Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Długoterminowe śledzenie behawioralne swobodnie pływających ryb o słabym natężeniu elektryczności

12.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50962

⸱

6 marca 2014

 ,  , 
1Department of Physics, University of Ottawa, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 3Centre for Neural Dynamics, University of Ottawa

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy zestaw technik do badania spontanicznego zachowania swobodnie pływających ryb o słabo elektrycznym okresie czasu, poprzez synchroniczny pomiar czasu wyładowania elektrycznego zwierzęcia, pozycji ciała i postawy zarówno dokładnie, jak i niezawodnie w specjalnie zaprojektowanym zbiorniku akwariowym wewnątrz sensorycznej komory izolacyjnej.

Streszczenie

Długoterminowe śledzenie zachowań może uchwycić i określić ilościowo naturalne zachowania zwierząt, w tym te występujące rzadko. Zachowania takie jak eksploracja i interakcje społeczne można najlepiej badać, obserwując nieskrępowane, swobodnie zachowujące się zwierzęta. Ryby o słabym natężeniu elektrycznym (WEF) wykazują łatwo dostrzegalne zachowania eksploracyjne i społeczne poprzez emitowanie wyładowań elektrycznych (EOD). W tym miejscu opisujemy trzy skuteczne techniki synchronicznego pomiaru EOD, pozycji ciała i postawy swobodnie pływającego WEF przez dłuższy czas. W pierwszej kolejności opisujemy budowę eksperymentalnego zbiornika wewnątrz komory izolacyjnej zaprojektowanej do blokowania zewnętrznych źródeł bodźców sensorycznych, takich jak światło, dźwięk i wibracje. Akwarium zostało podzielone tak, aby pomieścić cztery próbki testowe, a automatyczne bramy zdalnie kontrolują dostęp zwierząt do centralnej areny. Po drugie, opisujemy precyzyjną i niezawodną metodę pomiaru czasu EOD w czasie rzeczywistym z swobodnie pływającego WEF. Zniekształcenia sygnału spowodowane ruchami ciała zwierzęcia są korygowane przez etapy uśredniania przestrzennego i przetwarzania czasowego. Po trzecie, opisujemy podwodną konfigurację obrazowania w bliskiej podczerwieni w celu obserwacji niezakłóconych nocnych zachowań zwierząt. Impulsy światła podczerwonego zostały wykorzystane do synchronizacji czasu między obrazem wideo a sygnałem fizjologicznym przez długi czas trwania nagrania. Nasze zautomatyzowane oprogramowanie do śledzenia niezawodnie mierzy pozycję i postawę ciała zwierzęcia w środowisku wodnym. W połączeniu techniki te umożliwiają długotrwałą obserwację spontanicznych zachowań swobodnie pływających ryb o słabym natężeniu elektryczności w wiarygodny i precyzyjny sposób. Uważamy, że nasza metoda może być podobnie zastosowana do badania innych zwierząt wodnych poprzez powiązanie ich sygnałów fizjologicznych z zachowaniami eksploracyjnymi lub społecznymi.

Wprowadzenie

Tło. Eksperymenty ilościowe dotyczące zachowania zwierząt (np. wymuszony wybór, unikanie wstrząsów, labirynt w kształcie litery T itp.) są zwykle wykorzystywane do badania konkretnych hipotez dotyczących umiejętności sensoryczno-motorycznych, uczenia się i tworzenia pamięci. Jednak te restrykcyjne eksperymenty pomijają wiele z bogactwa naturalnego zachowania zwierząt i prawdopodobnie spowodują zbyt uproszczone modele leżących u podstaw neuronalnych podstaw zachowania. Eksperymenty w bardziej naturalistycznych warunkach są zatem ważnym uzupełnieniem, dzięki któremu możemy pełniej badać repertuar zachowań gatunku. Eksperymenty z udziałem swobodnie poruszających się zwierząt muszą jednak uwzględniać wyjątkowe wyzwania techniczne, takie jak artefakty rejestracyjne wywołane ruchem. W przeciwieństwie do reakcji wywołanych bodźcem, nie można przewidzieć spontanicznie występujących zachowań eksploracyjnych; W związku z tym osoby eksperymentalne muszą być stale monitorowane i śledzone przez dłuższy okres czasu. Na konkretne pytania badawcze najlepiej odpowiadają starannie dobrane organizmy i dostępne narzędzia techniczne. Na przykład techniki optycznego zapisu i stymulacji, takie jak genetycznie kodowane czujniki wapnia1 i optogenetyka2, zostały z powodzeniem zastosowane do swobodnie poruszających się organizmów modelowych3-5. Alternatywnie, zminiaturyzowane neuronowe systemy telemetryczne mogą rejestrować i stymulować swobodnie poruszające się małe zwierzęta6,7.

Elektryczna ryba. Gatunki WEF generują wyładowania narządowe (EOD), które pozwalają im wyczuwać bezpośrednie otoczenie lub komunikować się na większe odległości. Wzorce czasowe EOD różnią się w różnych warunkach, takich jak ruchy własne8,9, bodźce sensoryczne10,11 i interakcje społeczne12,13. Impulsowe formy WEF wytwarzają ciąg dyskretnych impulsów, w przeciwieństwie do form falowych, które generują ciągłe quasi-sinusoidalne przebiegi. Ogólnie rzecz biorąc, gatunki typu impulsowego wykazują bardziej zmienną szybkość EOD w porównaniu z gatunkami typu falowego; a wskaźniki EOD u zwierząt ściśle odzwierciedlają nowości w ich otoczeniu sensorycznym10,14. Gatunki typu impulsowego mogą natychmiast skrócić interwał między impulsami (IPI) w ciągu jednego cyklu impulsowego w odpowiedzi na nowe zaburzenie sensoryczne (odpowiedź nowości10,11,14). Trwające zachowanie elektryczne tych ryb może być zaburzone przez niekontrolowane bodźce sensoryczne ze źródeł zewnętrznych; Wiadomo, że różne rodzaje bodźców, takie jak wibracje, dźwięk, elektryczność i światło, wywołują reakcje na nowość. W związku z tym należy podjąć szczególne środki ostrożności w celu zablokowania lub osłabienia zewnętrznych bodźców czuciowych podczas długotrwałej obserwacji WEF podczas swobodnego pływania. W ten sposób zmiany w tempie EOD i trajektoriach ruchu można konkretnie przypisać bodźcom prezentowanym przez eksperymentatora.

