Artykuł metodologiczny

Izolacja żywotnych gruczołów wielokomórkowych z tkanki rośliny mięsożernej, Dzbanecznik

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50993

⸱

22 grudnia 2013

 ,  ,  , 
1Laboratoire Agronomie et Environnement, Université de Lorraine, 2Department of Bioorganic Chemistry, Max Planck Institute for Chemical Ecology, 3aura optik

W tym artykule

Podsumowanie

Gruczoły roślinne to wyspecjalizowane struktury odpowiedzialne za biosyntezę i wydzielanie wielu związków biorących udział w interakcjach ze środowiskiem biotycznym. Aby umożliwić badania nad ich cechami molekularnymi i biochemicznymi, opracowano technikę mechanicznego mikroprzygotowania w celu wyizolowania pojedynczych gruczołów aktywnych metabolicznie, w tym przypadku z mięsożernej rośliny Nepenthes.

Streszczenie

Wiele roślin posiada wyspecjalizowane struktury, które są zaangażowane w produkcję i wydzielanie specyficznych związków i białek o niskiej masie cząsteczkowej. Struktury te są prawie zawsze zlokalizowane na powierzchniach roślin. Wśród nich są nektarniki lub trichomy gruczołowe. Wydzielane związki są często wykorzystywane w interakcjach ze środowiskiem biotycznym, na przykład jako atraktanty dla zapylaczy lub środki odstraszające roślinożerców.

Gruczoły, które są unikalne pod wieloma względami, można znaleźć u roślin mięsożernych. U tak zwanych dzbaneczników z rodzaju Nepenthes, dwufunkcyjne gruczoły wewnątrz pułapki z jednej strony wydzielają płyn trawienny, w tym wszystkie enzymy niezbędne do trawienia ofiary, a z drugiej strony pobierają uwolnione składniki odżywcze. Tak więc gruczoły te reprezentują idealną, wyspecjalizowaną tkankę predestynowaną do badania leżących u podstaw molekularnych, biochemicznych i fizjologicznych mechanizmów wydzielania białek i pobierania składników odżywczych przez rośliny. Co więcej, ogólnie rzecz biorąc, biosynteza związków wtórnych wytwarzanych przez wiele roślin wyposażonych w struktury gruczołowe może być badana bezpośrednio w gruczołach.

Aby pracować nad takimi wyspecjalizowanymi strukturami, muszą one być izolowane skutecznie, szybko, metabolicznie aktywne i bez zanieczyszczenia innymi tkankami. W związku z tym opracowano technikę mechanicznego mikropreparatyki, którą zastosowano do badań nad płynem trawiącym Dzbanecznik. W niniejszej pracy przedstawiono protokół, który został wykorzystany do skutecznego przygotowania pojedynczych gruczołów dwufunkcyjnych z pułapek Nepenthes, w oparciu o zmechanizowaną platformę mikropróbkowania. Gruczoły mogą być izolowane i bezpośrednio wykorzystywane do analizy ekspresji genów za pomocą technik PCR po przygotowaniu RNA.

Wprowadzenie

Rośliny wytwarzają ogromną różnorodność związków o różnych zastosowaniach przemysłowych i farmaceutycznych, od cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej po polimery. Związki te są często produkowane i wydzielane przez wysoce wyspecjalizowane struktury, z których wiele znajduje się na powierzchni roślin, takie jak trichomy gruczołowe lub nektarniki, lub wewnątrz, jak odpowiednio idioblasty czy kanały mleczne i żywiczne. Wiadomo jednak stosunkowo niewiele o biologii tych wyspecjalizowanych struktur wydzielniczych, mimo że wszystkie rodzaje tych gruczołów wykazują wiele cech wskazujących na aktywny metabolizm. W szczególności gruczoły roślin mięsożernych, takich jak Nepenthes, mogą być traktowane jako systemy modelowe w biologii komórki roślinnej1.

