Innowacyjna metoda kwantyfikacji egzosomów i pomiaru wielkości

Podsumowanie

W tym artykule przedstawiono metodę izolacji egzosomów z krwi pełnej i dalszej analizy za pomocą śledzenia nanocząstek za pomocą półautomatycznego instrumentu. Prezentowana technologia zapewnia niezwykle czułą metodę wizualizacji i analizy cząstek w ciekłej zawiesinie.

Streszczenie

Chociaż biologiczne znaczenie egzosomów ostatnio zyskało coraz większą uwagę naukową i kliniczną, nadal wiele nie wiadomo na temat ich złożonych szlaków, biodostępności i różnorodnych funkcji w zdrowiu i chorobie. Obecne prace koncentrują się na obecności i zachowaniu egzosomów (zarówno in vitro, jak i in vivo) w kontekście różnych zaburzeń człowieka, zwłaszcza w dziedzinie onkologii, ginekologii i kardiologii.

Niestety, nie ma konsensusu co do złotego standardu izolacji egzosomów, ani nie ma zgody co do takiej metody ich ilościowej analizy. Ponieważ istnieje wiele metod oczyszczania egzosomów, a także wiele możliwości ich analizy ilościowej i jakościowej, trudno jest określić kombinację metod dla idealnego podejścia.

Tutaj demonstrujemy analizę śledzenia nanocząstek (NTA), półautomatyczną metodę charakteryzacji egzosomów po izolacji z ludzkiego osocza za pomocą ultrawirowania. Przedstawione wyniki pokazują, że takie podejście do izolacji, jak również określenie średniej liczby i wielkości egzosomów, dostarcza powtarzalnych i ważnych danych, potwierdzonych innymi metodami, takimi jak skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM).

Wprowadzenie

Dokładna funkcja krążących egzosomów pozostawała nieznana przez długi okres czasu. Nawet teraz pełny mechanizm ścieżki egzosomów nie jest w pełni poznany. Ponieważ egzosomy przenoszą antygeny, białka i RNA (mRNA i miRNA), które wiążą je z komórką rodzicielską, z której pochodzą, ich funkcja jako przekaźników sygnalizacji komórka-komórka została głównie potraktowana priorytetowo.

W literaturze opisano wiele różnych metod izolacji i ilościowego wykrywania egzosomów ^1,2. Nie osiągnięto jednak konsensusu w sprawie "standardu złota". Tymczasem większość naukowców zajmujących się badaniami nad egzosomami zgadza się, że spójna metoda izolacji jest wysoce uzasadniona w celu osiągnięcia wyższego stopnia porównywalności między różnymi raportami i badaniami.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest najpowszechniejszym i najbardziej rozpowszechnionym narzędziem do analizy egzosomów ³. FACS ma tę zaletę, że dzięki znakowaniu fluorescencyjnemu można porównać komórki o różnym pochodzeniu w jednym kroku. Główną wadą FACS jest to, że metoda ta nie jest wystarczająco czuła, aby zidentyfikować cząstki mniejsze niż 0,5 μm ⁴, podczas gdy egzosomy mają na ogół średnicę od 30 do 120 nm ⁵, a nawet mniej, aby zmierzyć ich rozmiar.

Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) to inne narzędzia do analizy wielkości cząstek i morfologii egzosomów. Jednak zarówno SEM, jak i TEM mają tę wadę, że przygotowanie próbek jest czasochłonne, obie metody obejmują pracochłonne etapy i każda z nich wiąże się z pewnym ryzykiem powstania artefaktów. Żadna z tych metod nie jest odpowiednia dla dużej przepustowości próbki i charakterystyki kilku tysięcy pojedynczych cząstek w jednej próbce. Ponadto trudno jest przeprowadzić analizę ilościową w codziennej praktyce klinicznej, w której próbki często muszą być analizowane jednocześnie lub przynajmniej w bardzo krótkim czasie. Techniki nowej generacji pozwalają nam teraz analizować egzosomy bez wcześniejszych intensywnych prac przygotowawczych (np. środowiskowego SEM). Te nowoczesne techniki są nadal raczej niewygodne do analizowania zawiesin o dużej objętości zawierających egzosomy w celu określenia ich średniej liczby i rozkładu wielkości ⁶.

