Artykuł metodologiczny
Tutaj opisujemy krok po kroku proces generowania wiarygodnych filogenez z zestawów danych sekwencji nukleotydów lub aminokwasów. Niniejszy przewodnik ma na celu służyć naukowcom lub studentom, którzy nie mają doświadczenia w analizie filogenetycznej.
Wielu badaczy, z niezwykle różnych ognisk, stosuje filogenetykę do swoich pytań badawczych. Jednak wielu badaczy jest nowicjuszami w tym temacie, więc wiąże się to z nieodłącznymi problemami. W tym miejscu opracowujemy praktyczne wprowadzenie do filogenetyki dla laików. Przedstawiamy krok po kroku proces generowania wiarygodnych filogenez na podstawie zestawów danych sekwencji genów. Zaczynamy od podręcznika użytkownika narzędzi do wyszukiwania podobieństw za pośrednictwem interfejsów online, a także lokalnych plików wykonywalnych. Następnie badamy programy do generowania wielu dopasowań sekwencji, a następnie protokoły korzystania z oprogramowania do określania najlepiej dopasowanych modeli ewolucji. Następnie nakreślamy protokoły rekonstrukcji powiązań filogenetycznych za pomocą maksymalnego prawdopodobieństwa i kryteriów bayesowskich, a na koniec opisujemy narzędzia do wizualizacji drzew filogenetycznych. Chociaż w żadnym wypadku nie jest to wyczerpujący opis podejść filogenetycznych, dostarcza czytelnikowi praktycznych informacji wyjściowych na temat kluczowych aplikacji komputerowych powszechnie stosowanych przez filogenetyków. Wizja tego artykułu polega na tym, że może on służyć jako praktyczne narzędzie szkoleniowe dla naukowców rozpoczynających badania filogenetyczne, a także służyć jako zasób edukacyjny, który można włączyć do klasy lub laboratorium dydaktycznego.
Aby zrozumieć, jak wyewoluowały dwa (lub więcej) gatunków, najpierw konieczne jest uzyskanie danych sekwencyjnych lub morfologicznych z każdej próbki; dane te reprezentują wielkości, które możemy wykorzystać do zmierzenia ich relacji w przestrzeni ewolucyjnej. Podobnie jak w przypadku pomiaru odległości liniowej, posiadanie większej ilości dostępnych danych (np. mil, cali, mikronów) będzie równoznaczne z dokładniejszym pomiarem. Ergo, dokładność, z jaką badacz może wydedukować odległość ewolucyjną, zależy w dużym stopniu od ilości danych informacyjnych dostępnych do pomiaru relacji. Co więcej, ponieważ różne próbki ewoluują w różnym tempie i za pomocą różnych mechanizmów, metoda, której używamy do pomiaru relacji między dwoma taksonami, również bezpośrednio wpływa na dokładność pomiarów ewolucyjnych. Dlatego, ponieważ relacje ewolucyjne nie są bezpośrednio obserwowane, ale zamiast tego są ekstrapolowane na podstawie danych sekwencyjnych lub morfologicznych, problem wnioskowania o związkach ewolucyjnych staje się problemem statystycznym. Filogenetyka to gałąź biologii zajmująca się stosowaniem modeli statystycznych do wzorców ewolucji w celu optymalnej rekonstrukcji historii ewolucji między taksonami. Ta rekonstrukcja między taksonami jest określana jako filogeneza taksonów.
Aby wypełnić lukę w wiedzy specjalistycznej między biologami molekularnymi a biologami ewolucyjnymi, opisujemy tutaj krok po kroku proces wnioskowania filogenezy z zestawu sekwencji. Po pierwsze, szczegółowo opisujemy kroki związane z przeszukiwaniem bazy danych przy użyciu algorytmu Basic Local Alignment Search Tool (BLAST1) za pośrednictwem interfejsu internetowego, a także przy użyciu lokalnych plików wykonywalnych; jest to często pierwszy krok do uzyskania listy sekwencji podobnych do niezidentyfikowanego zapytania, chociaż niektórzy badacze mogą być również zainteresowani gromadzeniem danych dla pojedynczej grupy za pośrednictwem interfejsów internetowych, takich jak Phylota (http://www.phylota.net/). BLAST to algorytm służący do porównywania danych sekwencji pierwszorzędowych aminokwasów lub nukleotydów z bazą danych sekwencji w celu wyszukania "trafień" przypominających sekwencję zapytania. Program BLAST został opracowany przez Stephena Altschula i wsp. w Narodowym Instytucie Zdrowia (NIH)1. Serwer BLAST składa się z wielu różnych programów, a oto lista niektórych z najpopularniejszych programów BLAST:
i) NUKLEOTYD-nukleotyd BLAST (blastn): Ten program wymaga wprowadzenia sekwencji DNA i zwraca najbardziej podobne sekwencje DNA z bazy danych DNA, które użytkownik określa (np. dla konkretnego organizmu).
ii) BLAST białko-białko (blastp): Tutaj użytkownik wprowadza sekwencję białka, a program zwraca najbardziej podobne sekwencje białek z bazy danych białek, które określa użytkownik.
iii) Iteracyjny BLAST SPECYFICZNY DLA POZYCJI (PSI-BLAST) (blastpgp): Dane wejściowe użytkownika to sekwencja białek, która zwraca zestaw blisko powiązanych białek, a z tego zestawu danych generowany jest konserwatywny profil. Następnie generowane jest nowe zapytanie przy użyciu tylko tych konserwatywnych "motywów", które jest używane do przeszukiwania bazy danych białek, a to zwraca większą grupę białek, z których ekstrahuje się nowy zestaw konserwatywnych "motywów", a następnie wykorzystuje się do przeszukiwania bazy danych białek, aż do przestrojenia jeszcze większego zestawu białek i wygenerowania kolejnego profilu i powtórzenia procesu. Uwzględniając powiązane białka do zapytania w każdym kroku, program ten pozwala użytkownikowi zidentyfikować sekwencje, które są bardziej rozbieżne.