Rośliny mięsożerne są przedmiotem licznych badań od 1875 roku, kiedy opublikowano dzieło Charlesa Darwina pt. „Insectivorous Plants”2. Jednak badania na poziomie molekularnym prowadzono dopiero w ciągu ostatnich kilku lat i nasza wiedza w tym zakresie jest wciąż ograniczona. Na przykład skład białkowy płynu trawiennego w dzbankach roślin z rodzaju Nepenthes nie jest jeszcze w pełni znany. Dopiero niedawno zidentyfikowano kilka białek hydrolitycznych, a także kilka odpowiadających im genów3. W pułapkach wpadkowych Nepenthes (Rysunek 1), wielokomórkowe gruczoły znajdują się w wewnętrznej części dna dzbanków. Gruczoły te odpowiadają zarówno za produkcję i wydzielanie enzymów trawiennych do płynu w dzbanku, jak i za wchłanianie rozpuszczonych substancji odżywczych z tego płynu4. Zatem te dwufunkcyjne gruczoły stanowią unikalną mikrotkankę o kluczowym znaczeniu i funkcji w procesie mięsożerności Nepenthes , co czyni je wartymi szczegółowych badań.

Anatomia rośliny mięsożernej, szczegół dzbanka Nepenthes, studium botaniczne, mechanizm pułapki, adaptacja.
Rycina 1. Dzbanek Nepenthes alata. Dolna część dzbanka zawiera płyn trawienny oraz gruczoły znajdujące się wewnątrz. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

W naukach o roślinach wiele podejść eksperymentalnych opiera się na „materiale zbiorczym”, ponieważ nie bada się w nich określonej tkanki, lecz całe organy. W konsekwencji ich homogenizacja i analiza mogą dostarczyć jedynie wyników, które są rozcieńczone i proporcjonalne w stosunku do poszczególnych tkanek i komórek5. Aby rozwiązać ten problem, opracowano techniki mikropreparacji, na przykład tak zwaną mikrodysekcję laserową (LCM), które z sukcesem wykorzystywano do pozyskiwania specyficznych tkanek roślinnych i analizy ich indywidualnej zawartości6. Jednakże LCM jest często ograniczona, gdy celem są niestabilne i/lub szybko degradujące składniki komórkowe, takie jak RNA. W takim przypadku wadą jest konieczność wcześniejszej fiksacji tkanki, która jest czasochłonna i często wiąże się z degradacją biomolekuł. Co więcej, ze względu na wysoką zawartość wody w wielu tkankach roślinnych oraz wytrzymałość ścian komórkowych, LCM często zawodzi przy preparowaniu bezpośrednio ze świeżej tkanki7. Każde podejście do badania składników komórkowych obecnych w gruczołach wydzielniczych — od genów, mRNA i białek po związki wtórne i ich biosyntezę — wymaga alternatywnych technik specyficznej preparatyki. Zatem niezbędne są specjalistyczne metody izolacji pojedynczych komórek lub nawet wielokomórkowych gruczołów, które pozostają nienaruszone po preparacji.

W niniejszej pracy przedstawiono metodę wykorzystującą zmechanizowaną platformę do mikropróbkowania, która umożliwia bezpośrednią wizualizację mikroskopową. Technika ta jest szybka i wydajna w przygotowywaniu pojedynczych gruczołów z dzbanów gatunków Nepenthes. Te wielokomórkowe gruczoły są dwufunkcyjne, i.e. uczestniczą zarówno w procesach wydzielania, jak i pobierania; są one osiadłe, a nieeksponowane warstwy komórek są impregnowane w celu utworzenia endodermy. Całe gruczoły mogą zostać wyizolowane bez sąsiednich tkanek i w precyzyjny sposób umieszczone w probówce PCR. Technika ta jest stosowana do badania konkretnych genów, a także ekspresji genów w tkankach gruczołów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie materiału roślinnego

  1. Wszystkie gatunki Dzbaneczników były uprawiane w szklarniach MPI for Chemical Ecology lub w Ogrodzie Botanicznym w Jenie w Niemczech.
  2. W celu przygotowania tkanki wydzielającej należy pobrać dzbanek i usunąć górną jedną trzecią, w tym pokrywkę, perystom i strefę śliskości. Dzbanek może być używany zarówno świeży, jak i zamrożony w ciekłym azocie i przechowywany w temperaturze -80 °C.