Inną bardzo czułą metodą wizualizacji i analizy egzosomów jest analiza śledzenia nanocząstek (NTA). Metoda ta wykorzystuje dwie różne zasady fizyki. Po pierwsze, cząstki są wykrywane przez światło rozproszone, gdy są naświetlane wiązką laserową. Drugie zjawisko znane jest jako ruch Browna, zgodnie z którym dyfuzja różnych cząstek w ciekłej zawiesinie jest odwrotnie proporcjonalna do ich wielkości. W tym drugim przypadku ruch zależy również od temperatury i lepkości cieczy. Jednak wskaźnik ten jest bezpośrednio związany z wielkością cząstek i jest używany przez NTA. Za pomocą analizy opartej na oprogramowaniu rejestrowane są cyfrowe obrazy światła rozproszonego od pojedynczych cząstek. Wykresy rozproszonych plam świetlnych i ich prędkości ruchu dostarczają danych, które ułatwiają określenie całkowitej liczby cząstek i rozkładu wielkości. Technika ta jest szczególnie skuteczna w analizie cząstek o średniej średnicy mniejszej niż 100 nm.

Pomiary wielkości i stężenia są wykonywane za pomocą mikroskopu do analizy wideo ruchu Browna i elektroforezy ZetaView. Jest to półautomatyczny przyrząd do analizy nanocząstek na biurku dla próbek cieczy (zwany dalej przyrządem do śledzenia cząstek). Składa się z analizatora śledzenia cząstek, a także laptopa z oprogramowaniem służącym do analizy danych. Heterogeniczne próbki biologiczne są tak samo odpowiednie dla tej metody, jak bardziej jednorodne zawiesiny cząstek nieorganicznych. Laserowy mikroskop rozpraszający z kamerą wideo służy do wykrywania cząstek i obserwacji ich ruchu. Podczas gdy oś mikroskopu jest pozioma i skupiona w kanale komórkowym wypełnionym zawiesiną zawierającą egzosomy, wiązka lasera jest zorientowana pionowo. Cząstki napromieniowane laserem rozpraszają światło, które jest rejestrowane pod kątem 90° przez cyfrową kamerę wideo za pomocą mikroskopu (ryc. 1). Natężenie rozproszonego światła pozwala na obserwację cząstek o średnicy większej niż 60 nm. W takim ustawieniu jasność cząstki nie jest jedynym wskaźnikiem wielkości cząstki. Gdy nie stosuje się pola elektrycznego, ruch cząstek odbywa się tylko zgodnie z ruchem Browna i może służyć jako wskaźnik do obliczania wielkości cząstek. Jednak instrument jest również w stanie przyłożyć pole elektryczne do kanału komórkowego. Po poddaniu działaniu tego pola potencjał, biegunowość i poziom ładunku jonowego zawieszonych egzosomów stają się kolejnymi determinantami kierunku ich ruchu. Prędkość i kierunek skutkują histogramem ruchliwości elektroforetycznej.

Znalezienie optymalnej metody analizy izolowanych egzosomów to jeden problem, innym problemem jest skuteczna izolacja egzosomów z różnych mediów, takich jak krew, wodobrzusze, mocz, mleko, płyn owodniowy lub pożywka komórkowa. Do tej pory opisano różne metody, które opierają się na ultrawirowaniu ¹, przemysłowych odczynnikach do separacji (takich jak Exoquick) ⁷, kulkach magnetycznych do antygenu z zastosowaniem separacji ⁸ lub etapach ultrafiltracji ⁹.

W tym protokole demonstrujemy cały proces izolacji egzosomów za pomocą ultrawirowania i pokazujemy, jak analizować powstały egzosom zawierający zawiesinę za pomocą narzędzia do śledzenia cząstek. Przedstawiono szczegółowe rozważania dotyczące analizy egzosomów pochodzących z ludzkiego osocza lub pożywki do hodowli komórkowych.

Protokół

UWAGA: Eksperymenty przedstawione w tej pracy zostały zatwierdzone przez instytucjonalną radę etyczną Uniwersytetu w Düsseldorfie.

1. Przygotowanie egzosomów

1. Zebrać pełną krew do 3 probówek z cytrynianem przez nakłucie dożylne (łącznie 9 ml). Wlej krew do 15 ml probówki Falcon.
2. Odwirować próbkę o masie 1 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu rozpoczęcia oddzielania komórek od osocza. Przenieść supernatant do nowej probówki sokoła o pojemności 15 ml.
3. Odwirować próbkę o masie 2 800 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszystkich komórek z osocza (osocze bezkomórkowe; Dobra Organizacja Rybołówstwa). Przenieść CFP do probówek ultrawirówek, po 1 ml na probówkę.
4. Wirować przy 100 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C w celu wyczerpania egzosomów. Usunąć 900 μl supernatantu. Ponownie zawiesić osad w pozostałych 100 μl w probówce do ultrawirowania. Dodać 900 μl PBS.
5. Ponownie odwirować przy 100 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć 900 μl supernatantu. Ponownie zawiesić osad z pozostałymi 100 μl.
6. Przenieść 5-20 μl zawiesiny do 40 ml wody destylowanej. Przefiltruj zawiesinę przez filtr 450 nm, aby oddzielić egzosomy od większych cząstek. Użyj tej końcowej zawiesiny do pomiaru cząstek.

2. Procedura uruchamiania przyrządu do śledzenia cząstek

1. Uruchom program, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania. Kliknij różne zakładki oprogramowania ("Sprawdzanie komórek", "Pomiar", "Analiza"), aby przełączać się między nimi w całym protokole.
2. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby automatycznie wdrożyć procedurę uruchamiania. Zaznacz pola wyboru zarówno dla kontroli jakości komórki, jak i automatycznego wyrównywania.
   UWAGA: Każdy z tych kroków można powtórzyć osobno, jeśli to konieczne, naciskając przycisk (A) lub (B) na karcie "sprawdzanie komórek".
3. Otwórz otwór wlotowy i wylotowy przyrządu NTA i wstrzyknij 10 ml wody destylowanej za pomocą strzykawki do kanału komórkowego przez port wlotowy. Zamknij port wylotowy, gdy wstrzykiwana jest ostatnia ilość wody. Umieść zlewkę pod portem wylotowym, aby zebrać roztwór odpadowy. Upewnij się, że cela pomiarowa jest wolna od pęcherzyków powietrza i nie wtłaczaj pęcherzyków powietrza do systemu. Natychmiast zamknij port wlotowy.
4. Przeprowadź kontrolę jakości ogniw, klikając "OK". Oprogramowanie wyświetli wyniki jakości ogniw po kilku sekundach.
5. Jeśli jakiekolwiek cząstki są nadal wizualizowane na ekranie podglądu na żywo oprogramowania lub jeśli wynik kontroli jakości jest tylko dobry lub słaby, powtarzaj krok 2.3, aż pozostałe cząstki zostaną usunięte z celi pomiarowej. Powtórz również krok 2.3 po każdym pomiarze, aby uniknąć gromadzenia się cząstek. Jeśli powtórzenie wstrzyknięcia wody destylowanej i sprawdzenia komórek nie daje "dobrego" wyniku, przejdź do 2.9.
6. Przygotować zawiesinę kontrolną zawierającą jednorodne cząstki polistyrenu o wielkości 200 nm, które zostaną użyte do wyrównania ognisk lasera i mikroskopu. Dodać jedną kroplę koncentratu zawiesiny, dostarczonego przez producenta przyrządu, do 500 ml wody destylowanej, aby uzyskać wymagane stężenie, tak aby na ekranie w podglądzie na żywo wyświetlanych było 600 ± 100 cząstek.
7. Wstrzyknąć zawiesinę wystroju do przyrządu NTA zgodnie z opisem w kroku 2.3. Naciśnij "OK", aby rozpocząć automatyczne wyrównywanie, zautomatyzowaną procedurę, dzięki której system automatycznie znajdzie optymalną pozycję dwóch ognisk.
8. Gdy pojawi się monit informujący, że system jest teraz gotowy do eksperymentów, kliknij OK, aby rozpocząć pomiar.
9. Od czasu do czasu należy ręcznie czyścić kanał komórkowy między eksperymentami, przepłukując komórkę 30% roztworem etanolu. Wyczyść kanał za każdym razem, gdy oprogramowanie wyświetla automatyczny raport o błędach.

