Artykuł metodologiczny

Ocena odpowiedzi miogennej i wazoaktywności w opornych tętnicach krezkowych za pomocą miografii ciśnieniowej

17.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50997

⸱

6 lipca 2015

 ,  ,  , 
1Section of Gastroenterology and Hepatology, Georgia Regents University, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Vascular Biology Center, Georgia Regents University

W tym artykule

Podsumowanie

Miografia ciśnieniowa służy do oceny wazoaktywności małych tętnic, które rozwijają trwałe zwężenie pod wpływem ciśnienia. Manuskrypt ten zawiera szczegółowy protokół oceny w izolowanych odcinkach małych tętnic krezkowych u szczurów, wazoaktywności i wpływu ciśnienia śródświetlnego na średnicę naczyń krwionośnych.

Streszczenie

Tętnice o małym oporze zwężają się i rozszerzają odpowiednio w odpowiedzi na zwiększone lub zmniejszone ciśnienie śródświetlne; to zjawisko znane jako reakcja miogenna jest kluczowym regulatorem lokalnego przepływu krwi. W warunkach izobarycznych w tętnicach z małym oporem rozwija się trwałe zwężenie znane jako ton miogenny (MT), które jest głównym wyznacznikiem ogólnoustrojowego oporu naczyniowego (SVR). W związku z tym preparaty ciśnieniowe ex vivo tętnic o małym oporze są głównymi narzędziami do badania funkcji mikrokrążenia w stanach zbliżonych do fizjologicznych. Aby to osiągnąć, świeżo wyizolowany nienaruszony odcinek małej tętnicy oporowej (średnica ~260 μm) jest montowany na dwóch małych szklanych kaniulach i poddawany ciśnieniu. Te preparaty tętnicze zachowują większość cech in vivo i umożliwiają ocenę napięcia naczyniowego w czasie rzeczywistym. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół oceny wazoaktywności w tętnicach krezkowych o małym oporze pod ciśnieniem u szczurów; w tętnicach tych rozwija się trwałe zwężenie naczyń krwionośnych - około 25% maksymalnej średnicy - pod ciśnieniem 70 mmHg. Te preparaty tętnicze mogą być wykorzystywane do badania wpływu badanych związków na związek między ciśnieniem wewnątrztętniczym a wazoaktywnością oraz do określania zmian w funkcji mikronaczyniowej w zwierzęcych modelach różnych chorób.

Wprowadzenie

Małe tętnice oporowe są głównymi determinantami SVR i odgrywają ważną rolę w patofizjologii wielu chorób1,2. Stany takie jak cukrzyca3, ciąża4, niedokrwienie i reperfuzja5, otyłość i nadciśnienie6,7 są często związane ze zmienioną funkcją mikrokrążenia. Miografia naczyniowa może nie tylko dostarczyć ważnych informacji na temat zmian w funkcjonowaniu mikronaczyń krwionośnych w różnych chorobach, ale także pomóc w identyfikacji celów terapeutycznych i ocenie skuteczności związków wazoaktywnych. Czynność naczyń krwionośnych badano przy użyciu izolowanych małych tętnic w warunkach izometrycznych lub izobarycznych8. Szczegółowy opis miografii izometrycznej znajduje się w innym miejscu9. Istnieją jednak różnice w danych uzyskanych z preparatów izometrycznych i izobarycznych10-12. Ponieważ preparaty tętnicze pod ciśnieniem pozwalają na badanie funkcji mikrokrążenia w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, uzyskane wyniki mogą lepiej korelować z zachowaniem łożyska naczyniowego in vivo 8,13.

