenizacji tkanek
Koktajl inhibitorów proteazySigma-AldrichP8340do homogenizacji tkanek
Koktajl inhibitorów fosfatazySigma-AldrichP5726do homogenizacji tkanek
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-AldrichS5881do testu białka Lowry'ego
Sacharoza, biologia molekularna, ≥ 99,5% (GC) Sigma-AldrichS0389do krioprotekcji
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, proszek, pH 7,4 (dla 0,01 M PBS)Sigma-AldrichP3813do
zestawu do oznaczania białek IHC BCAPierce/Thermo23225do oznaczania białek
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1,0 mm, 12-dołkowyInvitrogen/Life TechnologiesEC60052BOXdo próbki SDS-PAGE
NuPAGE LDS Bufor (4x)Invitrogen/Life TechnologiesNP0007dla SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard Invitrogen/Life TechnologiesLC5800drabinka białkowa
GlicynaSigma-AldrichG7126dla SDS-PAGE
Dodecylosiarczan sodu, elektroforeza, 98,5% (SDS)Sigma-AldrichL3771dla SDS-PAGE
Alkohol metylowy, bezwodny, odczynnik American MasterTech ScientificSPM1057Cmetanol do transferu
Chlorek sodu (NaCl), odczynnik ACSSigma-AldrichS9888sól fizjologiczna i
Beztłuszczowe mleko w proszku w proszkuGoździknie dotyczyimmunoblottingu
Roztwór Pąsek w 5% kwasie octowym Sigma-AldrichP7170do immunoblottingu
Hydroksylaza antytyrozynowa (TH), poliklonalnyChemicon/MilliporeAB1542do immunofluorescencji 
Hydroksylaza anty-tyrozynowa (TH), królicza poliklonalnaPel-Freez BiologicalsP40101-0do immunoblottingu
Anti-β Aktyna, królikSigma-AldrichA2066do immunoblottingu
Anti-Gleial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), królik poliklonalnyChemicon/MilliporeAB5804do immunofluorescencji
Anti-Gleal fibrillary acidic protein (GFAP), mysz monoklonalnaCovance Inc.SMI-22Rdo immunoblottingu
Tween-20Sigma-AldrichP1379do immunoblottingu
Kozia anty-królicza IgG (H+L), peroksydaza sprzężona Fisher Scientific31462dla immunofluorescencji
kozy anty-owczej, peroksydaza sprzężonaPierce/Thermo31480dla immunofluorescencji
kozła anty-mysia, peroksydaza sprzężonaPierce/Thermo31430dla immunofluorescencji
SuperSignal West Pico Chemiluminescencyjne podłożePierce/Thermo34078do immunoblottingu
CL-XPoliwa 7 cali x 9,5 cala Pierce/Thermo34089do immunoblottingu
Restore Western Blot Stripping Buffer Pierce/Thermo21059do immunoblottingu
Kwas cytrynowy jednowodny, odczynnik ACS, ≥ 99.0% Sigma-AldrichC1909dla IHC
Normal Donkey SerumMilliporeS30-100MLdla IHC
Polyvinylopirolidon (PVP)Sigma-AldrichP5288dla
albuminy surowicy bydlęcej IHC (BSA), liofilizowanySigma-AldrichA3294dla IHC
Triton X-100Fisher ScientificBP151-01dla IHC
Ośli anty-królicze IgG, Alexa Fluor 568-labeled Invitrogen/Life TechnologiesA10042dla IHC
Donkey IgG przeciwko owcom (H+L), FITC Jackson ImmunoResearch713-095-147dla IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium z DAPIVector LaboratoriesH-1500dla IHC
Normal Goat SerumMilliporeS26-100MLdo zestawu IHC
VECTASTAIN ABC (Rabbit IgG)  Vector LaboratoriesPK-4001dla IHC; 10 &mikro; l każdy z roztworów A i B na 1 ml PBS (zgodnie z instrukcją)
Zestaw substratów peroksydazy DAB, 3,3'-diaminobenzydynaVector LaboratoriesSK-4100dla IHC; na 5 ml zimnego ddH2O, dodać 2 krople buforowego roztworu podstawowego, 2 krople DAB i 1 kroplę H2O2 (H2 O2 dodaje się bezpośrednio przed użyciem)
Nadtlenek wodoru, 30%216763 Sigma-Aldrichdo etapu hartowania w IHC
Rabbit anty-Iba1Biocare MedicalsCP290Ado
roztworu fioletu krezylowego IHC, regularna moc FD NeurotechnologiesPS102-01barwnik przeciwbarwny do Iba1 IHC
95% etanolu, odczynnik alkoholowySigma-AldrichR8382odwadnianie do
IHC 100% etanol absolutnyMallinckrodt7019-10odwadnianie dla IHC
Kwas octowySigma-AldrichA6283odbarwianie dla
IHC KsylenSigma-Aldrich534056środek czyszczący do mocowania IHC
DPXSigma-Aldrich06522medium montażowe do DAB IHC
O.C.T. Compound - Medium do zatapiania sekcji mrożonych Amerykański MasterTech ScientificEMOCTCSembeddium medium do cięcia kriostatu
Nadmanganian potasuSigma-Aldrich223468do odkażania roztworu DAB
Chlorowodorek dopaminySigma-AldrichH8502do HPLC
Kwas 3,4-dihydroksyfenylooctowy (DOPAC)850217 Sigma-Aldrichdo HPLC
Kwas homowanilinowy (HVA)Sigma-AldrichH1252do HPLC
Kwas nadchlorowy (PCA) - 70%Sigma-Aldrich244252do HPLC
Monohydrat diwodorofosforanu soduSigma-Aldrich71504do HPLC
Monohydrat kwasu cytrynowegoSigma-AldrichC1909do HPLC
Sól sodowa kwasu 1-oktanosulfonowego (OSA)Sigma-AldrichO8380do HPLC
EDTASigma-AldrichE1644dla HPLC
AcetonitrylEMDAX0145-1do HPLC
Destylowana woda dejonizowana klasy HPLC (ddH2O)Milipordo HPLC
0,22 i mikro; m Membrana GSTFMilliporedo filtracji
Corning NetwellsSigma-AldrichCLS3477wkład polistyrenowy z dnem z siatki poliestrowej, do IHC
Ultradźwiękowy rozbijacz komórek (Soniprep 150)MSEMSE.41371.274
MikrowirówkaEppendorf5414R
ESA MD-150 kolumna z odwróconymi fazami Pompa ESA
HPLC (Ultimate 3000)DionexISO-3100BM
HPLC (Ultimate 3000)DionexWPS-3000TSL
Detektor elektrochemicznyESACoulochem III
Komórka ochronna5020Komórka analityczna ESA
5011A
Oprogramowanie ChromeleonDionex
Eclipse E400NikonE400mikroskop świetlny/fluorescencyjny
Jednorazowa klatka dla myszyAncareN10HT
Mikrofiltr górnyAncareN10MBT
5-LOX- myszy z niedoboremLaboratorium Jacksona004155
12/15-LOX Myszy z niedoboremLaboratory002778
do Automatyczny podajnik próbek ESA Jackson

Bibliografia

  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
  3. Heikkila, R. E., Hess, A., Duvoisin, R. C. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine in mice. Science. 224, 1451-1453 (1984).
  4. Chou, V. P., Holman, T. R., Manning-Bog, A. B. Differential contribution of lipoxygenase isozymes to nigrostriatal vulnerability. Neuroscience. 228, 73-82 (2013).
  5. Deschamps, J. D., Kenyon, V. A., Holman, T. R. Baicalein is a potent in vitro inhibitor against both reticulocyte 15-human and platelet 12-human lipoxygenases. Bioorg. Med.Chem. 14, 4295-4301 (2006).
  6. Weaver, J. R., et al. Integration of pro-inflammatory cytokines, 12-lipoxygenase and NOX-1 in pancreatic islet beta cell dysfunction. Mol. Cell Endocrinol. 358, 88-95 (2012).
  7. Yigitkanli, K., et al. Inhibition of 12/15-lipoxygenase as therapeutic strategy to treat stroke. Ann. Neurol. 73, 129-135 (2013).
  8. van Leyen, K., et al. Novel lipoxygenase inhibitors as neuroprotective reagents. J Neurosci. Res. 86, 904-909 (2008).
  9. Chu, J., Pratico, D. 5-lipoxygenase as an endogenous modulator of amyloid beta formation in vivo. Ann. Neurol. 69, 34-46 (2011).
  10. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-980 (1983).
  11. Bove, J., Perier, C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 211, 51-76 (2012).
  12. Beal, M. F. Neuroprotective effects of creatine. Amino Acids. 40, 1305-1313 (2011).
  13. Jackson-Lewis, V., Blesa, J., Przedborski, S. Animal models of Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord. 18, 183-185 (2012).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Wang, H., Shimoji, M., Yu, S. W., Dawson, T. M., Dawson, V. L. Apoptosis inducing factor and PARP-mediated injury in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 991, 132-139 (2003).
  16. Petroske, E., Meredith, G. E., Callen, S., Totterdell, S., Lau, Y. S. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment. Neuroscience. 106, 589-601 (2001).
  17. Przedborski, S., et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): a technical review of its utility and safety. J. Neurochem. 76, 1265-1274 (2001).
  18. Thomas, B., et al. Mitochondrial permeability transition pore component cyclophilin D distinguishes nigrostriatal dopaminergic death paradigms in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Antioxid. Redox. Signal. 16, 855-868 (2012).
  19. Sonsalla, P. K., Heikkila, R. E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur. J. Pharmacol. 129, 339-345 (1986).
  20. Di Monte, D. A., et al. Relationship among nigrostriatal denervation, parkinsonism, and dyskinesias in the MPTP primate model. Mov. Disord. 15, 459-466 (2000).
  21. Lee, K. W., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat. Protoc. 2, 141-151 (2007).
  23. Bolin, L. M., Strycharska-Orczyk, I., Murray, R., Langston, J. W., Di Monte, D. Increased vulnerability of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned interleukin-6 deficient mice. J. Neurochem. 83, 167-175 (2002).