iv) Białko translacyjne nukleotydu w 6 ramkach (blastx): Tutaj użytkownik dostarcza dane wejściowe sekwencji nukleotydów, które są przekształcane w sześcioramkowe produkty translacji koncepcyjnej (tj. obie nici) w bazie danych sekwencji białek.
v) Tłumaczenie 6-ramkowe nukleotydów-6-ramkowe translacje nukleotydów (tblastx): Ten program pobiera dane wejściowe sekwencji nukleotydów DNA i tłumaczy je na wszystkie sześcioramkowe produkty translacji koncepcyjnej, które porównuje z sześcioramkowymi translacjami bazy danych sekwencji nukleotydów.
vi) Translacja 6-ramek białko-nukleotyd (tblastn): Ten program wykorzystuje dane wejściowe sekwencji białka do porównania ze wszystkimi sześcioma ramkami odczytu bazy danych sekwencji nukleotydów.
Następnie opisujemy powszechnie używane programy do generowania Multiple Sequence Alignment (MSA) z zestawu danych sekwencji, a następnie dołączamy przewodnik użytkownika do programów, które określają najlepiej dopasowane modele ewolucji dla zestawu danych sekwencji. Rekonstrukcja filogenetyczna jest problemem statystycznym i z tego powodu metody filogenetyczne muszą uwzględniać ramy statystyczne. Ta struktura statystyczna staje się modelem ewolucyjnym, który uwzględnia zmiany sekwencji w zbiorze danych. Ten model ewolucyjny składa się z zestawu założeń dotyczących procesu podstawiania nukleotydów lub aminokwasów, a najlepiej dopasowany model dla konkretnego zestawu danych można wybrać za pomocą testów statystycznych. Dopasowanie do danych różnych modeli można porównać za pomocą testów ilorazu prawdopodobieństwa (LRT) lub kryteriów informacyjnych w celu wybrania najlepiej dopasowanego modelu z zestawu możliwych. Dwa powszechne kryteria informacyjne to kryterium informacyjne Akaickiego (AIC)2 i bayesowskie kryterium informacyjne (BIC)3. Po wygenerowaniu optymalnego wyrównania istnieje wiele różnych metod tworzenia filogenezy na podstawie wyrównanych danych. Istnieje wiele metod wnioskowania o związkach ewolucyjnych; Ogólnie rzecz biorąc, można je podzielić na dwie kategorie: metody oparte na odległości i metody oparte na sekwencjach. Metody oparte na odległości obliczają odległości parami z sekwencji, a następnie używają tych odległości do uzyskania drzewa. Metody oparte na sekwencjach wykorzystują wyrównanie sekwencji bezpośrednio i zwykle przeszukują przestrzeń drzewa przy użyciu kryterium optymalności. Przedstawiamy dwie oparte na sekwencjach metody rekonstrukcji relacji filogenetycznych: są to PhyML4, która implementuje ramy maksymalnego prawdopodobieństwa, oraz MrBayes5, która wykorzystuje bayesowskie wnioskowanie Monte Carlo łańcucha Markowa. Metody prawdopodobieństwa i bayesowskie zapewniają ramy statystyczne dla rekonstrukcji filogenetycznej. Dostarczając użytkownikowi informacji o powszechnie używanych narzędziach do budowania drzew, zapoznajemy czytelnika z niezbędnymi danymi wymaganymi do wnioskowania o pokrewieństwie filogenetycznym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
1. Podstawowe narzędzie do wyszukiwania wyrównania lokalnego (BLAST): Interfejs online
2. Podstawowe narzędzie do wyszukiwania wyrównania lokalnego (BLAST): Lokalne pliki wykonywalne
3. Generowanie wielu wyrównań sekwencji
4. Określanie najlepiej dopasowanych modeli ewolucji
5. Wnioskowanie filogenezy opartej na sekwencjach na podstawie maksymalnego prawdopodobieństwa lub wnioskowania bayesowskiego
6. Wizualizacja filogenezy
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Znalezienie podobieństw do zapytania pozwala badaczom przypisać potencjalną tożsamość nowym sekwencjom, a także wnioskować o związkach między sekwencjami. Typem wejściowym pliku dla BLAST1 jest sekwencja tekstu w formacie FASTA lub numer dostępu GenBank. Sekwencja w formacie FASTA rozpoczyna się od wiersza opisu oznaczonego znakiem ">" (Rysunek 2). Opis musi następować bezpośrednio po znaku ">", sekwencja (tj. nukleotydy lub aminokwasy) jest zgodna z opisem w następnym wierszu. ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Mamy nadzieję, że ten artykuł posłuży jako punkt wyjścia do prowadzenia badaczy lub studentów, którzy są nowicjuszami w filogenetyce. Projekty sekwencjonowania genomu stały się tańsze w ciągu ostatnich kilku lat, w wyniku czego rośnie zapotrzebowanie użytkowników na tę technologię, a obecnie produkcja dużych zbiorów danych sekwencji jest powszechna w małych laboratoriach. Te zestawy danych często dostarczają naukowcom zestawów genów, które wymagają ram filogenetycznych, aby zacząć rozumieć ich funkcję. Ponadto, ponieważ ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Nie mamy nic do ujawnienia.
Dziękujemy członkom laboratorium O'Halloran za komentarze do manuskryptu. Dziękujemy Wydziałowi Nauk Biologicznych Uniwersytetu George'a Washingtona i Columbian College of Arts and Sciences za dofinansowanie dla D. O'Hallorana.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie