Komórki ssaków wyrażające kasetę genu bioluminescencji bakteryjnej (luksy) wytwarzają światło autonomicznie. Wykazano, że uzyskana dynamika bioluminescencyjna po ekspozycji chemicznej odzwierciedla wpływ leczenia na wzrost i metabolizm komórek, dzięki czemu komórki te są niedrogim, ciągłym narzędziem do badań przesiewowych toksyczności w czasie rzeczywistym, które można łatwo dostosować do automatyzacji o wysokiej przepustowości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Autonomicznie bioluminescencyjne komórki ssaków do ciągłego monitorowania cytotoksyczności w czasie rzeczywistym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Testy in vitro na komórkach ssaków były szeroko stosowane jako alternatywa dla testów na zwierzętach do badań toksykologicznych, ale były ograniczone ze względu na wysokie koszty pieniężne i czasowe równoległego przygotowania próbek, które są konieczne ze względu na destrukcyjną naturę metod przesiewowych opartych na lucyferazie świetlika. Ten film opisuje wykorzystanie autonomicznie bioluminescencyjnych komórek ssaków, które nie wymagają destrukcyjnego dodawania substratu lucyferyny, jako niedrogiej i łatwej metody monitorowania cytotoksycznych efektów interesującego związku. Komórki ssaków stabilnie eksprymujące kasetę genu pełnej bioluminescencji bakteryjnej (luxCDABEfrp) autonomicznie wytwarzają sygnał optyczny, który osiąga szczyt przy 490 nm bez dodawania drogiego i prawdopodobnie zakłócającego substratu lucyferyny, wzbudzania przez zewnętrzne źródło energii lub niszczenia próbki, co jest tradycyjnie wykonywane podczas procedur obrazowania optycznego. Ta niezależność od stymulacji zewnętrznej nakłada ciężar utrzymania reakcji bioluminescencyjnej wyłącznie na komórkę, co oznacza, że wynikowy sygnał jest wykrywany tylko podczas aktywnego metabolizmu. Ta cecha sprawia, że linia komórkowa wyrażająca luks jest doskonałym kandydatem do wykorzystania jako biosentinel przeciwko skutkom cytotoksycznym, ponieważ zmiany w produkcji bioluminescencji wskazują na niekorzystny wpływ na wzrost i metabolizm komórek. Podobnie, autonomiczny charakter i brak wymaganego niszczenia próbki pozwala na wielokrotne obrazowanie tej samej próbki w czasie rzeczywistym przez cały okres narażenia na działanie substancji toksycznych i może być wykonywane na wielu próbkach przy użyciu istniejącego sprzętu do obrazowania w sposób zautomatyzowany.
Wprowadzenie
W Stanach Zjednoczonych farmaceutyki i inne produkty przeznaczone do spożycia przez ludzi wymagają szczegółowej oceny, zanim zostaną zatwierdzone do użytku przez Agencję ds. Żywności i Leków. Ciężar finansowy związany z przeprowadzeniem tych testów spoczywana deweloperze1, co znacznie zwiększa koszty opracowania nowego związku, a tym samym przekłada się na wzrost kosztów ponoszonych przez konsumentów. Podczas gdy tradycyjnie większość tych badań przesiewowych wykorzystywała zwierzęta do działania jako proxy dla ludzkich gospodarzy, okazało się to dużym obciążeniem finansowym, z szacunkową kwotą 2,8 miliarda dolarów wydawaną rocznie na same badania przesiewowe ADME/Tox (adsorpcja, dystrybucja, metabolizm, wydalanie i toksyczność)2 i coraz liczniejsze dowody sugerujące, że modele zwierzęce nie mogą wiarygodnie przewidzieć ludzkich reakcji toksykologicznych3. W związku z tym badania in vitro oparte na hodowlach komórek ludzkich zyskały popularność w ciągu ostatnich dwóch dekad ze względu na stosunkowo niższe koszty, wyższą przepustowość i lepszą reprezentację biodostępności i toksykologii u ludzi4. Obecne metody badań przesiewowych toksyczności oparte na hodowlach komórkowych wykorzystują różne punkty końcowe, takie jak pomiar poziomów ATP, badanie przesiewowe aktywności endogennie dostępnych enzymów cytoplazmatycznych, badanie integralności błony komórkowej lub śledzenie poziomu aktywności mitochondriów w celu oceny żywotności komórek5,6. Jednak niezależnie od wybranego punktu końcowego, wszystkie te metody wymagają zniszczenia próbki przed wykonaniem pomiarów, co pozwala uzyskać dane tylko w jednym punkcie czasowym. W rezultacie, duża liczba próbek musi być przygotowywana i traktowana równolegle do podstawowych badań toksykokinetycznych, co ponownie zwiększa koszty i nakład pracy wymagany do opracowania nowego związku. Alternatywnie, opracowano testy wykorzystujące wydzielaną lucyferazy, takie jak Gaussia lucyferazy7, lucyferazy Vargula 8 i lucyferazy Metridia 9, które eliminują potrzebę lizy komórek i wymagają frakcji pożywki do pomiaru punktu końcowego, jednak są one nadal ograniczone do pobierania próbek w określonych punktach czasowych, a także wymagają dodania egzogennych substratów aktywujących światło.