Zbiornik akwariowy i komora izolacyjna. W związku z tym umieściliśmy wiele warstw materiałów pochłaniających drgania pod dużym zbiornikiem akwariowym (2,1 m x 2,1 m x 0,3 m) i otoczyliśmy zbiornik izolowaną obudową, aby zablokować zewnętrzne źródła światła, szumu elektrycznego, dźwięku i strumienia ciepła. Szybkość EOD zależy od temperatury otoczenia15,16, dlatego temperatura wody była ściśle regulowana w zakresie tropikalnym (25±1 °C) dla gatunków WEF z Ameryki Południowej. Zbudowaliśmy duży i płytki (10 cm głębokości wody) zbiornik, aby obserwować przestrzenne zachowania eksploracyjne WEF ograniczone głównie w dwóch wymiarach (Rysunek 1A). Zbiornik został podzielony na centralną arenę w celu obserwacji zachowań przestrzennych oraz cztery narożne przedziały, w których oddzielnie trzymano poszczególne ryby (ryc. 1B). Każda komora została zbudowana wodoszczelnie, aby zapobiec komunikacji elektrycznej między osobami. Dostęp zwierząt do centralnej areny był kontrolowany z zewnątrz przez cztery zmotoryzowane bramy. Wrota umieszczono między komorami, a po zamknięciu na nylonowe nakrętki motylkowe stawały się wodoszczelne. Pod wodą nie użyto żadnych części metalowych, ponieważ WEF reaguje wrażliwie na metale.

Nagrywanie EOD. EOD są generowane w stereotypowy sposób przez aktywację pojedynczych (u Mormyridów) lub wielu przestrzennie rozmieszczonych organów elektrycznych (u Gymnotiformes)17,18. Czasowe modulacje szybkości EOD mogą ujawnić aktywność neuronalną wyższego poziomu, ponieważ rozrusznik rdzeniowy otrzymuje bezpośrednie sygnały nerwowe z wyższych obszarów mózgu, takich jak jądro przedmózgowia przedstymulatora, które z kolei odbiera projekcje aksonalne z przodomózgowia19. Jednak czas EOD musi być starannie wyodrębniony z surowego nagrania falowego i nie może być zniekształcony przez zniekształcenia wywołane ruchem zwierzęcia. Pole elektryczne generowane przez WEF można w przybliżeniu określić jako dipol; zatem amplitudy impulsów EOD na elektrodach rejestrujących zależą od względnych odległości i orientacji między zwierzęciem a elektrodami8,20. Samoruchy zwierzęcia zmieniają względną geometrię między zwierzęciem a elektrodami, w związku z czym ruchy powodują, że amplitudy EOD przy różnych elektrodach zmieniają się w czasie w sposób niestabilny (patrz rysunek 2B w Jun et al.8). Co więcej, ruchy własne zmieniają również kształt rejestrowanych przebiegów EOD, ponieważ względne udziały różnych zestawów narządów elektrycznych zależą od ich lokalizacji na całej długości ciała i ich lokalnych krzywizn wprowadzonych przez zginanie ogona. Wywołane ruchem zniekształcenia amplitud i kształtów EOD mogą prowadzić do niedokładnych i niewiarygodnych pomiarów czasu EOD. Przezwyciężyliśmy te problemy, uśredniając przestrzennie wiele przebiegów EOD zarejestrowanych w różnych lokalizacjach oraz dodając filtr ekstrakcji obwiedni w celu precyzyjnego określenia czasu EOD z swobodnie pływającego WEF. Ponadto nasza technika mierzy również amplitudy EOD, które wskazują, czy zwierzę odpoczywa, czy aktywnie się porusza, na podstawie zmiany amplitudy EOD w czasie (patrz rysunki 2E i 2F). Nagraliśmy różnicowo wzmocnione sygnały z par elektrod rejestrujących, aby zredukować szumy w trybie wspólnym. Ponieważ impulsy EOD są generowane w nieregularnych odstępach czasu, szeregi czasowe zdarzeń EOD mają zmienną częstotliwość próbkowania. Szeregi czasowe EOD można przekonwertować na stałą częstotliwość próbkowania przez interpolację, jeśli jest to wymagane przez wybrane narzędzie analityczne.

Nagrywanie wideo. Chociaż zapis EOD może monitorować dużą aktywność ruchową zwierzęcia, zapis wideo umożliwia bezpośrednie pomiary pozycji i postawy ciała zwierzęcia. Oświetlenie w bliskiej podczerwieni (NIR) (λ = 800 ~ 900 nm) pozwala na niezakłóconą obserwację wzrokową swobodnie pływających ryb21,22, ponieważ WEF są najbardziej aktywne w ciemności, a ich oczy nie są wrażliwe na widmo NIR23,24. Większość cyfrowych czujników obrazowania (np. CMOS lub CCD) może przechwytywać widmo NIR w zakresie długości fal w zakresie 800-900 nm, po usunięciu filtra blokującego podczerwień (IR)25. Niektóre wysokiej klasy kamery internetowe klasy konsumenckiej oferują wysoką rozdzielczość, szeroki kąt widzenia i dobrą czułość przy słabym oświetleniu, co może zapewnić jakość obrazu porównywalną lub lepszą od profesjonalnych kamer na podczerwień dostępnych przy znacznie wyższych kosztach. Ponadto niektóre kamery internetowe klasy konsumenckiej są dostarczane z oprogramowaniem do nagrywania, które umożliwia wydłużenie czasu nagrywania poprzez kompresję wideo bez utraty jakości. Większość profesjonalnych kamer oferuje wyjścia impulsowe TTL z synchronizacją czasu lub wyzwalające wejścia impulsowe TTL26 w celu wyrównania czasu między wideo a sygnałami cyfrowymi, ale ta funkcja jest generalnie nieobecna w kamerach internetowych klasy konsumenckiej. Jednak czas między nagraniem wideo a digitizerem sygnału można dokładnie dopasować, jednocześnie rejestrując okresowo diodę podczerwieni z kamerą i digitizerem sygnału. Początkowy i końcowy czas impulsu podczerwieni mogą być używane jako dwa znaczniki kalibracji czasu do konwersji numerów klatek wideo na jednostkę czasu digitizera sygnału i odwrotnie.