2. Mikrodysekcja tkanki dzbanka

  1. Platforma do mikropróbkowania składa się z mikroskopu stereoskopowego i mikromanipulatora, który jest bezpośrednio przymocowany do korpusu mikroskopu i jest obsługiwany za pomocą joysticka 3D. W tym przypadku wykorzystano wczesny prototyp aureki, jak udokumentowano (ryc. 2A).
  2. Do preparacji gruczołów wydzielniczych z dzbanów Dzbanecznika użyj mikrokleszczyków i przymocuj je do manipulatora (ryc. 2A i 2B).
  3. W celu ekstrakcji RNA należy potraktować wszystkie narzędzia (żyletki, pęsetę, mikromanipulator, mikrokleszcze, szkiełko do przedmiotów) za pomocą RNaseZAP.
  4. Przygotuj probówki zbiorcze, dodając 9 μl wody wolnej od nukleaz i 1 μl inhibitora RNazy do probówki PCR do ekstrakcji RNA. Do bezpośredniego PCR z próbek tkanek należy używać wyłącznie wody wolnej od nukleaz (10 μl).
    1. Weź świeży lub zamrożony dzbanek i usuń 1-2cm2 kawałek tkanki zawierającej gruczoły wydzielnicze za pomocą żyletki i pęsety. Umyj chusteczkę wodą; dodać 0,1% dietylopirowęglanu (DEPC), jeśli RNA ma być ekstrahowane.
    2. Przymocuj materiał roślinny za pomocą dwustronnej taśmy klejącej na szkiełku przedmiotowym (powierzchnia pokryta dławikiem powinna być skierowana do góry, rysunki 2C i 2D) i zabezpiecz szkiełko taśmą klejącą na uniwersalnym stoliku, który należy przykleić za pomocą ruchomego stołu.
    3. Do ekstrakcji kwasów nukleinowych preparat należy wykonać na lodzie. Dlatego weź płaskie pudełko styropianowe, umieść w nim uniwersalny stolik zawierający próbkę i napełnij pudełko lodem. Następnie umieść pudełko pod mikroskopem.
    4. Do przygotowania bardzo ważne jest ułożenie gruczołów. Gruczoły wydzielnicze są częściowo zakryte kapturem ochronnym (ryc. 3) i dostępne tylko przez kleszcze z jednej strony. Ponadto kąt nachylenia próbki do kleszczy należy wyregulować, przechylając stół stolika uniwersalnego o około 135°, w zależności od gatunków Dzbaneczników.
    5. Mikrodysekcja odbywa się pod kontrolą wizualną. Do izolacji gruczołów użyj filtra innego niż UV, aby ograniczyć degradację DNA i RNA.
    6. Przesuń mikromanipulator i kleszcze za pomocą panelu sterowania do wybranego dławika. Po dotarciu do gruczołu umieść każde ramię kleszczy po obu stronach gruczołu. Usuń gruczoł z pozostałej tkanki, zamykając kleszcze (ryc. 4A).
    7. Skieruj gruczoł przymocowany do kleszczy z dala od przedmiotu i do probówki zbiorczej. Doprowadź same końcówki kleszczy do kontaktu z roztworem w probówce (Rysunek 4B). Należy dobrze obserwować uwalnianie gruczołu poprzez otwarcie kleszczy, ponieważ gruczoły mają tendencję do przyklejania się do końcówki narzędzia. Tkanka może być przechowywana w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji PCR lub RNA.