  24. Manning-Bog, A. B., et al. Increased vulnerability of nigrostriatal terminals in DJ-1-deficient mice is mediated by the dopamine transporter. Neurobiol. Dis. 27, 141-150 (2007).
  25. Quik, M., Di Monte, D. A. Nicotine administration reduces striatal MPP+ levels in mice. Brain Res. 917, 219-224 (2001).
  26. Markey, S. P., Johannessen, J. N., Chiueh, C. C., Burns, R. S., Herkenham, M. A. Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature. 311, 464-467 (1984).
  27. Heikkila, R. E., Manzino, L., Cabbat, F. S., Duvoisin, R. C. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 311, 467-469 (1984).
  28. Crampton, J. M., Runice, C. E., Doyle, T. J., Lau, Y. S., Wilson, J. A. MPTP in mice: treatment, distribution and possible source of contamination. Life Sci. 42, 73-78 (1988).
  29. Yang, S. C., Markey, S. P., Bankiewicz, K. S., London, W. T., Lunn, G. Recommended safe practices for using the neurotoxin MPTP in animal experiments. Lab. Anim. Sci. 38, 563-567 (1988).
  30. Lau, Y. S., Novikova, L., Roels, C. MPTP treatment in mice does not transmit and cause Parkinsonian neurotoxicity in non-treated cagemates through close contact. Neuroscience research. 52, 371-378 (2005).
  31. Satoh, N., et al. Central hypothermic effects of some analogues of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP). Neurosci. Lett. 80, 100-105 (1987).
  32. Fernagut, P. O., et al. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of alpha-synuclein over-expression. Synapse. 61, 991-1001 (2007).
  33. Manning-Bog, A. B., McCormack, A. L., Purisai, M. G., Bolin, L. M., Di Monte, D. A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J. Neurosci. 23, 3095-3099 (2003).
  34. Richfield, E. K., et al. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp. Neurol. 175, 35-48 (2002).
  35. Thomas, B., et al. Resistance to MPTP-neurotoxicity in alpha-synuclein knockout mice is complemented by human alpha-synuclein and associated with increased beta-synuclein and Akt activation. PloS one. 6, (2011).
  36. Smeyne, M., Goloubeva, O., Smeyne, R. J. Strain-dependent susceptibility to MPTP and MPP(+)-induced parkinsonism is determined by glia. Glia. 34, 73-80 (2001).
  37. Hamre, K., Tharp, R., Poon, K., Xiong, X., Smeyne, R. J. Differential strain susceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus. Brain Res. 828, 91-103 (1999).
  38. Sedelis, M., et al. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav. Genet. 30, 171-182 (2000).
  39. Boyd, J. D., et al. Response to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) differs in mouse strains and reveals a divergence in JNK signaling and COX-2 induction prior to loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. Brain Res. 1175, 107-116 (2007).
  40. Ookubo, M., Yokoyama, H., Kato, H., Araki, T. Gender differences on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) neurotoxicity in C57BL/6 mice. Molecular and cellular endocrinology. 311, 62-68 (2009).
  41. Kenchappa, R. S., Diwakar, L., Annepu, J., Ravindranath, V. Estrogen and neuroprotection: higher constitutive expression of glutaredoxin in female mice offers protection against MPTP-mediated neurodegeneration. FASEB J. 18, 1102-1104 (2004).
  42. Jackson-Lewis, V., Jakowec, M., Burke, R. E., Przedborski, S. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Neurodegeneration. 4, 257-269 (1995).
  43. Mizuno, Y., Sone, N., Saitoh, T. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J. Neurochem. 48, 1787-1793 (1987).
  44. Nicklas, W. J., Youngster, S. K., Kindt, M. V., Heikkila, R. E. M. P. T. P. MPP+ and mitochondrial function. Life Sci. 40, 721-729 (1987).
  45. Nicklas, W. J., Vyas, I., Heikkila, R. E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 36, 2503-2508 (1985).
  46. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J. Neurosci. 22, 1763-1771 (2002).
  47. Kurkowska-Jastrzebska, I., Wronska, A., Kohutnicka, M., Czlonkowski, A., Czlonkowska, A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine intoxication in mouse. Exp. Neurol. 156, 50-61 (1999).
  48. Tatton, N. A., Kish, S. J. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience. 77, 1037-1048 (1997).
  49. Furuya, T., et al. Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 24, 1865-1872 (2004).
  50. Anderson, D. W., Bradbury, K. A., Schneider, J. S. Neuroprotection in Parkinson models varies with toxin administration protocol. Eur. J. Neurosci. 24, 3174-3182 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modele choroby Parkinsonaizozymy lipooksygenazywyzwanie neurotoksyn MPTPanaliza poziomu dopaminyanaliza Western blotbarwienie immunohistochemicznedetekcja hydroksylazy tyrozynowejkwa ne bia ko w kienkowe glejuimmunohistochemia Iba 1

Powiązane artykuły