Oświetlenie i tło. Rejestrowanie obrazu przez wodę może być trudne technicznie ze względu na odbicia światła na powierzchni wody. Powierzchnia wody może działać jak lustro, które odbija scenę wizualną nad wodą i zasłania cechy wizualne pod wodą; W związku z tym scena nad wodą musi zostać pozbawiona cech charakterystycznych, aby zapobiec zakłóceniom wizualnym. Aby sfotografować całe akwarium, kamera musi być umieszczona bezpośrednio nad wodą; I powinien być ukryty za sufitem nad małym otworem widokowym, aby zapobiec jego odbiciu od powierzchni wody. Co więcej, powierzchnia wody może powodować odblaski i nierównomierne oświetlenie, jeśli źródła światła są nieprawidłowo rzutowane. Oświetlenie pośrednie może osiągnąć jednolitą jasność w całym akwarium, kierując źródła światła w stronę sufitu, tak aby sufit i otaczające ściany mogły odbijać i rozpraszać promienie świetlne przed dotarciem do powierzchni wody. Wybierz oświetlacz podczerwieni, który pasuje do odpowiedzi spektralnej kamery (np. szczytowa długość fali 850 nm). Szum elektryczny ze źródeł światła można zminimalizować, stosując światła LED i umieszczając ich zasilacze prądu stałego na zewnątrz klatki Faradaya. Umieść białe tło pod zbiornikiem, ponieważ ryba dobrze kontrastuje na białym tle przy długościach fal NIR. Podobnie, zastosowanie matowego białego koloru na wewnętrznych powierzchniach komory izolacyjnej zapewnia równomierne i jasne oświetlenie tła.

Śledzenie wideo. Po nagraniu wideo algorytm automatycznego śledzenia obrazu może mierzyć pozycje i postawy ciała zwierzęcia w czasie. Śledzenie wideo może być wykonywane automatycznie przez gotowe do użycia oprogramowanie (Viewpoint lub Ethovision) lub oprogramowanie programowalne przez użytkownika (OpenCV lub MATLAB Image Processing Toolbox). Pierwszym krokiem śledzenia obrazu jest zdefiniowanie prawidłowego obszaru śledzenia poprzez narysowanie kształtu geometrycznego, aby wykluczyć obszar na zewnątrz (operacja maskowania). Następnie obraz zwierzęcia należy odizolować od tła poprzez odjęcie obrazu tła od obrazu przedstawiającego zwierzę. Odjęty obraz jest konwertowany do formatu binarnego przez zastosowanie progu intensywności, tak aby oś środka ciężkości i orientacji można było obliczyć na podstawie binarnych operacji morfologicznych. U Gymnotiforms27-29 i Mormyrids30-32 gęstość elektroreceptorów jest największa w pobliżu głowy; Tak więc pozycja głowy w dowolnym momencie wskazuje na miejsce o najwyższej ostrości czucia. Położenie głowy i ogona można określić automatycznie, stosując operacje obracania obrazu i obwiedni. Końce głowy i ogona można było odróżnić od siebie, ręcznie definiując je w pierwszej klatce i śledząc ich położenie na podstawie porównania dwóch kolejnych klatek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejsza procedura spełnia wymogi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie. Nie zadeklarowano konfliktu interesów. Prosimy zapoznać się z Tabelą Materiałów i Odczynników w celu sprawdzenia producentów i modeli wymienionego poniżej sprzętu i materiałów. W pliku uzupełniającym znajdują się specjalistyczne skrypty Spike2 i MATLAB oraz przykładowe dane.