3. Bezpośrednia amplifikacja PCR z tkanki dzbanecznika

  1. Aby udowodnić skuteczność metody przygotowania, można przeprowadzić podejście PCR bezpośrednio z tkanki gruczołu bez etapu ekstrakcji DNA.
  2. Do amplifikacji PCR należy użyć starterów specyficznych dla genu; tutaj kodując sekwencję białka podobnego do taumatyny (TLP) (do przodu: 5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3', odwrotnie: 5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAACACAAC-3').
    1. Zbierz 1-5 gruczołów w probówce PCR zawierającej 10 μl wody wolnej od nukleaz. Do reakcji 50 μl dodać 5 μl 10x buforu Taq, 1 μl 10 mM trifosforanów deoksynukleozydów (dNTP), 3 μl 25 mM MgCl2, 0,4 μl (1,25 U) polimerazy DNA Taq, 1 μl (100 pmol) każdego startera i 28,6 μl wody wolnej od nukleaz
      2. .
    2. Przeprowadzić reakcje PCR w termocyklerze z następującym programem: początkowa denaturacja 94 °C przez 3 minuty, 35 cykli denaturacji (94 °C przez 30 sekund), wyżarzanie (59 °C przez 30 sekund) i przedłużenie (72 °C przez 1 minutę) i końcowy etap przedłużania trwający 10 minut w temperaturze 72 °C.
    3. Udowodnić amplifikację produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Dlatego użyj 1,5% (w/v) agarozy i rozpuść ją w 1x buforze TAE (40 mM zasady Tris, 20 mM lodowatego kwasu octowego, 1 mM EDTA, pH 8). Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści. Do 100 ml roztworu agarozy dodać 1 μl bromku etydyny (10 μg/μl) w celu dalszej wizualizacji. Uruchom żel w 1x buforze TAE przy napięciu 300 V, 115 mA przez około 20 minut w komorze elektroforetycznej. Prawidłowy rozmiar amplikonu TLP musi wynosić 690 pz.

4. Ekstrakcja RNA z małych próbek tkanek i odwrotna transkrypcja

  1. Wykonaj następujące czynności na lodzie. Do ekstrakcji RNA zastosowano dwie metody ekstrakcji: Micro Kit do ekstrakcji całkowitego RNA oraz zestaw do izolacji mRNA nakładany za pomocą kulek magnetycznych.
  2. Zebrać co najmniej 30 gruczołów wydzielniczych za pomocą mikropreparatu do probówki PCR zawierającej 1 μl inhibitora RNazy i 9 μl wody wolnej od nukleaz. Następnie poddać elektrolizie tkankę w termocyklerze przez 10 minut w temperaturze 75 °C.
  3. Ekstrakcja całkowitego RNA.
    1. Po przygotowaniu dodać 90 μl roztworu do lizy do próbki i inkubować przez 10 minut w temperaturze 75 °C. Następnie załadować mieszaninę reakcyjną do kolumny (dostarczonej z zestawem) i postępować zgodnie z etapami płukania opisanymi w instrukcji producenta.
    2. Eluować RNA dwa razy odpowiednio 10 μl roztworu elucyjnego i kontynuować leczenie DNazą I.
    3. Do 20 μl wyekstrahowanego RNA dodać 2 μl 10x buforu DNazy I i 1 μl DNazy I (dostarczonej z zestawem do ekstrakcji RNA) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję dodając 2 μl odczynnika do inaktywacji DNazy i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Po etapie wirowania przez 1,5 minuty z maksymalną prędkością, RNA można przenieść do świeżej probówki wolnej od RNazy. Oznaczyć stężenie RNA w każdej próbce za pomocą spektrofotometru. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Ekstrakcja mRNA za pomocą kulek magnetycznych.
    1. Dostosować objętość próbki do 100 μl za pomocą buforu do lizy/wiązania (dostarczanego w zestawie) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 75 °C. Dodać 20 μl kulek magnetycznych dostarczonych z zwisem Oligo (dT)25 i mieszać reakcję przez 5 minut w temperaturze pokojowej. mRNA wiąże się przez ogon poli(A) z zwisem oligonukierykulkowym (dT)25 kulek.
    2. Wykonaj etapy płukania mRNA związanego z kulkami magnetycznymi, postępując zgodnie z protokołem producenta. Roztwory można usuwać za pomocą magnesu. Ponownie zawiesić kulki w 20 μl 10 mM buforze Tris-HCl (pH 7,5).
    3. Usunąć zanieczyszczenia genomowego DNA, traktując próbkę 2U (1 μl) DNazy (2 μl 10x bufor DNazy i 17 μl wody wolnej od nukleaz) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie roztwór enzymu jest usuwany przez magnes, a kulki są ponownie zawieszane w 20 μl 10 mM buforu Tris-HCl. Nie jest możliwe zmierzenie stężenia RNA, ponieważ jest ono przyczepione do kulek. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
  5. Do odwrotnej transkrypcji użyj zestawu do syntezy cDNA. Reakcje przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta.
    1. Do odwrotnej transkrypcji całkowitego RNA dodać 1 μl (100 pmol) startera Oligo (dT)20 lub 1 μl (0,4 μg) losowych heksamerów, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl 10 mM dNTP Mix do 1 μg RNA i dostosować objętość do 14 μl wodą wolną od nukleaz. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie umieścić próbki na lodzie. Dodaj 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl odwrotnej transkryptazy i 4 μl buforu 5x RT. Reakcje inkubuje się przez 55 minut w temperaturze 50 °C, a następnie następuje etap inaktywacji w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Po odwrotnej transkrypcji próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
    2. W przypadku mRNA związanego z kulkami magnetycznymi należy zastąpić bufor Tris-HCl pierwszą mieszanką reakcyjną (1 μl inhibitora RNazy, 1 μl 10 mM dNTP Mix i 12 μl wody wolnej od nukleaz) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 65 °C. Ze względu na zwis kulek Oligo (dT)25 nie jest konieczne dodawanie do próbek startera Oligo (dT)20 ani heksamerów losowych. Następnie postępuj zgodnie z powyższym protokołem (krok 4.5.1).
    3. Zmierz stężenie cDNA za pomocą spektrofotometru. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