3. Pomiar próbki

1. Przepłukać kanał wodą destylowaną przed każdym pomiarem próbki (zgodnie z opisem w kroku 2.3).
2. Wstrzyknąć zawiesinę egzosomu (przygotowaną w sekcji 1) do kanału, jak opisano w kroku 2.3.
3. W razie potrzeby dostosuj następujące główne parametry w oprogramowaniu:
   1. czułość. Aby znaleźć optymalny zakres czułości, kliknij przycisk "Liczba cząstek w funkcji czułości", aby wyświetlić krzywą mierzonych cząstek na ekran dla różnych poziomów czułości. Wybierz poziom czułości przed maksymalnym nachyleniem krzywej. Wyższy poziom czułości pozwala na wizualizację większej liczby małych cząstek, ale także zwiększa problemy związane z szumem tła.
   2. Minimalna jasność. Wybierz początkową jasność 20 do pomiaru egzosomu, aby użyć tej funkcji jako filtra. Dostosuj ten parametr do góry, aby wyeliminować cząstki silnie rozpraszające światło. Zmniejsz go, aby wzmocnić słabo rozpraszające artefakty. W razie potrzeby zmieniaj jasność w trakcie eksperymentu.
      UWAGA: Cząstki, które zbyt silnie rozpraszają światło, nakładają się na siebie i mogą zostać omyłkowo wyłączone z analizy.
   3. Minimalny i maksymalny rozmiar. Ustaw filtr cyfrowy, aby wyeliminować szum pikseli i niepożądane rozproszenie spowodowane zbyt dużymi cząstkami, regulując minimalny i maksymalny rozmiar. Użyj zakresu od 10 do 500 pikseli do pomiaru egzosomów.
   4. okiennica. Dostosuj czas otwarcia aparatu na 1/300 sek.
4. Parametry odczytu na żywo:
   1. Przełączaj się między trybem widoku cyfrowego i analogowego w dowolnym momencie, klikając przycisk "Obraz na żywo".
   2. Przez cały czas trwania eksperymentu monitoruj pasek intensywności rozpraszania, który wyświetla stan nasycenia próbki jako wskaźnik oznaczony kolorem. Nie analizuj egzosomów, jeśli pasek rozpraszania jest czerwony. W takim przypadku należy dodatkowo rozcieńczyć próbkę, aby uniknąć tego zjawiska. Jeśli warunki eksperymentalne uniemożliwiają manipulowanie zawiesiną próbki, należy zmniejszyć czułość lub zwiększyć jasność w ustawieniach oprogramowania, aby poprawić wyniki pomiarów.
      UWAGA: Gdy analizowane są próbki o bardzo wysokim stężeniu cząstek, rozproszenie połączy pojedyncze cząstki i zostaną one policzone jako jedna cząstka.
   3. Zwróć uwagę na liczbę cząstek zliczonych w polu widzenia z wyświetlacza.
5. Kliknij zakładkę "Pomiar".
6. Wybierz ustawienia w tablicy "opcje uruchamiania".
   1. Przed każdą akwizycją wybierz opcję "sprawdź ruch", aby powtórzyć test dryfu cząstek. Wykonaj test co najmniej raz przed rozpoczęciem całej analizy. Jeśli dryft jest większy niż 20 μm/s, należy odczekać przed kontynuowaniem pomiaru, aby próbka przestała płynąć.
   2. Wybierz liczbę eksperymentów (5) i opóźnienie czasowe między nimi (0).
   3. W razie potrzeby przeprowadzić "kontrolę wyrywkową". Ten test jest częścią automatycznego wyrównywania w procedurze uruchamiania i może być następnie powtórzony w razie potrzeby.
7. Na koniec kliknij przycisk "uruchom pobieranie wideo". W nowym oknie zdefiniuj liczbę cykli (15) oraz liczbę pozycji pomiarowych (11).
   UWAGA: Głowicę laserową i mikroskop można przesuwać, aby analizować liczbę cząstek w 11 różnych pozycjach. W zależności od zapotrzebowania na eksperyment zdecyduj, czy eksperyment powinien być przeprowadzony na jednej pozycji, czy na różnych pozycjach.
   1. Potwierdź minimalny czas, przez jaki cząstka musi być śledzona, aby została policzona jako pojedyncza cząstka, ustawiając rozdzielczość wideo (niską). Niższa rozdzielczość skutkuje krótszym czasem śledzenia.
   2. Wybierz nazwę pliku i kliknij "OK", aby rozpocząć pomiar.