1. Konfiguracja akwarium i komory izolacyjnej

  1. Przeciwciało-vpodłoga wibracyjnaZbuduj powierzchnię antywibracyjną (2,1 m x 2,1 m), układając warstwowo od dołu do góry: podkładki gumowe, styropian akustyczny, panel z sklejki wodoodpornej oraz podkładki z pianki poliuretanowej (Rycina 1A). Ułóż cztery drewniane łaty (5 cm x 10 cm) na płycie sklejki, aby podeprzeć krawędzie akwarium.
  2. Grzejnik podłogowyUmieść ekranowany elektrycznie element grzejny na podkładce z pianki o stopniowanym rozkładzie temperatury (patrz Rycina 1D (na dole). Przykryj element grzejny metalową siatką w celu ekranowania elektrycznego.
  3. Zbiornik przestrzennyZbuduj szeroki i płytki akwarium (1,8 m x 1,8 m x 30 cm), wykorzystując hartowane panele szklane o grubości 1,3 cm, aluminiową ramę w kształcie litery L oraz silikon akwarystyczny (patrz Rycina 1A). Przykryj spód zbiornika dużym arkuszem białego tła, aby zapewnić wysoki kontrast obrazowania (patrz Protokół 3).
  4. Podziel akwarium na centralną arenę (średnica 1,5 m) oraz cztery przedziały narożne (patrz Rysunek 1B) poprzez zainstalowanie ścianek (o wysokości 22,5 cm) wykonanych z arkuszy akrylu (matowa biel, grubość 0,64 cm).
    1. Zgiąć cztery arkusze akrylowe (22,5 cm x 102,7 cm) przy użyciu ciepła w celu utworzenia czterech zakrzywionych sekcji ścian, a następnie przymocować je do dna zbiornika za pomocą silikonu uszczelniającego, aby oddzielić centralną arenę od czterech przedziałów narożnych. Pozostawić 20 cm odstępu między zakrzywionymi sekcjami na instalację bramy.
    2. Oddziel sąsiednie przedziały narożne poprzez montaż czterech podwójnych ścian z przerwami o szerokości 15 cm, które zapewniają dodatkową izolację elektryczną oraz miejsca na czujniki podwodne, takie jak hydrofon.
  5. Zmontuj cztery bramki z napędem elektrycznym i zainstaluj je pomiędzy komorami narożnymi a areną centralną.
    1. Zmontuj cztery ramy drzwiowe zgodnie z rysunkiem w Rycina 1CW każdej ramie drzwi należy wykonać sześć otworów (o głębokości 0,64 cm), osadzić w nich nylonowe nakrętki z kołpakiem (z gwintem o średnicy 0,64 cm) i utrwalić je za pomocą żywicy epoksydowej.
    2. Wytnij cztery panele drzwiowe z arkuszy akrylu i gumy, a następnie wykonaj sześć otworów (o średnicy 0,64 cm) w panelach akrylowych i gumowych na mechanizm blokujący. Połącz panele akrylowe i gumowe za pomocą uszczelniacza silikonowego.
    3. Zainstaluj akrylowe zawiasy, aby połączyć panele drzwiowe z ramami drzwi.
    4. Zamontuj ramiona wahadłowe na serwosilnikach, a następnie zainstaluj je na górnej części ram drzwi (patrz Rycina 1C). Wykonać pętle za pomocą opasek zaciskowych, aby połączyć ramiona wahadłowe z panelami drzwi.
    5. Ustaw zestawy bramek w szczelinach powstałych między zakrzywionymi sekcjami ścian i przymocuj je, używając uszczelniacza silikonowego.
    6. Podłącz wszystkie serwosilniki do sterownika serwomechanizmów, a następnie podłącz sterownik do źródła zasilania oraz do komputera za pomocą aktywnego przedłużacza USB. Przetestuj bramki, korzystając z oprogramowania sterującego dostarczonego wraz ze sterownikiem serwomechanizmów.
    7. Po utwardzeniu silikonu należy sprawdzić szczelność, blokując wszystkie zastawki śrubami nylonowymi i napełniając po jednej komorze na raz.
  6. Komora izolacyjnaZbuduj komorę izolacyjną otaczającą akwarium, aby zablokować zewnętrzne źródła światła, dźwięku i zakłóceń elektrycznych (patrz Rysunek 1D).
    1. Przygotuj trzy panele ścienne (2 m x 2 m x 5 cm) oraz cztery panele drzwiowe (1,9 m x 0,95 m x 5 cm). W przypadku każdego panelu połącz profile aluminiowe (5 cm x 2,5 cm) w celu utworzenia prostokątnej ramy, a następnie do ramy aluminiowej nituj biały panel z tworzywa sztucznego o strukturze falistej. Wypełnij panele akustycznymi matami z włókna szklanego i zamknij je czarnym panelem z tworzywa sztucznego o strukturze falistej.
    2. Zainstaluj trzy panele ścienne na podłodze antywibracyjnej, a następnie zamontuj zawiasy taśmowe, aby połączyć cztery panele drzwiowe z panelami ściennymi.
    3. Otocz komorę izolacyjną siatkami aluminiowymi i uziemi siatki z każdej strony, aby stworzyć klatkę Faradaya.
  7. Kontrola wilgotnościZainstaluj niskoszumny wentylator wyciągowy (Rysunek 1F (góra) w celu usunięcia nadmiaru wilgoci powstałej w wyniku ogrzewania. Wentylator wyciągowy należy umieścić w odległości co najmniej 2 m od miejsca rejestracji, a pomiędzy komorą izolacyjną a wentylatorem wyciągowym należy zainstalować kanał wentylacyjny.
  8. Regularnie monitoruj i utrzymuj warunki wody w zbiorniku oraz stan zwierząt.
    1. Utrzymuj stałe warunki wodne przy głębokości 10 cm, 100 µS/cm przewodność i pH 7,0 poprzez dodanie wody lub roztworu solnego z zapasu (patrz Knudsen33 (do przepisu). W przypadku spadku pH poniżej 6,5 dodać woreczek z kruszonym koralem.
    2. Zainstaluj pionowe filtry akwarialne, które mogą pracować w płytkiej wodzie w celu oczyszczania i napowietrzania (Rycina 1F (dół). Odłącz filtry i wyjmij je z centralnej areny podczas sesji rejestracyjnych.
    3. Dostarcz żywe mączniki na dno zbiornika, mocując je do przyssawek za pomocą gumek. Unikaj stosowania swobodnie pływających organizmów, takich jak pijawki, aby zapobiec niekontrolowanemu żerowaniu na przypadkowych ofiarach podczas nagrywania.