5. PCR w czasie rzeczywistym

  1. Do analiz za pomocą Real-time PCR należy użyć całkowitego RNA wyekstrahowanego za pomocą Micro Kit i SYBR Green QPCR Master Mix. Aby zapewnić równą liczbę transkryptów, dostosuj stężenie cDNA w każdej próbce do tej samej wartości po odwrotnej transkrypcji.
  2. Oprócz próbek wstawia się reakcje kontrolne. Użyj kontroli bez szablonu, aby przesiać odczynniki pod kątem zanieczyszczeń i sprawdzić jakość starterów. Aby zweryfikować brak genomowego DNA, należy przeprowadzić kontrolę inną niż RT. Obie reakcje powinny być ujemne (brak sygnału fluorescencji) w Real-time PCR.
  3. Aby zagwarantować równy poziom transkryptu między różnymi próbkami, należy użyć co najmniej jednego genu referencyjnego. Użyto tu zaprojektowanych par starterów kodujących aktynę (przód: 5'-CTCTTAACCCCAAAGCAAACAGG-3', rewers: 5'-GTGAGAGAACAGCCTGGATG-3') oraz 18SrRNA (do przodu: 5'-CTTGATTCTATGGGGTGGTG-3', odwrotnie: GTTAGCAGGCTGAGGTCTC-3'). Jako gen docelowy wybrano TLP (przód: 5'- GTGGGCAACAATTGGACCCAG-3', odwrócony: 5'-CATTCGATCCGGAAAGGCTAC-3'). Wielkość każdego amplifikowanego fragmentu wynosiła około 100 pz.
  4. Aby uzyskać reakcję 25 μl, dodać 12,5 μl 2x SYBR Green QPCR Master Mix, cDNA (≥20 ng), 400 nM każdego startera i 30 nM pasywnego barwnika referencyjnego ROX (dostarczonego z zestawem). Dostosować objętość próbki do 25 μl za pomocą wody wolnej od nukleaz.
  5. Reakcje przeprowadzono w termocyklerze QPCR z następującym programem: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 10 minut w celu uaktywnienia polimerazy; 40 cykli denaturacji (95 °C przez 30 sekund), wyżarzanie (61 °C przez 60 sekund) i wydłużanie (72 °C przez 1 min), a następnie krzywa dysocjacji (95 °C przez 60 sekund, 55 °C przez 30 sekund, 95 °C przez 30 sekund). Krzywa dysocjacji jest niezbędna do określenia braku dimerów starterów, które można wykryć za pomocą dodatkowego piku.
  6. Określ skuteczność (E) każdej reakcji PCR przy użyciu metody Liu i Saint8. Wydajność można odchylić od liniowej części krzywej wzmocnienia. Tutaj względna liczba amplikonów (Rn, A) jednego punktu cyklu (CPA) jest powiązana z ilością amplikonów (Rn, B) innego cyklu (CPB).
  7. Analizuj wyniki PCR w czasie rzeczywistym za pomocą narzędzia programowego do wyrażeń względnych (REST 2009, http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html) lub podobnego oprogramowania. Użyj programu, aby obliczyć współczynnik ekspresji genu w próbce poddanej działaniu substancji w porównaniu z kontrolą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu przygotowania pojedynczych gruczołów z tkanki dzbanka Nepenthes opracowano i zastosowano zmechanizowaną technikę mikrodysekcji. Platforma do mikropreparacji musi być wyposażona w mikropincetę przymocowaną do mikromanipulatora, który z kolei jest obsługiwany za pomocą panelu sterowania. Pojedyncze gruczoły, widoczne pod mikroskopem, można było namierzyć pincetą, która chwytała tkankę gruczołową i usuwała ją mechanicznie (Rycina 4A).