W 1902 roku Bayliss po raz pierwszy opisał wpływ nacisku przezściennego na średnicę naczyń krwionośnych14. Zaobserwował w małych tętnicach oporowych z różnych łożysk naczyniowych królików, kotów i psów, że po spadku ciśnienia następuje rozszerzenie naczyń krwionośnych, a po wzroście ciśnienia następuje zwężenie naczyń krwionośnych. Zjawisko to jest znane jako reakcja miogenna. Bayliss i późniejsi badacze zaobserwowali, że w warunkach izobarycznych małe tętnice oporowe rozwijają trwałe zwężenie znane jako MT15,16. Zarówno odpowiedź miogenna, jak i MT można ocenić za pomocą techniki miografii uciskowej (PM). PM służy przede wszystkim do określania wazoaktywności małych tętnic, żył i innych naczyń. Oprócz oceny wpływu związków wazoaktywnych na średnicę naczyń krwionośnych, PM - jak sama nazwa wskazuje - służy do oceny zmian średnicy naczyń krwionośnych, w których pośredniczy ciśnienie wewnątrznaczyniowe. W ciągu ostatnich kilku dekad postęp w oprogramowaniu komputerowym, który usprawnił mikroskopię wideo i wyciąganie szklanych pipet, sprawił, że PM jest łatwiejszy do wykonania. Jednak preparacja żywotnych, nienaruszonych segmentów małych naczyń krwionośnych pozostaje żmudna, a czasem trudna. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół badania odpowiedzi miogennej w małych tętnicach oporności krezkowej wyizolowanych od szczurów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przykłady pokazane tutaj pochodzą z eksperymentów zatwierdzonych przez IACUC na Georgia Regents University - Protokół nr: # 2011-0408

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotowanie roztworu zapasowego do sekcji: Aby przygotować 500 ml roztworu zapasowego do sekcji (5x), rozpuścić 21,18 g NaCl, 0,875 g KCl, 0,739 g MgSO4, 1,049 g MOPS oraz 0,019 g EDTA w 450 ml wody Milli-Q. Dostosować pH do poziomu 7,3-7,4 przy użyciu 1 N NaOH. Uzupełnić objętość do 500 ml wodą Milli-Q. Roztwór zapasowy można przechowywać przez 7-10 dni. Listę odczynników i ich dostawców przedstawiono w Tabeli 1. Stężenia w mM podano w Tabeli 2.
  2. Przygotowanie roboczego roztworu do sekcji: Roboczy roztwór do sekcji należy przygotowywać codziennie. Aby otrzymać 100 ml roztworu roboczego, rozpuścić 0,091 g glukozy, 0,016 g NaH2PO4 oraz 0,022 g pirogronianu sodu w 79,8 ml wody Milli-Q. Dodać 0,2 ml 1M CaCl2 oraz 20 ml roztworu zapasowego do sekcji, aby uzyskać objętość 100 ml.
  3. Przygotowanie fizjologicznego roztworu soli (PSS): Aby przygotować 1 000 ml PSS, rozpuścić 0,365 g KCl, 6,545 g NaCl, 0,296 g MgSO4, 0,163 g KH2PO4, 2,072 g glukozy, 2,184 g NaHCO3 oraz 2,383 g HEPES w 950 ml wody Milli-Q. Dostosować pH do poziomu 7,3-7,4 przy użyciu 1 N NaOH. Uzupełnić objętość do 1 000 ml wodą Milli-Q. Odlać 2 ml roztworu i zastąpić go 2 ml 1 M CaCl2. (Świeży PSS musi być przygotowywany codziennie)
  4. Przygotowanie PSS wolnego od wapnia (Ca2+): Aby przygotować 100 ml PSS bez Ca2+, rozpuścić 0,036 g KCl, 0,654 g NaCl, 0,029 g MgSO4, 0,016 g KH2PO4, 0,207 g glukozy, 0,218 g NaHCO3, 0,238 g HEPES, 0,015 g EGTA oraz 0,0026 g nitroprusydu sodu (SNP) w 95 ml wody Milli-Q. Dostosować pH do poziomu 7,3-7,4 przy użyciu 1 N NaOH. Uzupełnić objętość do 100 ml wodą Milli-Q.

2. Przygotowanie kaniul szklanych

  1. Wytocz pipety szklane w celu przygotowania kaniul o końcówkach o średnicy 100-150 μm, używając wyciągacza do pipet zgodnie z wytycznymi producenta.
  2. Ukosz końcówki szklanych kaniul za pomocą urządzenia do skosowania mikroelektrod, wypoleruj je ogniowo i zagnij końcówki kaniul pod kątem ~45°, używając sondy grzewczej.
  3. Umieść kaniule w uchwycie do mikropipet, a następnie zamocuj uchwyt do mikropipet w komorze perfuzyjnej.