2. Śledzenie EOD

  1. Instalacja elektrod. Przygotuj osiem grafitowych elektrod i rozmieść je w równych odstępach na zakrzywionej ściance centralnej areny.
    1. Przygotuj wkład grafitowy do rysowania (długość 15 cm; Mars Carbon typ HB 2 mm) i zdejmij zewnętrzną powłokę wkładów.
    2. Odetnij osiem 10-centymetrowych odcinków kabla koncentrycznego (RG-174), owiń rdzeń kabla wokół jednego końca grafitowych prętów i nałóż rurki termokurczliwe, aby zapewnić mocne i stabilne połączenie elektryczne. Na przeciwległych końcach zamocuj gniazda BNC (Rysunek 2A lewa strona).
    3. Ustabilizuj położenie elektrod na ściance za pomocą taśmy, a na powierzchnie elektrod naklej cienkie paski taśmy maskującej, aby chronić je przed silikonem. Nałóż uszczelniacz silikonowy, aby trwale zamocować elektrody, a następnie usuń całą taśmę przed utwardzeniem się silikonu (Rysunek 2A prawa strona).
  2. Przygotuj osiem zestawów przewodów, mierząc odległość od każdej elektrody do jednostki wzmacniacza i dociętej odpowiednio długości kabli koncentrycznych (RG-54). Na obu końcach kabli zamontuj wtyczki BNC.
  3. Za pomocą przygotowanych zestawów przewodów podłącz wszystkie elektrody do jednostki wzmacniacza. Wzmacnianie różnicowe realizuj poprzez parowanie dwóch elektrod zorientowanych pod kątem 90° (patrz Rysunek 2B), a wszystkie ekrany kabli koncentrycznych uziemij, łącząc je z klatką Faradaya.
  4. Ustaw wzmocnienie wzmacniacza poniżej limitu nasycenia sygnału i zastosuj filtr pasmowy (200 Hz-5 kHz) w celu usunięcia szumów. Cyfryzuj sygnały z czterech par elektrod rejestrujących z częstotliwością 40 kS/sec.
  5. Przetwarzanie sygnału online. Instrukcje sporządzono dla oprogramowania Spike2, a ustawienia parametrów zoptymalizowano dla Gymnotus sp. (podsumowanie patrz Rysunek 2C).
    1. Dodaj proces DC remove (usuwanie składowej stałej, τ = 0,1 sec) do wszystkich kanałów rejestrujących.
    2. Dodaj proces rectify (prostowanie) do wszystkich kanałów rejestrujących.
    3. Utwórz kanał virtual (wirtualny) poprzez sumowanie wszystkich czterech kanałów rejestrujących.
    4. Wyodrębnij jednomodalną obwiednię dla każdego impulsu EOD, dodając proces RMS (średnia kwadratowa, Równanie mocy dla rozszerzenia dwumianowego; symbol matematyczny; treść edukacyjna. ) (τ = 0,25 msec) do kanału virtual w celu wygenerowania pojedynczego piku dla każdego cyklu EOD, co pozwoli na jednoznaczne określenie czasu impulsu.
    5. Utwórz kanał realmark z kanału virtual i zarejestruj czas oraz wartości amplitud pików, po uprzednim ustawieniu odpowiedniego progu, aby uchwycić wszystkie impulsy EOD bez pominięć, unikając jednocześnie wyników fałszywie dodatnich.
    6. Monitoruj chwilową częstotliwość EOD w czasie rzeczywistym, ustawiając opcję wyświetlania kanału realmark w trybie instantaneous frequency (częstotliwość chwilowa).
    7. Monitoruj ruch ryby w czasie rzeczywistym poprzez powielenie kanału realmark i ustawienie opcji wyświetlania w trybie waveform (kształt fali).
    8. Ilościowo określ poziom aktywności z RMS nachylenia amplitudy EOD, tworząc kanał virtual z kanału realmark (okres próbkowania 0,01 sec) i dodając procesy slope (nachylenie, τ = 0,25 msec) oraz RMS (τ = 0,5 msec).
    9. Wyeksportuj kanał realmark z oprogramowania Spike2 do formatu MATLAB.