Tkankę gruczołową przeniesion...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przez długi czas badania struktur wydzielniczych roślin, w szczególności trichomów, były prowadzone głównie na podstawie anatomii i miały charakter czysto opisowy. Istnieje duża liczba publikacji tego typu, które zostały podsumowane w recenzjach9-11. Nasza biochemiczna i molekularna wiedza na temat struktur wydzielniczych roślin jest nadal ograniczona, pomimo pewnych wczesnych godnych uwagi prac, np. nad włoskami gruczołowymi mięty, które wykazały, że trichomy gruczołowe są miejscem biosyntezy monoter...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy zespołowi szklarniowemu z MPI-CE w Ogrodzie Botanicznym Uniwersytetu Friedricha Schillera w Jenie za uprawę roślin oraz Wilhelmowi Bolandowi i Towarzystwu Maxa Plancka za wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RNAqueous-Micro KitLife Technologies GmbH, NiemcyAM1931Izolacja całkowitego RNA, 50 próbek
Dynabeads mRNA DIRECT Micro KitLife Technologies GmbH, Niemcy610115 ml magnesu Dynabeads Oligo (dT)25
DynaMag-2Life Technologies GmbH, Niemcy12321D
SuperScript CellsBezpośredni systemsyntezy cDNALife Technologies GmbH, Niemcy18080-20025 reakcji
RNaseOUTLife Technologies GmbH, Niemcy10777-019Inhibitor rnazy, 5,000 jednostek
Hexamery losowe (0,4 μ g/μ l)QIAGEN GmbH, Niemcy79236100 μ l
10 mM dNTP Mix, klasa biologii molekularnejFermentas GmbH, NiemcyR01921 ml
Taq polimeraza DNA, (rekombinowana)Fermentas GmbH, NiemcyEP0402Dostarczany z 10x buforem Taq (z KCl lub (NH4)2SO4) i 25 mM MgCl2
TURBO DNaseLife Technologies GmbH, NiemcyAM22381,000 jednostek
AgarozaCarl Roth GmbH Co. NiemcyT846.3
GeneRuler Low Range DNA ladder, gotowa do użyciaFermentas GmbH, NiemcySM119350 μ g
Brilliant II SYBR Green QPCR Master MixAgilent Technologies, Inc., USA600828Pojedynczy zestaw
RNaseZAPSigma-Aldrich, Taufkirchen, NiemcyR2020
ŻyletkaCarl Roth GmbH Co., NiemcyCK08.1
PęsetaCarl Roth GmbH Co., Niemcy2801.1 / 2855.1
GE Spektrofotometr NanoVueGE Healthcare Europe GmbH, Niemcy28-9569-62
Mastercycler gradientEppendorf AG, Hamburg, Niemcy5331 000.010
Mx3000P System PCR w czasie rzeczywistymStratagene, USA401403
Agagel Standardowa pozioma komora do elektroforezy żelowejBiometraWycofane z produkcji
MikromanipulatorAura Optik GmbHAurekaWyposażony w mikrokleszczyki
Mikroskop stereoskopowyCarl Zeiss Microscopy, Jena, NiemcySteREO Lumar.V12Wyposażony w zestaw filtrów AxioCam
Lumar 01Carl Zeiss, Mikroskopia, Jena, Niemcy485001-0000-000Filtr UV
Lumar Zestaw filtrów 09Carl Zeiss, Mikroskopia, Jena, Niemcy485009-0000-000filtr bez UV

