Gruczoły roślinne to wyspecjalizowane struktury odpowiedzialne za biosyntezę i wydzielanie wielu związków biorących udział w interakcjach ze środowiskiem biotycznym. Aby umożliwić badania nad ich cechami molekularnymi i biochemicznymi, opracowano technikę mechanicznego mikroprzygotowania w celu wyizolowania pojedynczych gruczołów aktywnych metabolicznie, w tym przypadku z mięsożernej rośliny Nepenthes.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja żywotnych gruczołów wielokomórkowych z tkanki rośliny mięsożernej, Dzbanecznik
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wiele roślin posiada wyspecjalizowane struktury, które są zaangażowane w produkcję i wydzielanie specyficznych związków i białek o niskiej masie cząsteczkowej. Struktury te są prawie zawsze zlokalizowane na powierzchniach roślin. Wśród nich są nektarniki lub trichomy gruczołowe. Wydzielane związki są często wykorzystywane w interakcjach ze środowiskiem biotycznym, na przykład jako atraktanty dla zapylaczy lub środki odstraszające roślinożerców.
Gruczoły, które są unikalne pod wieloma względami, można znaleźć u roślin mięsożernych. U tak zwanych dzbaneczników z rodzaju Nepenthes, dwufunkcyjne gruczoły wewnątrz pułapki z jednej strony wydzielają płyn trawienny, w tym wszystkie enzymy niezbędne do trawienia ofiary, a z drugiej strony pobierają uwolnione składniki odżywcze. Tak więc gruczoły te reprezentują idealną, wyspecjalizowaną tkankę predestynowaną do badania leżących u podstaw molekularnych, biochemicznych i fizjologicznych mechanizmów wydzielania białek i pobierania składników odżywczych przez rośliny. Co więcej, ogólnie rzecz biorąc, biosynteza związków wtórnych wytwarzanych przez wiele roślin wyposażonych w struktury gruczołowe może być badana bezpośrednio w gruczołach.
Aby pracować nad takimi wyspecjalizowanymi strukturami, muszą one być izolowane skutecznie, szybko, metabolicznie aktywne i bez zanieczyszczenia innymi tkankami. W związku z tym opracowano technikę mechanicznego mikropreparatyki, którą zastosowano do badań nad płynem trawiącym Dzbanecznik. W niniejszej pracy przedstawiono protokół, który został wykorzystany do skutecznego przygotowania pojedynczych gruczołów dwufunkcyjnych z pułapek Nepenthes, w oparciu o zmechanizowaną platformę mikropróbkowania. Gruczoły mogą być izolowane i bezpośrednio wykorzystywane do analizy ekspresji genów za pomocą technik PCR po przygotowaniu RNA.
Wprowadzenie
Rośliny wytwarzają ogromną różnorodność związków o różnych zastosowaniach przemysłowych i farmaceutycznych, od cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej po polimery. Związki te są często produkowane i wydzielane przez wysoce wyspecjalizowane struktury, z których wiele znajduje się na powierzchni roślin, takie jak trichomy gruczołowe lub nektarniki, lub wewnątrz, jak odpowiednio idioblasty czy kanały mleczne i żywiczne. Wiadomo jednak stosunkowo niewiele o biologii tych wyspecjalizowanych struktur wydzielniczych, mimo że wszystkie rodzaje tych gruczołów wykazują wiele cech wskazujących na aktywny metabolizm. W szczególności gruczoły roślin mięsożernych, takich jak N....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie materiału roślinnego
- Wszystkie gatunki Dzbaneczników były uprawiane w szklarniach MPI for Chemical Ecology lub w Ogrodzie Botanicznym w Jenie w Niemczech.
- W celu przygotowania tkanki wydzielającej należy pobrać dzbanek i usunąć górną jedną trzecią, w tym pokrywkę, perystom i strefę śliskości. Dzbanek może być używany zarówno świeży, jak i zamrożony w ciekłym azocie i przechowywany w temperaturze -80 °C.
2. Mikrodysekcja tkanki dzbanka
- Platforma do mikropróbkowania składa się z mikroskopu stereoskopowego i mikromanipulatora, który jest bezpośrednio przymocowany do korpusu mik....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu przygotowania pojedynczych gruczołów z tkanki dzbanka Nepenthes opracowano i zastosowano zmechanizowaną technikę mikrodysekcji. Platforma do mikropreparacji musi być wyposażona w mikropincetę przymocowaną do mikromanipulatora, który z kolei jest obsługiwany za pomocą panelu sterowania. Pojedyncze gruczoły, widoczne pod mikroskopem, można było namierzyć pincetą, która chwytała tkankę gruczołową i usuwała ją mechanicznie (Rycina 4A).
Tkankę gruczołową przeniesion.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przez długi czas badania struktur wydzielniczych roślin, w szczególności trichomów, były prowadzone głównie na podstawie anatomii i miały charakter czysto opisowy. Istnieje duża liczba publikacji tego typu, które zostały podsumowane w recenzjach9-11. Nasza biochemiczna i molekularna wiedza na temat struktur wydzielniczych roślin jest nadal ograniczona, pomimo pewnych wczesnych godnych uwagi prac, np. nad włoskami gruczołowymi mięty, które wykazały, że trichomy gruczołowe są miejscem biosyntezy monoter.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy zespołowi szklarniowemu z MPI-CE w Ogrodzie Botanicznym Uniwersytetu Friedricha Schillera w Jenie za uprawę roślin oraz Wilhelmowi Bolandowi i Towarzystwu Maxa Plancka za wsparcie.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RNAqueous-Micro Kit | Life Technologies GmbH, Niemcy | AM1931 | Izolacja całkowitego RNA, 50 próbek |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit | Life Technologies GmbH, Niemcy | 61011 | 5 ml magnesu Dynabeads Oligo (dT)25 |
| DynaMag-2 | Life Technologies GmbH, Niemcy | 12321D | |
| SuperScript CellsBezpośredni system | syntezy cDNALife Technologies GmbH, Niemcy | 18080-200 | 25 reakcji |
| RNaseOUT | Life Technologies GmbH, Niemcy | 10777-019 | Inhibitor rnazy, 5,000 jednostek |
| Hexamery losowe (0,4 μ g/μ l) | QIAGEN GmbH, Niemcy | 79236 | 100 μ l |
| 10 mM dNTP Mix, klasa biologii molekularnej | Fermentas GmbH, Niemcy | R0192 | 1 ml |
| Taq polimeraza DNA, (rekombinowana) | Fermentas GmbH, Niemcy | EP0402 | Dostarczany z 10x buforem Taq (z KCl lub (NH4)2SO4) i 25 mM MgCl2 |
| TURBO DNase | Life Technologies GmbH, Niemcy | AM2238 | 1,000 jednostek |
| Agaroza | Carl Roth GmbH Co. Niemcy | T846.3 | |
| GeneRuler Low Range DNA ladder, gotowa do użycia | Fermentas GmbH, Niemcy | SM1193 | 50 μ g |
| Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix | Agilent Technologies, Inc., USA | 600828 | Pojedynczy zestaw |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy | R2020 | |
| Żyletka | Carl Roth GmbH Co., Niemcy | CK08.1 | |
| Pęseta | Carl Roth GmbH Co., Niemcy | 2801.1 / 2855.1 | |
| GE Spektrofotometr NanoVue | GE Healthcare Europe GmbH, Niemcy | 28-9569-62 | |
| Mastercycler gradient | Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy | 5331 000.010 | |
| Mx3000P System PCR w czasie rzeczywistym | Stratagene, USA | 401403 | |
| Agagel Standardowa pozioma komora do elektroforezy żelowej | Biometra | Wycofane z produkcji | |
| Mikromanipulator | Aura Optik GmbH | Aureka | Wyposażony w mikrokleszczyki |
| Mikroskop stereoskopowy | Carl Zeiss Microscopy, Jena, Niemcy | SteREO Lumar.V12 | Wyposażony w zestaw filtrów AxioCam |
| Lumar 01 | Carl Zeiss, Mikroskopia, Jena, Niemcy | 485001-0000-000 | Filtr UV |
| Lumar Zestaw filtrów 09 | Carl Zeiss, Mikroskopia, Jena, Niemcy | 485009-0000-000 | filtr bez UV |
Bibliografia
- Adlassnig, W., Peroutka, M., Land, I., Lichtscheidl, I. K. Glands of carnivorous plants as a model system in cell biological research. Acta Bot. Gall. 152, 111-124 (2005).
- Darwin, C. Insectivorous plants. , John Murray. London. (1875).
- Mithöfer, A.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