3. Zsynchronizowane śledzenie wideo

  1. Przygotowanie tła sceny.
    1. Zasłonić każdy obiekt rzucający odbicie na powierzchni wody, używając matowej białej folii do blatów.
    2. Zainstalować matowy biały panel z tworzywa falistego 15 cm poniżej sufitu, aby ukryć kamerę i otwór wentylacyjny.
    3. Wydrukować wzory siatki na dużym arkuszu białego papieru do kalibracji kamery i umieścić go pod zbiornikiem, aby zapewnić kontrastowe tło.
  2. Instalacja źródeł światła.
    1. Przygotować diody IR LED i usunąć wbudowane wentylatory w celu redukcji szumów. Diody LED zasilać za pomocą stabilizowanego prądowo zasilacza DC umieszczonego poza klatką Faradaya.
    2. Zainstalować diody IR LED do obrazowania w ciemności oraz białe diody LED do sterowania cyklem dobowym światła u badanych ryb. Skierować wszystkie źródła światła w stronę sufitu, aby uzyskać pośrednie i jednolite oświetlenie (Rysunek 3A).
    3. Regulować dobowy cykl świetlny, sterując białymi diodami LED za pomocą przełącznika sterowanego czasowo (np. 12 h włączone/12 h wyłączone).
  3. Instalacja kamery bezpośrednio nad akwarium.
    1. Użyć kamery czułej na bliską podczerwień (NIR) lub usunąć filtr blokujący IR, rozbijając cienką płytkę barwionego szkła z tyłu zestawu obiektywu. Upewnić się, że kąt widzenia jest wystarczająco szeroki, aby objąć cały obszar centralny areny.
    2. Wyciąć mały otwór obserwacyjny na środku panelu sufitowego i umieścić kamerę bezpośrednio nad otworem.
    3. Zainstalować białą osłonę pierścieniową wokół obiektywu, jeśli źródła światła generują odblaski.
  4. Wykonanie zsynchronizowanego czasowo nagrania wideo.
    1. Umieścić diodę IR LED w jednym z czterech narożników zbiornika w celu generowania impulsów synchronizacji czasowej (czas trwania 1 msec, okres 10 sec). Dodatkowo połączyć szeregowo rezystor ograniczający prąd (1 kΩ) i zasilać diodę IR LED z cyfrowego portu wyjściowego urządzenia digitalizującego.
    2. Użyć oprogramowania do nagrywania wideo dołączonego do kamery, jeśli jest dostępne. Wybrać najwyższą jakość nagrywania (np. kompresja bezstratna) oraz najwyższe obsługiwane rozdzielczości.
    3. Rozpocząć nagrywanie wideo bezpośrednio przed rozpoczęciem rejestracji EOD i zatrzymać nagrywanie wideo bezpośrednio po zakończeniu rejestracji EOD.
    4. Po zakończeniu nagrywania przeliczyć numery klatek obrazu na jednostki czasu digitalizatora, stosując interpolację liniową między pierwszym a ostatnim impulsem światła zarejestrowanym przez digitalizator sygnału oraz w nagraniu wideo.
  5. Zautomatyzowane śledzenie obrazu
    Instrukcje zostały napisane dla biblioteki Image processing toolbox w programie MATLAB i wykorzystują jej funkcje. Do automatycznego śledzenia obrazu do niniejszej publikacji dołączono niestandardowy skrypt MATLAB. 
    1. Import wideo. Importować plik nagrania wideo bezpośrednio do obszaru roboczego MATLAB za pomocą funkcji „Videoreader.read”.
    2. Utworzyć kompozytowy obraz tła poprzez połączenie dwóch klatek obrazu. Zastąpić obszar obrazu zajmowany przez zwierzę nieobsadzonym obrazem tego samego obszaru z innej klatki (patrz. Rysunek 3B).
    3. Wyznaczyć obszar obrazu do śledzenia, rysując kolistą maskę wokół centralnej areny w celu wykluczenia obszaru zewnętrznego (Rysunek 3B dół) i pomnożyć przez stałą (rint), aby ustawić minimalny próg różnicy intensywności. Na przykład ustawienie rint = 0,85 stłumi wahania intensywności o 15% = (1 - rint) poniżej poziomu tła.
    4. Odejmowanie obrazu. Odjąć klatkę obrazu (=IMk) od obrazu tła (=IM­0), aby uzyskać obraz różnicowy (=ΔIMk). Użyć precyzji numerycznej unsigned integer, aby przechowywać wartości intensywności obrazu jako liczby całkowite nieujemne.
    5. Przeprowadzić segmentację obrazu różnicowego, stosując próg intensywności wyznaczony za pomocą funkcji graythresh. Wyczyścić obraz binarny za pomocą funkcji bwmorph i wybrać największą plamę odpowiadającą zwierzęciu po obliczeniu powierzchni wszystkich plam za pomocą funkcji regionprops.
    6. Wyznaczyć centroid i główną oś orientacji największej plamy za pomocą funkcji regionprops i obrócić obraz tak, aby oś główna pokrywała się z osią x. Podzielić obraz na część głowy i ogona w miejscu centroidu (Rysunek 3D góra).
    7. Wyznaczyć oś główną części głowy i obrócić cały obraz tak, aby była ona zgodna z osią x (Rysunek 3D dół lewo). Dopasować ramki ograniczające (bounding-boxes) wokół części głowy i ogona równolegle do ich osi głównych za pomocą funkcji regionprops.
    8. Wyznaczyć medianowe współrzędne y plamy na lewej, środkowej i prawej krawędzi pionowej ramek ograniczających (zielone kropki na Rysunku 3D dół) i przypisać je do pięciu punktów charakterystycznych (koniec głowy, środek głowy, środek ciała, środek ogona, koniec ogona).
    9. Przetwarzać kolejne klatki po wycięciu fragmentu klatki wycentrowanego na centroidzie zwierzęcia wyznaczonym z poprzedniej klatki.
    10. Ręcznie przypisać orientację głowy dla pierwszej klatki, a następnie użyć iloczynu skalarnego wektorów orientacji z dwóch kolejnych klatek, aby automatycznie wyznaczyć orientację głowy. Sprawdzić wynik i ręcznie odwrócić orientację głowy w przypadku błędnego przypisania.
  6. Wykreślić trajektorię zwierzęcia, łącząc punkty końców głowy, a w przypadku wystąpienia drgań wygładzić ją za pomocą filtrów medianowych i średnich (n=3). Nałożyć trajektorię na obraz tła i interpolować linie środkowe ryb przy użyciu pięciu punktów charakterystycznych (patrz. Rysunek 2E).
  7. Obliczyć średnią częstotliwość EOD dla każdego czasu przechwycenia obrazu poprzez resamplowanie chwilowej częstotliwości EOD (częstotliwość próbkowania 100 Hz) i uśrednianie (okno czasowe 0,0625 sec). Wykreślić trajektorię w pseudo-kolorach wyznaczonych z dopasowanej czasowo częstotliwości EOD i nałożyć ją na obraz tła (patrz. Rysunek 2F).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki śledzenia EOD