Bibliografia

  1. Adlassnig, W., Peroutka, M., Land, I., Lichtscheidl, I. K. Glands of carnivorous plants as a model system in cell biological research. Acta Bot. Gall. 152, 111-124 (2005).
  2. Darwin, C. Insectivorous plants. , John Murray. London. (1875).
  3. Mithöfer, A. Carnivorous pitcher plants: Insights in an old topic. Phytochemistry. 72, 1678-1682 (2011).
  4. Owen Jr., T. P., Lennon, K. A., Santo, M. J., Anderson, A. N. Pathways for nutrient transport in the pitchers of the carnivorous plant. Nepenthes alata Ann. Bot. 84, 459-466 (1999).
  5. Brandt, S. P. Microgenomics: gene expression analysis at the tissue-specific and single-cell levels. J. Exp. Bot. 56, 495-505 (2005).
  6. Hölscher, D., Schneider, B. Application of laser-assisted microdissection for tissue and cell-specific analysis of RNA, proteins, and metabolites. Prog. Bot. 69, 141-167 (2008).
  7. Rottloff, S., Müller, U., Kilper, R., Mithöfer, A. Micropreparation of single secretory glands from the carnivorous plant Nepenthes. Anal. Biochem. 394, 135-137 (2009).
  8. Liu, W. H., Saint, D. H. A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics. Anal. Biochem. 302, 52-59 (2002).
  9. Werker, E. Trichome diversity and development. Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 1-35 (2000).
  10. Fahn, A. Structure and function of secretory cells. Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 37-75 (2000).
  11. Juniper, B. E., Robins, R. J., Joel, D. M. The carnivorous plants. , Academic Press. London. (1989).
  12. Gershenzon, J., McCaskill, D., Rajaonarivony, J., Mihaliak, C., Karp, F., Croteau, R. Isolation of secretory-cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic-studies of monoterpenes and other gland products. Anal. Biochem. 200, 130-138 (1992).
  13. Rontein, D., Onillon, S., et al. CYP725A4 from yew catalyzes complex structural rearrangement of taxa-4(5),11(12)-diene into the cyclic ether 5(12)-oxa-3(11)-cyclotaxane. J. of Biol. Chem. 283 (5), 6067-6075 (2008).
  14. Aharoni, A., Jongsma, M. A., Bouwmeester, H. J. Volatile science? Engineering of terpenoid biosynthesis in plants. Trends Plant Sci. 10, 594-602 (2005).
  15. Mithöfer, A., Boland, W., Maffei, M. E. Chemical ecology of plant-insect interactions. Ann. Plant Rev. 34, 261-291 (2009).
  16. Kennedy, G. G. Tomato pests, parasitoids, and predators: Tritrophic interactions involving the genus Lycopersicon. Ann. Rev. Entomol. 48, 51-72 (2003).
  17. Mithöfer, A., Boland, W. Plant defense against herbivores: Chemical aspects. Ann. Rev. Plant Biol. 63, 431-450 (2012).
  18. Rottloff, S., Stieber, R., Maischak, H., Turini, F. G., Heubl, G., Mithöfer, A. Functional characterization of a class III acid endochitinase from the traps of the carnivorous pitcher plant genus, Nepenthes. J. Exp. Bot. 62, 4649-4647 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Gruczo y Nepenthesmechaniczne mikropr bkowanieizolacja gruczo wfiksacja tkanekekstrakcja RNAilo ciowy PCRanaliza ekspresji gen wproteomikametabolomika

Powiązane artykuły