3. Przygotowanie komory perfuzyjnej

  1. Przepłucz komorę perfuzyjną wodą Milli-Q, a następnie roztworem do sekcji, przez 5 min w każdym przypadku. Napełnij komorę 2 ml roztworu do sekcji.
  2. Odsuń roztwór do sekcji przez kaniulę za pomocą strzykawki 10 ml i ostrożnie wypełnij całą kaniulę oraz dołączony przewód, dbając o brak pęcherzyków powietrza. Stosuj ssanie delikatnie, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków.
  3. Przygotuj dwie szwy, wykonując w każdym z nich półwęzeł za pomocą pęsety tępej. Ponieważ do przygotowania węzłów o średnicy zaledwie 1-2 mm używane są nylonowe monofilamentowe szwy okulistyczne (10-0, 0.2 metric), może być wymagane użycie mikroskopu sekcyjnego.
  4. Obserwując pod mikroskopem sekcyjnym, użyj pęsety sekcyjnej, aby załadować obie kaniule częściowo zawiązanymi węzłami szwów, umieszczając je nieco powyżej końcówki. Następnie węzły te zostaną ostrożnie nasunięte na kaniulowane końce tętnic i całkowicie zaciśnięte.

4. Pobieranie splotu tętnic krezkowych u szczurów Sprague-Dawley

  1. Przed przeprowadzeniem tych eksperymentów należy uzyskać zgodę lokalnej Komisji ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC). Zwierzęta należy przetrzymywać w zwierzęciu z kontrolowaną temperaturą i oświetleniem, zapewniając swobodny dostęp do wody i komercyjnej karmy dla gryzoni.
  2. Szczury należy znieczulić poprzez doszczepne wstrzyknięcie ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Głębokość znieczulenia należy potwierdzić testem uszczypnięcia palca, a w razie potrzeby podać dodatkowe środki znieczulające.
  3. Po potwierdzeniu znieczulenia chirurgicznego zwierzę należy uśmiercić poprzez dekapitację. Należy postępować zgodnie z wytycznymi AAALAC dotyczącymi stosowania odpowiednich metod eutanazji zwierząt.
  4. Za pomocą nożyczek anatomicznych i pincety należy przeprowadzić laparotomię w linii pośrodkowej od miednicy do mostka. Operację tę wykonuje się w dwóch etapach: najpierw nacinając skórę, a następnie nacinając leżącą pod nią warstwę mięśniową. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić narządów jamy brzusznej.
  5. Przeciąć proksymalny koniec jelita blisko zwieracza od strony od strony odroby oraz koniec dystalny blisko połączenia kątnico-jączkowe. Oba końce należy oddzielnie podwiązać, aby zapobiec wyciekowi treści pokarmowej i kału, unikając tym samym zanieczyszczenia zewnętrznego roztworu kąpieli. Przeciąć krezkę u podstawy, w pobliżu naczyń doprowadzających, i.e. tętnicy krezkowej górnej, i przenieść całe łoże krezkowe jelita cienkiego do zlewki o pojemności 50 ml zawierającej lodowaty roztwór do sekcji.
  6. Pozostawić pobraną tkankę w lodowatym roztworze do sekcji przez 5 min, a następnie wypłukać świeżym roztworem do sekcji w celu usunięcia krwi.

5. Izolacja i kanulacja tętnicy krezkowej 4.go rzędu

  1. Przymocuj proksymalny koniec jelita po prawej stronie w naczyniu powleczonym Sylgardem. Rozciągnij pozostałą część jelita w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, przypinając segment tak, aby rozsunąć krezówkę i odsłonić naczynia krwionośne (Rysunek 1). Uwaga: Segmenty tętnic izolujemy w temperaturze pokojowej. W innym przypadku naczynie zawierające łuki tętnic krezkowych umieszczamy na lodzie. Niektóre laboratoria, w tym w naszej instytucji, wykorzystują chłodzieńiki do preparowania tętnic w temperaturze 4 °C.
  2. Pod stereozoomikroskopem wypreparuj małe tętnice krezkowe 3rd i 4th rzędu (~260 μm) biegnące równolegle do jelita cienkiego, używając małych nożyczek. Najpierw usuń całą otaczającą tkankę tłuszczową. Następnie wypreparuj żyłę i wyizoluj tętnicę w miejscu rozgałęzienia w kształcie litery V. Należy uważać, aby nie przebić wybranego segmentu. Rozpocznij usuwanie tłuszczu w pobliżu rozgałęzienia 2nd rzędu i dotrzyj do naczyń 3rd lub 4th rzędu.
    1. Uwaga: Tętnice i żyły można rozróżnić na podstawie grubości ich ścian – ściana tętnicy jest grubsza niż ściana żyły. Ponadto, gdy przyległą tkankę łączną delikatnie pociągnie się prostopadle do naczyń, żyły łatwo się zapadają, natomiast tętnice nie. Ponieważ tętnice o średnicy światła <400 μm są głównymi miejscami oporu naczyniowego systemowego, w tym protokole zastosowano tętnice krezkowe szczura 4th rzędu (średnica światła <300 μm).
  3. Wyizoluj odcinek tętnicy o długości 4-5 mm równolegle do jelita cienkiego. Zlokalizuj wszystkie rozgałęzienia 5th rzędu wchodzące do jelita cienkiego i przetnij je nieco oddalenie od miejsca ich odejścia, zachowując ich fragmenty. Zachowane fragmenty rozgałęzień służą jako punkty uchwytu (za pomocą pęsety anatomicznej) podczas przenoszenia segmentów tętnic do komory perfuzyjnej, a następnie ułatwiają ich kanulację.
  4. Następnie przetnij segmenty tętnic, wykonując dwa nacięcia dystalnie względem rozgałęzień 5th rzędu po każdej stronie tętnicy, i przenieś je do komory perfuzyjnej (patrz Rysunek 1C i legenda).
  5. Zalkanuluj jeden koniec naczyń za pomocą szklanej mikropipety (średnica: 100-150 μm), przytrzymując końce segmentu tętnicy pęsetą anatomiczną. Nasuń wcześniej przygotowaną, częściowo zawiązaną sznurówkę chirurgiczną na zalkanulowany koniec i zabezpiecz ją. Uwaga: Proksymalny koniec tętnicy może zostać zalkanulowany na szklaną kaniulę połączoną z serwomechanizmem regulującym ciśnienie, aby odwzorować środowisko in situ.
  6. Podłącz strzykawkę 10 ml wypełnioną roztworem do preparowania do kurka połączonego z tą kaniulą w taki sposób, aby roztwór w rurce łączącej kaniulę z kurkiem połączył się z roztworem w strzawce. Delikatnie unieś strzykawkę. Siła grawitacji działająca na roztwór usunie krew naczyniową z otwartego końca naczynia. Po usunięciu krwi wewnątrz tętnicy zamknij kurek.
    Uwaga: Alternatywnie można podłączyć kurek do kontrolera ciśnienia, włączyć go i delikatnie zwiększyć ciśnienie do 5-10 mm Hg, aby uzyskać ten sam efekt.
  7. Przywiąż dystalny koniec naczyń do drugiej szklanej kaniuli, starannie zbliżając drugą kaniulę jak najbliżej niezwiązanego końca segmentu tętnicy. Nasuń wcześniej przygotowaną, częściowo zawiązaną sznurówkę chirurgiczną na zalkanulowany koniec i zabezpiecz ją. Należy uważać, aby nie szarpać ani nie ciągnąć segmentów tętniczych. Upewnij się, że kurki przymocowane do obu kaniul są zamknięte.
  8. Przenieś komorę perfuzyjną na stolik mikroskopu odwróconego wyposażonego w system zapisu wideo na żywo.
  9. Połącz kurek kaniuli przywiązanej do proksymalnego końca segmentu tętniczego z serwomechanizmem regulującym ciśnienie i upewnij się, że kurek przymocowany do drugiej kaniuli pozostaje zamknięty, aby utrzymać stabilne ciśnienie wewnątrz światła.
  10. Następnie podłącz rurkę próżniową do portu ssącego, a rurkę perfuzyjną do portu perfuzyjnego komory.
    Uwaga: Port z igłą ściętą służy do ssania, a port z igłą tępą do perfuzji.
  11. Rozpocznij perfuzję naczynia ciepłym PSS poprzez pojedynczy przepływowy podgrzewacz roztworów (37 °C, nasycony mieszaniną gazów: 5% CO2, 5% O2  i 90% N w celu utrzymania neutralnego pH i odpowiedniego natlenienia17) z prędkością 2 ml/min przy użyciu pompy perystaltycznej. Włącz również próżnię. Umieść termistor w komorze, aby stale monitorować temperaturę.
  12. Gdy temperatura PSS w komorze zbliży się do ~37 °C (zazwyczaj w ciągu 5 min), powoli zwiększ ciśnienie wewnątrz światła z 20 do 100 mmHg i sprawdź, czy naczynia nie mają przecieków. Wykonuje się to za pomocą automatycznego ustawienia ciśnienia w regulatorze ciśnienia. Odrzuć naczynia z przeciekami i zastąp je innym segmentem. Naczynia z przeciekami nie będą w stanie utrzymać ciśnienia.
  13. Oceń segment tętniczy pod kątem zagięć, utrzymując ciśnienie na poziomie 100 mmHg. Używając dźwigni śrubowej, przesuń kaniulę, aby wyprostować segment tętniczy. Nie rozciągaj nadmiernie segmentów tętniczych; celem jest odwzorowanie długości segmentu tętniczego in vivo.
  14. Obniż ciśnienie do 70 mmHg (aby odwzorować ciśnienie in vivo w łukach tętnic krezkowych18) i pozwól segmentowi tętniczemu ustabilizować się i rozwinąć tonus miogenny. Tętnice mogą być poddawane różnemu ciśnieniu (40-70 mmHg) w zależności od strategii eksperymentalnej i łoża naczyniowego. Wcześniej opublikowany przegląd stanowi doskonałe źródło informacji na temat zmienności tonusu miogennego w segmentach tętnic z różnych łoży naczyniowych8.

6. Pomiar średnicy tętnicy

  1. Obserwuj tętnice przy użyciu obiektywu 10X w mikroskopie wyposażonym w monochromatyczną kamerę CCD. Zmierz średnicę światła naczynia, wykorzystując system przechwytywania klatek wideo oraz system detekcji krawędzi w czasie rzeczywistym. Lista wykorzystanego sprzętu znajduje się w Tabeli 3.
  2. Monitoruj i zapisuj średnicę naczynia w sposób ciągły.
  3. Obserwuj rozwój MT. Uwaga: Zaobserwowaliśmy, że w krezowych tętnicach oporowych szczura, przy ciśnieniu 70 mmHg, rozwój MT charakteryzuje się spadkiem średnicy o ok. 20%. MT różni się w zależności od łoża naczyniowego i gatunku zwierzęcia.
  4. Potwierdź żywotność naczyń, oceniając reakcje skurczowe i rozkurczowe na 1 μM fenylefryny (Phe) oraz 1 μM acetylocholiny (ACh).
  5. Na koniec każdego eksperymentu wyznacz średnicę pasywną (PD), inkubując tętnice w PSS pozbawionym Ca2+ przez 20 min.

7. Odpowiedź miogenna

  1. Obniżyć ciśnienie do 20 mm Hg i poczekać na stabilizację średnicy. Zwiększać ciśnienie wewnątrzświatłowe stopniowo (20, 40, 60, 80 i 100), pozwalając tętnicom na osiągnięcie stabilnej średnicy przy każdym stopniu ciśnienia (zazwyczaj w ciągu 5 min).
  2. Obniżyć ciśnienie wewnątrzświatłowe do 20 mmHg i inkubować segment tętnicy w PSS wolnym od Ca2+, zawierającym 0,39 mM EGTA oraz 0,1 mM SNP. Poczekać na stabilizację średnicy tętnicy (zazwyczaj 15 min).
  3. Powtórzyć reakcję na stopnie ciśnienia w PSS wolnym od Ca2+, zawierającym 0,39 mM EGTA oraz 0,1 mM SNP.