Zarejestrowane przebiegi czasowe EOD z różnych par elektrod różniły się amplitudami i kształtami, co było spodziewane ze względu na ich unikalne położenia i orientacje (Rysunek 2C góra). Zastosowanie wielu par elektrod zapewniło silnąy odbiór sygnału we wszystkich możliwych pozycjach i orientacjach WEF w zbiorniku. Przebieg obwiedni (Rysunek 2C dół, zielona krzywa) zawsze zawierał jeden szczyt na cykl EOD, co służyło jako niezawodny znacznik ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Znaczenie naszych technik. Podsumowując, najpierw opisaliśmy budowę dużego zbiornika akwariowego i komory izolacyjnej, aby obserwować spontaniczne zachowania eksploracyjne wytwarzane przez WEF. Następnie zademonstrowaliśmy technikę rejestrowania i śledzenia szybkości EOD i stanów ruchu nieskrępowanych ryb w czasie rzeczywistym przy użyciu wielu par elektrod. Na koniec opisaliśmy technikę nagrywania wideo w podczerwieni przez wodę w sposób zsynchronizowany w czasie oraz algorytm śledzenia obrazu w celu pomiaru po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była hojnie wspierana przez Kanadyjską Radę Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) oraz Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aquarium Construction
Elektrycznie ekranowany grzejnik podłogowyThermoSoft Corp., IL, USAThermoTilewww.thermosoft.com
Panel ze szkła hartowanegoogrubości 0,5 cala, stosowany do budowy akwarium
Silikon akwariowyogólny 
Arkusz akrylowyogólny0,25 cala grubego, matowego białego
Arkusz kauczuku naturalnegoogólny0,25 cala
grubości SerwomotorHTECHRCD Inc., KoreaHS-325HB, obrót o 180 stopniwww.servocity.com
Mocowanie ramienia serwomotoruHITECHRCD Inc., Korea56362 Duży wypustwww.servocity.com
Sterownik serwomotoru (6 kanałów)SparkfunROB-09664Micro Maestro 6-kanałowy kontroler serwo USB
Aktywny przedłużacz USBC2G3899012 m USB 2.0 A męski na żeński 4-portowy aktywny przedłużacz
Wentylator wyciągowyNutoneILFK120www.homedepot.com
Pionowy filtr akwariowyTetra, NiemcyWewnętrzny filtr zasilania Whisper - 40i 
Zmiażdżony koralSłuży do zwiększania pH zbiornika woda
EOD Konfiguracja nagrywania
Graphite ElektrodyStaedtler, NiemcyMars Carbon 2-mm typ HBGolenie zewnętrznej powłoki
Fizjologiczny wzmacniacz/filtrIntronix, Kanada2015F 
koncentrycznyogólnyRG174Do montażu elektrod
koncentrycznyogólnyRG54Do okablowania użyj
złącza BNC jack dla RG-174Amphenol Connex112160Do montażu elektrod
Złącze wtykowe BNC do RG-54Amphenol Connex112116Do użytku z okablowaniem
Sprzęt digitizera sygnałuCambridge Electronic Design, Wielka BrytaniaMoc MKII 1401 
Oprogramowanie digitizera sygnałuCambridge Electronic Design, UKSpike 2. ver 7 
Konfiguracja śledzenia wizualnego
Białe światło LEDIKEA, SzwecjaDIODER 201.194.18www.ikea.com
Światło LED w podczerwieni (850 nm)Scena Elektronika, ChinyS8100-60-B/C-IRUsuń wbudowany wentylator
USB webkameraLogitech Inc., CA, USAC910Usuń filtr blokujący podczerwień
Zmotoryzowana kameraLogitech Inc., CA, Stany ZjednoczoneQuickcam OrbitUsuń filtr blokujący podczerwień
Oprogramowanie do nagrywania wideoLogitech Inc., CA, Stany ZjednoczoneOprogramowanie Logitech QuickcamPobierz z www.logitech.com
MATLABMathworks, MA, USA2012aZestaw narzędzi do przetwarzania obrazu