4. Interpretacja wyników

1. Wyświetl następujące wyniki i parametry wyświetlane po pomiarze w zakładce "wyniki": (1) całkowita liczba śledzonych cząstek, (2) średnia liczba cząstek na pozycję oraz (3) stężenie cząstek.
   1. Proszę zapoznać się z tabelą średnich wyników dla liczbowego stosunku wielkości cząstek (średnicy, powierzchni i objętości) do procentowej liczby cząstek, a także wartości różnicowania średniego i standardowego.
   2. Tabeli analizy wartości szczytowych należy użyć, jeżeli w analizie graficznej występuje więcej niż jeden pik. Poniższa tabela przedstawia rozkład cząstek, które są mniejsze niż pierwszy lub odpowiednio drugi pik.
2. Wyświetl wykres obliczony po pomiarze, aby zobaczyć rozkład cząstek według wielkości. Użyj ikon w trybie wyświetlania i nad wykresem, aby zmienić ustawienia.

Wyniki

Próbka wykorzystana w tej demonstracji wykazuje optymalne ustawienie pomiaru przy czułości 85%, przed maksymalnym nachyleniem krzywej czułości (Rysunek 2). Jasność oraz wartości min/max wybrano zgodnie z zaleceniami zawartymi w protokole. Zmierzono stężenie 5,3 cząstek/ml x 10⁶, natomiast średnia wielkość cząstek wyniosła 0,149 µm, przy czym większość z nich miała wielkość 0,137 µm.

Wartości otrzymane po pomiarze można zapisać w raporcie w formacie pliku .pdf lub jako plik .txt w celu eksportu do bazy danych. Wykres można dostosować według uznania, zgodnie z opisem w protokole (sekcja 4). Sekwencja wideo jest również zapisywana i może być wykorzystana do późniejszej analizy offline. Jednak w takiej analizie offline nie można retrospektywnie zmienić ustawień kamery sprzed akwizycji.

W celu ustalenia optymalnych ustawień parametrów pomiaru, w niniejszym opisie przedstawiamy optymalizację ustawień urządzenia na przykładzie wzorca wielkości z polistyrenu o średnicy 100 nm. Szczegółowo omówiono wpływ dwóch parametrów – czułości oraz minimalnego/maksymalnego rozmiaru – na obraz wideo i rozkład wielkości cząstek. Pozostałe parametry zestawiono w Tabeli 1.

Wizualny efekt wpływu czułości (w zakresie od 50 do 94) na obrazy analogowe i cyfrowe przedstawiono na Rysunku 3. Informacje ilościowe uzyskane z obrazów, oparte na ustawieniach z Tabeli 1 (Min Size = 5 i Max Size = 200), zaprezentowano na Rysunku 4. Typowa zależność liczby wykrytych cząstek od czułości pokazana jest na Rysunku 4A. W zakresie od 50 do 90 liczba wykrytych cząstek wzrastała wraz z czułością, a przy wartościach >90 wzrosła gwałtownie. Optymalny zakres czułości stwierdzono między 66 a 86 (A). Rozkłady wielkości cząstek uzyskane przy różnych ustawieniach czułości przedstawiono na Rysunku 4B. Rozkłady wielkości cząstek reprezentują średnią z trzech pojedynczych pomiarów. Przy zbyt niskiej czułości (sensitivity = 62, krzywa czerwona) przeanalizowano tylko kilka cząstek, co skutkowało dość słabą statystyką. Liczba analizowanych cząstek rosła wraz z czułością i osiągnęła optimum między 70 (krzywa żółta) a 86 (krzywa beżowa). Dalsze zwiększanie czułości doprowadziło do pogorszenia rozkładu wielkości cząstek, przy czym liczba cząstek spadła, a rozkład wielkości przesunął się w stronę mniejszych rozmiarów (sensitivity = 94, krzywa niebieska). Rysunek 4C pokazuje trend średnicy x50 (50% cząstek jest mniejszych od tej średnicy) w funkcji czułości. W przedziale beżowym RSD wielkości cząstek wynosiło mniej niż 8%, co odpowiada przedziałowi optymalnemu na wykresie A. Obszary czerwone wskazują RSD > 8%, co jest wynikiem słabej statystyki (zbyt niska czułość) lub szerokich rozkładów z przesunięciem w stronę mniejszych rozmiarów (zbyt wysoka czułość).