Aby uniknąć szkody związanej z wymaganym niszczeniem próbki, jak również wyeliminować koszty substratów, zaprojektowano ludzką linię komórkową, która wyraża pełną kasetę genu bioluminescencji bakteryjnej (lux) (luxCDABEfrp), aby umożliwić ciągłe monitorowanie żywych komórek, które jest podobne do obrazowania żywych komórek na bazie barwnika fluorescencyjnego, ale bez dodatkowych procedur aktywujących fotony i mikroskopijnych badań. Ta linia komórkowa jest zdolna do konstytutywnego wytwarzania sygnału optycznego do ciągłej, bezpośredniej detekcji bez potrzeby zewnętrznej stymulacji, unikając w ten sposób zniszczenia próbki. Mechanistycznie sygnał bioluminescencyjny generowany przez te komórki powstaje, gdy enzym lucyferazy utworzony przez luxAB katalizuje utlenianie długołańcuchowego aldehydu tłuszczowego (syntetyzowanego i regenerowanego przez produkty genu luxCDE przy użyciu endogennych substratów) w obecności zredukowanego fosforanu ryboflawiny (FMNH2, który jest przetwarzany z FMN przez produkt genu frp) i tlenu cząsteczkowego10. Ekspresja kasety luksów w komórce gospodarza umożliwia zatem wytwarzanie i wykrywanie światła bez niszczenia komórek lub dodawania substratu egzogennego. Podobnie, interakcja między genami luksów a endogennie dostępnymi kosubstratami FMN iO2 oraz wymóg utrzymania środowiska, które może wspierać konwersję FMN do FMNH2, zapewnia, że wynikowy sygnał bioluminescencyjny może być wykryty tylko z żywych, metabolicznie aktywnych komórek.
Te wymagania były wcześniej wykorzystywane do wykazania, że moc bioluminescencyjna oparta na luksach silnie koreluje z wielkością populacji komórkowej11 i że ekspozycja na toksyczne związki upośledza produkcję autobioluminescencyjną w sposób dawka-odpowiedź12. Tutaj używamy wcześniej scharakteryzowanej autobioluminescencyjnej ludzkiej linii komórkowej11 embrionalnej nerki (HEK293), aby zademonstrować zautomatyzowane toksykologiczne badanie przesiewowe antybiotyku z rodziny bleomycyny o znanej aktywności uszkadzającej DNA jako reprezentatywny przykład walidacji zastosowania autobioluminescencyjnych komórek ssaków do testowania toksyczności.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie komórek
- Odzyskaj fiolkę z bioluminescencyjnymi komórkami HEK293 z ciekłego azotu zamrożonego i hoduj je w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Modified Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 0,01 mM aminokwasów endogennych, 1x antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy i 0,01 mM pirogronianu sodu w kolbie do hodowli tkankowej T75 w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
Uwaga: Pożywki i składniki uzupełniające będą się różnić w zależności od linii komórkowych i dlatego należy je odpowiednio dobrać. - Odświeżaj podłoże co 2-3 dni, aż do osiągnięcia ~80% konfluencji.
Uwaga: Wymagana liczba komórek będzie oparta na projekcie eksperymentalnym. W razie potrzeby można uzyskać więcej komórek poprzez subkulturę. - Zbierz komórki do testów.
- Usunąć pożywkę i przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), delikatnie obracając kolbę, a następnie odrzucając zużyty PBS.
- Dodać trypsynę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty lub do momentu, gdy komórki oderwą się od kolby.
- Zebrać oderwane komórki w PBS i przenieść je do czystej probówki wirówkowej.
Uwaga: Jeśli używane są nieprzylegające linie komórkowe, należy oddzielić komórki przez odwirowanie i przemyć raz PBS.
- Określ całkowitą liczbę komórek za pomocą hemacytometru lub innego systemu zliczania komórek.
- Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżym, wstępnie podgrzanym podłożu.
- Zasiać równą liczbę komórek w poszczególnych dołkach nieprzezroczystej płytki wielodołkowej. W tym przykładzie umieść na płytce 5 x 105 komórek w objętości 1 ml do każdego dołka czarnej płytki 24-dołkowej. Umieść równą objętość pożywki w potrójnych studzienkach, aby działała jako kontrola ujemna.
Uwaga: Liczba komórek posianych w każdym dołku jest elastyczna i może być zoptymalizowana pod kątem indywidualnych eksperymentów. Dla każdej bioluminescencyjnej linii komórkowej należy eksperymentalnie określić związek między liczbą komórek a wyjściem bioluminescencyjnym, a także minimalną wykrywalną liczbę komórek przed przystąpieniem do jakichkolwiek testów toksyczności. Aby to zrobić, zmierz bioluminescencję w szerokim zakresie wielkości populacji (na przykład 1 x 103 do 1 x 106 komórek) w standardowych warunkach obrazowania. - Poddaj komórki działaniu związków testowych w sposób opisany poniżej.
2. Przygotowanie chemiczne
- Przygotować badaną substancję chemiczną jako stężony roztwór podstawowy. W tym przykładzie należy użyć roztworu podstawowego 100 mg/ml antybiotyku z rodziny bleomycyny.
Uwaga: W celu zminimalizowania potencjalnych skutków toksycznych opartych na nośniku, zwłaszcza jeśli rozpuszczalnik organiczny jest używany jako nośnik do dodawania chemicznego, zaleca się, aby stężenie podstawowe było co najmniej 1,000 razy większe od pożądanego stężenia po aplikacji. - Dodaj przygotowany wywar chemiczny bezpośrednio do komórek. W tym przykładzie należy dozować badany antybiotyk w końcowych stężeniach 100, 200, 300 i 400 μg/ml w trzech studzienkach. Pozostaw trzy studzienki komórek nietraktowane jako kontrole.
Uwaga: Końcowe stężenie docelowej substancji chemicznej powinno być wybrane w oparciu o konkretne cele doświadczalne. Zwykle bada się szeroki zakres stężeń w celu uzyskania pełnego spektrum skutków toksycznych.
3. Obrazowanie i analiza danych
- Bezpośrednio po dodaniu chemicznym należy umieścić płytkę w komorze obrazowania odpowiedniego przyrządu do akwizycji obrazu i pomiaru bioluminescencji.
- Mierz bioluminescencję co 15 minut przez 24 godziny, używając 10-minutowego czasu integracji dla każdego odczytu.
Uwaga: Czas całkowania użyty w tym przykładzie jest dla każdej płytki i może być dostosowany do pomiaru na podstawie dołka przy użyciu innych wybranych luminometrów. Czas integracji można również dostosować w oparciu o wybraną linię komórek bioluminescencyjnych. Ponieważ bioluminescencja jest wytwarzana autonomicznie, bez niszczenia komórek lub jakiejkolwiek zewnętrznej stymulacji, odczyty mogą być wykonywane w dowolnym punkcie czasowym, aby spełnić określone cele eksperymentalne. - Określ ilościowo intensywność bioluminescencji z każdej studzienki, identyfikując obszar zainteresowania za pomocą kompatybilnego oprogramowania. Wyświetlić strumień świetlny jako całkowity strumień świetlny (fotony/sekundę) lub średnią radiancję (fotony/sekundę/cm2/steridian) każdej próbki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszym badaniu dynamikę autobioluminescencyjnych komórek HEK293 monitorowano w sposób ciągły przez okres 24 h w odpowiedzi na ekspozycję na antybiotyk (Rysunek 1). Toksyczne działanie tego antybiotyku, będącego przedstawicielem rodziny bleomycyny, znanym z zabijania żywych komórek poprzez wiązanie się z DNA i jego rozcinanie13, wykazano poprzez spadek produkcji bioluminescencji w porównaniu z komórkami nieleczonymi, co można bezpośrednio zaobserwować na obrazach w pseudokolorach (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda ta demonstruje wykorzystanie autonomicznie bioluminescencyjnych komórek ssaków jako testu przesiewowego cytotoksyczności in vitro , który umożliwia ciągłe monitorowanie żywych komórek przez całe ich życie. Protokół ten jest elastyczny i może być modyfikowany w celu dostosowania do określonych warunków eksperymentalnych w zależności od potrzeb. Na przykład, przedstawione tutaj doświadczenie nadaje się do śledzenia ostrych skutków toksycznych, ale może być dostosowane do oceny skutków wolno działających lub...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
D.M. Close, S.A. Ripp i G.S. Sayler są założycielami i właścicielami 490 BioTech, Inc.
Podziękowania
Te wysiłki badawcze były wspierane przez National Science Foundation Division of Chemical, Bioengineering, Environmental, and Transport Systems (CBET) pod numerami nagród CBET-0853780 i CBET-1159344 oraz National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) pod numerem nagrody 1R43ES022567-01 oraz National Cancer Institute, Cancer Imaging Program pod numerem nagrody CA127745-01. Instrument IVIS Lumina wykorzystany w tej pracy został pozyskany z U.S. Army Defense University Research Instrumentation Program.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Można również korzystać z innych modeli IVIS i czytników płytek opartych na PMT | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Dostępne są nowsze aktualizacje tego oprogramowania | |
| 75 cm2 Kolby do hodowli komórkowych | Corning | 430641 | |
| 6-dołkowe płytki poddane hodowli tkankowej | Costar | 07-200-83 | |
| płytka 24-dołkowa | Greiner Bio-One | 662174 | 96- lub 384-dołkowe mogą być używane do zastosowań o większej przepustowości |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Hyklon | SH30910 | |
| Zmodyfikowana pożywka Orła firmy Dulbecco (DMEM), bez czerwieni fenolowej | Błona | SH30284 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Hyklon | SH3091003 | |
| Aminokwasy endogenne, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antybiotyk-antybiotyk, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| pirogronian sodu, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocyna, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
Bibliografia
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved? FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441(2010).
- Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Biomedical Sciences and Engineering Conference (BSEC), Mar 15-17, Knoxville, TN, , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441(2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