Bibliografia

  1. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., De Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  4. Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nat. Neurosci. 13 (4), 513-520 (2010).
  5. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
  6. Mavoori, J., Millard, B., Longnion, J., Daniel, T., Diorio, C. A miniature implantable computer for functional electrical stimulation and recording of neuromuscular activity. In IEEE international workshop on biomedical circuits and systems (BioCAS) 2004; Session: Functional Electrical Stimulators and Related Sensing Techniques. , (2004).
  7. Harrison, R. R., Fotowat, H., Chan, R., Kier, R. J., Olberg, R., Leonardo, A., Gabbiani, F. Wireless neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE TBioCAS. 5 (2), 103-111 (2011).
  8. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Precision measurement of electric organ discharge timing from freely moving weakly electric fish. J. Neurophys. 107 (7), 1996-2007 (2012).
  9. Forlim, C. G., Pinto, R. D. Noninvasive Realistic Stimulation/Recording of Freely Swimming Weakly Electric Fish: Movement Detection and Discharge Entropy to Infer Fish Behavior. , (2012).
  10. Caputi, A. A., Aguilera, P. A., Castelló, M. E. Probability and amplitude of novelty responses as a function of the change in contrast of the reafferent image in G. carapo. J. Exp. Biol. 206 (6), 999-1010 (2003).
  11. Pluta, S. R., Kawasaki, M. Multisensory enhancement of electromotor responses to a single moving object. J. Exp. Biol. 211 (18), 2919-2930 (2008).
  12. Heiligenberg, W. Electrolocation and jamming avoidance in a Hypopygus (Rhamphichthyidae, Gymnotoidei), an electric fish with pulse-type discharges. J. Comp. Phys. A. 91 (3), 223-240 (1974).
  13. Capurro, A., Malta, C. P. Noise autocorrelation and jamming avoidance performance in pulse type electric fish. Bull. Math. Biol. 66 (4), 885-905 (2004).
  14. Post, N., von der Emde, G. The "novelty response" in an electric fish: response properties and habituation. Phys. Behav. 68 (1), 115-128 (1999).
  15. Toerring, M. J., Serrier, J. Influence of water temperature on the electric organ discharge (EOD) of the weakly electric fish Marcusenius cyprinoides (Mormyridae). J. Exp. Biol. 74 (1), 133-150 (1978).
  16. Ardanaz, J. L., Silva, A., Macadar, O. Temperature sensitivity of the electric organ discharge waveform in Gymnotus carapo. J. Comp. Phys. A. 187 (11), 853-864 (2001).
  17. Rodríguez-Cattaneo, A., Pereira, A. C., Aguilera, P. A., Crampton, W. G., Caputi, A. A. Species-specific diversity of a fixed motor pattern: the electric organ discharge of Gymnotus. PLoS One. 3 (5), (2008).
  18. Bennett, M. V. L. Fish physiology. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press. NY. 493-574 (1971).
  19. Wong, C. J. Afferent and efferent connections of the diencephalic prepacemaker nucleus in the weakly electric fish, Eigenmannia virescens: interactions between the electromotor system and the neuroendocrine axis. J. Comp. Neurol. 383 (1), 18-41 (1997).
  20. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Real-time localization of moving dipole sources for tracking multiple free-swimming weakly electric fish. PLoS One. 8 (6), (2013).
  21. Rasnow, B., Assad, C., Hartmann, M. J., Bower, J. M. Applications of multimedia computers and video mixing to neuroethology. J. Neuro. Methods. 76 (1), 83-91 (1997).
  22. MacIver, M. A., Nelson, M. E. Body modeling and model-based tracking for neuroethology. J. Neuro. Methods. 95 (2), 133-143 (2000).
  23. Douglas, R. H., Hawryshyn, C. W. Behavioral studies of fish vision: an analysis of visual capabilities. In The Visual System of Fish. Douglas, R., Djamgoz, M. , Chapman & Hall. London. 373-418 (1990).
  24. Ciali, S., Gordon, J., Moller, P. Spectral sensitivity of the weakly discharging electric fish Gnathonemus petersi using its electric organ discharges as the response measure. J. Fish Biol. 50 (5), 1074-1087 (1997).
  25. Ratledge, D. An Introduction to Webcam Imaging. Digital Astrophotography: The State of the Art. , 31-44 (2005).
  26. Hofmann, V., Sanguinetti-Scheck, J. I., Gómez-Sena, L., Engelmann, J. From static electric images to electric flow: Towards dynamic perceptual cues in active electroreception. J. Phys. Paris. 107, 95-106 (2013).
  27. Castelló, M. E., Aguilera, P. A., Trujillo-Cenóz, O., Caputi, A. A. Electroreception in Gymnotus carapo: pre-receptor processing and the distribution of electroreceptor types. J. Exp. Biol. 203 (21), 3279-3287 (2000).
  28. Caputi, A. A., Castelló, M. E., Aguilera, P., Trujillo-Cenóz, O. Electrolocation and electrocommunication in pulse gymnotids: signal carriers, pre-receptor mechanisms and the electrosensory mosaic. J. Phys. 96 (5), 493-505 (2002).
  29. Pusch, R., et al. Active sensing in a mormyrid fish: electric images and peripheral modifications of the signal carrier. J. Exp. Biol. 211 (6), 921-934 (2008).
  30. Harder, W. Die beziehungen zwischen elektrorezeptoren, elektrischem organ, seitenlinienorganen und nervensystem bei den Mormyridae (Teleostei, Pisces). Z. Vgl. Physiol. 59 (3), 272-318 (1968).
  31. Bacelo, J., Engelmann, J., Hollmann, M., Gvonder Emde,, Grant, K. Functional foveae in an electrosensory system. J. Comp. Neurol. 511 (3), 342-359 (2008).
  32. Hollmann, M., Engelmann, J., Von Der Emde, G. Distribution, density and morphology of electroreceptor organs in mormyrid weakly electric fish: anatomical investigations of a receptor mosaic. J. Zool. 276 (2), 1469-7998 (2008).
  33. Knudsen, E. I. Spatial aspects of electric fields generated by weakly electric fish. J. Comp. Phys. 99 (2), 103-118 (1975).
  34. Kramer, B. Spontaneous discharge rhythms and social signalling in the weakly electric fish Pollimyrus isidori (Cuvier et Valenciennes) (Mormyridae, Teleostei). Behav. Ecol. Sociobiol. 4 (1), 66-74 (1978).
  35. Stoddard, P. K., Markham, M. R., Salazar, V. L., Allee, S. Circadian rhythms in electric waveform structure and rate in the electric fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Physiol. Behav. 90 (1), 11-20 (2007).
  36. Canfield, J. G. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
  37. Chen, L., House, J. L., Krahe, R., Nelson, M. E. Modeling signal and background components of electrosensory scenes. J. Comp. Physiol. A. 191 (4), 331-345 (2005).
  38. Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp. (20), (2008).
  39. Windsor, S. P., Tan, D., Montgomery, J. C. Swimming kinematics and hydrodynamic imaging in the blind Mexican cave fish (Astyanax fasciatus). J. Exp. Biol. 211 (18), 2950-2959 (2008).
  40. Shapiro, L. G., Stockman, G. C. Computer vision. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. 367-368 (2001).
  41. Hedrick, T. L. Software techniques for two- and three-dimensional kinematic measurements of biological and biomimetic systems. Bioinsp. Biomim. 3 (3), 034001 (2001).
  42. Babineau, D., Lewis, J. E., Longtin, A. Spatial acuity and prey detection in weakly electric fish. PLoS Comp. Biol. 3 (3), (2007).
  43. Sanguinetti-Scheck, J. I., Pedraja, E. F., Cilleruelo, E., Migliaro, A., Aguilera, P., Caputi, A. A., Budelli, R. Fish geometry and electric organ discharge determine functional organization of the electrosensory epithelium. PLoS One. 6 (11), (2011).
  44. Castello, M. E., Caputi, A., Trujillo‐Cenóz, O. Structural and functional aspects of the fast electrosensory pathway in the electrosensory lateral line lobe of the pulse fish Gymnotus carapo. J. Comp. Neurol. 401 (4), 549-563 (1998).
  45. Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Y. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1), 127-134 (2004).
  46. Pereira, A. C., Centurión, V., Caputi, A. A. Contextual effects of small environments on the electric images of objects and their brain evoked responses in weakly electric fish. J. Exp. Biol. 208 (5), 961-972 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wyładowanie organu elektrycznegokomora izolacji sensorycznejobrazowanie w podczerwieniprzetwarzanie sygnałówautomatyczne śledzeniespontaniczne zachowaniearena wodnarejestracja wielokanałowa
Długoterminowe śledzenie behawioralne swobodnie pływających ryb o słabym natężeniu elektryczności
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.