Ustawienia Min Size i Max Size są filtrami stosowanymi do obrazów cyfrowych w celu usunięcia cząstek o rozmiarach plamek mniejszych niż Min Size oraz większych niż Max Size. Dzięki zdolności do rozpraszania światła, cząstka tworzy na obrazie cyfrowym plamkę o określonej wielkości. Rozmiar plamki jest mierzony w liczbie pikseli (px). Gdy cząstka bardzo dobrze rozprasza światło (np. cząstki > 200 nm lub agregaty), rozmiar plamki jest dość duży, np. > 500 px. Rozmiar plamki jest dość mały (np. < 10 px) dla małych cząstek (np. < 20 nm), w zależności od materiału cząstki. Rozmiaru plamki (px) nie należy utożsamiać z rozmiarem cząstki (nm), ponieważ nie są one tożsame i nie istnieje bezpośrednia zależność między tymi dwiema zmiennymi. Optymalizacja Min i Max Size pozwala użytkownikowi odfiltrować niepożądane obiekty, takie jak aglomeraty (Max Size) lub małe obiekty, takie jak szum tła (Min Size). Wpływ Min/Max Size na rozkład wielkości cząstek wzorca o rozmiarze 100 nm przedstawiono na Rysunku 4D (czułość = 82). Gdy przedział jest ustawiony na małe rozmiary plamek (np. min = 1, max = 52; krzywa pomarańczowa), liczba analizowanych cząstek ulega zmniejszeniu, a średnica x50 oparta na liczbie cząstek jest lekko przesunięta w stronę mniejszych rozmiarów. Ustawienie dla większych plamek (min = 40, max = 1,000; krzywa czerwona) skutkuje szerokim rozkładem wielkości cząstek przesuniętym w stronę większych rozmiarów. Aby uzyskać taką samą całkowitą liczbę cząstek, granice przedziału zarówno dla rozkładu pomarańczowego, jak i czerwonego zostały dostosowane do 80 cząstek. Rozkład z optymalnymi ustawieniami (min = 5, max = 200; krzywa brązowa) składa się z 360 cząstek.

Przeprowadzono serię udanych eksperymentów z wykorzystaniem egzosomów wyizolowanych metodą ultrawirowania i zmierzonych za pomocą NTA przy użyciu przedstawionego systemu. Uzyskane dane były wysoce spójne i potwierdziły wysoką powtarzalność. Inne metody izolacji powinny wykazać podobne wyniki. Jednakże etap rozcieńczania został zidentyfikowany jako szczególnie krytyczny i jego wpływ na obliczoną całkowitą liczbę cząsteczek musi zostać ponownie oceniony.

Rysunek 1. Schemat konfiguracji NTA. Oś mikroskopu/wideo i wiązka lasera są zorientowane ortogonalnie względem siebie, przecinając się w przekroju poprzecznym kanału komórkowego. Światło rozproszone przez cząstki jest wyświetlane w oknie „podglądu na żywo” oprogramowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Figura 2. Krzywa zależności liczby cząsteczek od czułości. Krzywa zależności liczby cząsteczek od czułości przedstawia cząsteczki w jednej pozycji w jednym momencie podczas automatycznego skanowania czułości. Ta wizualizacja graficzna służy do określenia optymalnych ustawień dla pomiarów wstępnych. Wartość czułości wybierana jest przed osiągnięciem maksymalnego nachylenia wykresu. Należy pamiętać, że w tym eksperymencie testowym artefakty nie są eliminowane i mogą wpływać na wykres. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Rysunek 3. Wpływ czułości na obraz analogowy i cyfrowy. Wizualizacja cząstek na ekranie podglądu na żywo dla czułości od 50 do 94 zarówno dla widoków analogowych (górny rząd), jak i cyfrowych (dolny rząd). Gdy czułość jest zbyt niska, wykrywane jest tylko kilka cząstek (lewo). Przy optymalnej czułości cząstki pojawiają się jako pojedyncze kropki, dobrze odizolowane od siebie (środek). Przy stosunkowo wysokiej czułości cząstki zlewają się ze sobą, co prowadzi do niskiej jakości obrazu (prawo). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rysunek 4. Wpływ ustawień minimalnej i maksymalnej czułości oraz rozmiaru dla kontrolnej próbki cząstek polistyrenowych 100 nm. (A) Wykres czułości w funkcji liczby wykrytych cząstek; optymalny przedział wynosi od 66 do 86, przed maksymalnym nachyleniem krzywej. (B) Rozkłady wielkości cząstek uzyskane przy kilku ustawieniach czułości (od 62 do 94); wykresy dla zbyt niskiej (62) lub zbyt wysokiej (94) czułości nie oddają rozkładu wielkości cząstek dla kontrolnej próbki polistyrenu 100 nm. (C) Średnica x50 oparta na liczbie cząstek w funkcji czułości; błąd x50 w beżowym przedziale wynosi mniej niż 8%, optymalny przedział to od 66 do 86. (D) Wpływ parametrów Min i Max Size na rozkład wielkości cząstek; optymalne parametry (min = 5 i max = 200) oddają poprawny rozkład dla próbki kontrolnej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Parametry przed akwizycją
Czułość	zmienna
Migawka	40
Częstotliwość klatek	30 kl./s
Rozdzielczość	Wysoki
Cykle	10
Wielokrotne akwizycje	3
Położenie	1
Parametry poakwizycyjne
Minimalna jasność	30
Maksymalny rozmiar	zmienna
Minimalna wielkość	zmienna

Tabela 1. Podsumowanie parametrów przed i po akwizycji dla konfiguracji urządzenia do śledzenia cząsteczek.

Dyskusja

Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji egzosomów z krwi i prezentujemy śledzenie nanocząstek jako nowatorską i innowacyjną metodę pomiaru wielkości i stężenia egzosomów w płynie biologicznym. W prezentowanych eksperymentach jako źródło egzosomów wykorzystano ludzką krew obwodową. Jednak jako materiał badany można również wykorzystać inne źródła, takie jak mocz, plwocina, supernatant z hodowli komórkowych itp .

Opierając się na biologicznej zmienności stężenia egzosomów u ludzi, testy od różnych osób mogą wykazywać niezwykle różne stężenie egzosomów. Jednak stężenie cząstek w sondzie do badań biologicznych może mieć wpływ na wyniki. Dlatego potrzebne jest niezawodne i ustandaryzowane podejście do rozcieńczania sond. W prezentowanej metodzie egzosom zawierający osocze uzyskano z 9 ml obwodowej krwi pełnej. Stosując etapy wirowania różnicowego, osad egzosomu wyizolowano z 1 ml osocza i ponownie zawieszono w 5 ml wody destylowanej, aby uzyskać próbkę roboczą zawieszonych egzosomów. To predefiniowane ustawienie zapewniło nam odpowiednie stężenie cząstek, czyli odpowiednią intensywność rozproszenia podczas NTA. Oprócz aspektu objętości i rozcieńczenia ważny jest również skład stosowanych roztworów. Do ostatecznej re-zawiesiny egzosomów użyliśmy wody destylowanej. Oczywiście, można również użyć różnych pożywek do końcowego etapu rozcieńczania, zgodnie z wymaganiami układu doświadczalnego. Jednak w przypadku pomiarów potencjału zeta roztworów jonowych, szczególnie podczas badania próbek o pojemności buforowej, użyteczne jest rozsądne rozcieńczanie w warunkach wolnych od turbulencji. W celu bezpośredniego porównania wielu próbek zaleca się utrzymanie tego samego poziomu rozcieńczenia dla wszystkich próbek. Wszystkie ustawienia, z wyjątkiem czułości i rozdzielczości wideo, można później zmienić za pomocą oprogramowania ZetaView Analysis.

Jakkolwiek autorzy uważają, że wprowadzony tu system stanowi obecnie najodpowiedniejszy instrument, nie jest on jedynym dostępnym systemem NTA. W wielu poprzednich raportach wykorzystano inne systemy, które stosują te same zasady NTA, ale zapewniają inną konstrukcję instrumentu, która jest zgodna z pewnymi różnymi cechami ¹⁰. Uważamy, że praktyczne aspekty dotyczące obchodzenia się z próbkami i odtwarzalności wyników mają kluczowe znaczenie przy wyborze sekwencji metodologicznej do oceny egzosomów. Uważamy również, że idealny system detekcji powinien eliminować czynniki zależne od użytkownika, które mogą zakłócać wyniki pomiarów. Przedstawione tutaj podejście do analizy egzosomów w wysokim stopniu spełnia kryterium łatwej obsługi. Kolejną zaletą jest to, że półautomatyczna analiza próbek odbywa się w szybkim procesie, co pozwala na uzyskanie wyników w krótkim czasie. Wizualizacja egzosomów online pomaga analizatorowi uzyskać natychmiastowe wyobrażenie o cechach egzosomu, np. stężeniu ogólnym.

Bardzo prostym, ale eleganckim dodatkiem do przedstawionej tutaj techniki pomiarowej jest zastosowanie egzosomów znakowanych przeciwciałami i wychwycenie rozproszonej wiązki laserowej za pomocą poprzedzającego go filtra przed detektorem. W ten sposób subpopulacje egzosomów można rozróżnić na podstawie ich antygenów powierzchniowych i innych biologicznie istotnych cech, które są technicznie dostępne dla selektywnego barwienia fluorescencyjnego.

Jedną z wad obecnej wersji naszego instrumentu do śledzenia cząstek jest fakt, że przy bardzo wysokich poziomach czułości mogą pojawić się artefakty, takie jak szum tła, który opiera się na ścianie kanału komórkowego. W niedalekiej przyszłości może zostać udostępnione rozwiązanie techniczne i ulepszenie obecnego systemu. Dzięki tej metodzie odbicia światła rozproszonego lasera od ścianki kanału zostaną zmniejszone, zwiększając tym samym dokładność mierzonych sygnałów i uzyskanych danych oraz obniżając granicę wykrywalności.

Chociaż obecnie stosowany protokół izolacji egzosomów jest dobrze ugruntowany, a zastosowany instrument do śledzenia cząstek ma niezwykle precyzyjną rozdzielczość przy niższym rozkładzie wielkości wynoszącym 30 nm, nie ma gwarancji, że wykryte cząstki są rzeczywiście całkowicie prawdziwymi egzosomami. Inne cząstki, takie jak martwe fragmenty komórek lub większe kompleksy białkowe, mogą być również obecne w zawiesinie egzosomu i prowadzić do fałszywie dodatnich sygnałów. Jedną z wiarygodnych metod, za pomocą której można wykluczyć takie "zanieczyszczenie", może być mikroskopia elektronowa (EM), zarówno transmisyjna, jak i skaningowa. Niestety, do tej pory nie zidentyfikowano żadnego ogólnego i specyficznego markera egzosomy, chociaż wiele wcześniej zaproponowanych markerów powierzchniowych zyskuje coraz większą uwagę, w tym tetraspanina (Tspan), CD81, C63, CD9 itp. ¹¹.

Niezależnie od przyszłego postępu badań nad biologią egzosomów, szczególnie w odniesieniu do markerów specyficznych dla egzosomów, przedstawiony tutaj protokół zapewni potężną metodę izolacji i wykrywania egzosomów. Koncentrację i rozmiar można łatwo określić w prosty sposób wspomagany oprogramowaniem. Dodanie selektywnych markerów fluorescencyjnych lub przeciwciał sprzężonych z fluoroforem prawdopodobnie jeszcze bardziej wzmocni możliwe zastosowania przedstawionego podejścia NTA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka cytrynianowa	BD	364305	BD Vacutainer
Woda destylowana	Braun	3880087	Aqua ad iniectabilia Rurka
Falcon	Greiner Bio One	188271	PP Probówka, Steryl 15 ml
Probówka do ultrawirówki	Beckman	357448	Microfuge Poliallomer 1,5 ml
Polybead	Polysciences, Inc.	07304	2,6% ciał stałych-lateksu Roztwór wyrównujący
Strzykawka (filtr)	Braun	4617053V	5 ml
(ZetaView)	Igła Braun	4606051V	5 ml
BD		305180	BD Filtr igłowy z napełnianiem
	Sartorius Stedim	16555	Filtr strzykawkowy, hydrofilowy, 450 i mikro;
m Ultrawirówka	Beckman	L8-M	Wirnik: 70Ti Nr seryjny E21078
ZetaView	Particle Metrix	PMX 100, Wirówka typu 101
	Eppendorf	5804R	Wirnik: A-4-44

Strzykawka