8. Interpretacja wyników i obliczenia danych

  1. Oblicz MT jako procentową różnicę w średnicy zaobserwowaną dla PSS zawierającego Ca2+ w porównaniu z PSS pozbawionym Ca2+ przy każdym ciśnieniu, zgodnie z poniższym obliczeniem:
    Wzór równowagi statycznej, analiza zmiany średnicy tętnicy, obliczenie stosunku, równanie, dane badawcze.
  2. W przypadku tętnic wykazujących wasomotorykę średnicę można obliczyć, wyciągając średnią z fazy plateau przez 1 min. Przedstaw zebrane dane jako procent maksymalnego rozkurczu (%PD) zgodnie z zależnością: %PD = 100 x [ΔD/PD]; ΔD to różnica między średnicą przed i po dodaniu badanego związku (np. Phe); PD to średnica pasywna (równocześnie średnica maksymalna).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schematyczny rysunek typowego układu myografu ciśnieniowego przedstawiono na Rysunku 1. Oba końce naczynia zostają kaniulowane za pomocą szklanej mikropipety i zabezpieczone szwami po obu stronach. Poprzez przewody i otwarty kurek jedna kaniula jest połączona z serwo-regulatorem ciśnienia; druga kaniula jest połączona z zamkniętym kurkiem. Komora jest perfundowana roztworem PSS, a zmiany średnicy naczynia są obserwowane za pomocą mikroskopu odwróconego połączonego z kamerą CCD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytyczne kroki, rozwiązywanie problemów i modyfikacje

W typowym preparacji naczynia izobarycznego tętnica jest pod ciśnieniem 70 mmHg między dwiema szklanymi kaniulami perfundowanymi ciepłym (37 °C) PSS. Po 30-45 minutach w tętnicach rozwija się MT, charakteryzujący się spontanicznym spadkiem średnicy, który stabilizuje się w ciągu 20-30 minut. W tętnicach oporowych z różnych łożysk naczyniowych rozwija się zmienny MT. Na przykład w tętnicach krezkowych oporności szczurów rozwija się MT ~ 25% PD...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konfliktów finansowych.

Podziękowania

Sandeep Khurana jest wspierany przez NIH (K08DKO81479). Vikrant Rachakonda jest wspierany przez (T32DK067872).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

2
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemiczny
AcetylocholinaSigma AldrichA6625
Chlorek wapnia (CaCl2)SigmaAldrich223506
D-(+)-GlukozaSigma AldrichG5767
Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowy kwas (EGTA)Sigma AldrichE3889
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma AldrichE9884
HEPESSigma AldrichH3784
Siarczan magnezu (MgSO4)Sigma AldrichM7506
MOPSSigma AldrichM5162
FenylefrynaSigma AldrichP6126
Chlorek potasu (KCl)Sigma AldrichP3911
Fosforan potasu (KH2PO4)Sigma AldrichP5655
Wodorowęglan sodu (NaHCO3 )Sigma AldrichS6014
Chlorek sodu (NaCl)Sigma AldrichS7653
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma AldrichS5881
Nitroprusydzyk soduSigma Aldrich13451
Jednowodny fosforan sodu jednowodny (NaH2PO4)Sigma AldrichS9638
Pirogronian soduSigma AldrichP8574
Tabela 1.
Fizjologiczny roztwór soli (1,000 ml) mM
KCl4.90.365 g
NaCl1126,545 g
MgSO4,7H2O1,20,296 g
KH2PO41.20.163 g
Glukoza11.52.072 g
NaHCO3262.184 g
HEPES102.383 g
CaCl2 22 ml (zapas 1M)
Woda dejonizowana998 ml
Ca2+ wolny roztwór soli fizjologicznej (100 ml) mM
KCl4.90.036 g
NaCl112 0,645 g
MgSO4.7H2O1,20,029 g
KH2PO4 1,2 0,016 g
Glukoza11,50,207 g
NaHCO326 0,218 g
HEPES100,238 g
EGTA 0,390,015 g
Nitrotroprusyd> 0,10,0026 g
Woda dejonizowana100 ml
roztwór preparacyjny, zapas (500 ml) mM
NaCl14521,18 g
KCl4,70,875 g
MgSO41,20,739 g
MOPS21,049 g
EDTA0,020,019 g
Woda dejonizowana500 ml
roztwór do rozwarstwiania (100 ml) mM
roztwór preparacyjny20 ml
Glukoza1,20,091 g
NaH2PO450,016 g
Pirogronian sodu20,022 g
20,2 ml (zapas 1M)
Woda dejonizowana79,8 ml
< tr> < td>CaClTabela 2. Skład roztworów eksperymentalnychEquipmentCCD Monochromatyczna kameraŹródło obrazowaniaDMK 21AU04Pojedynczy grzejnik liniowyWarner Instruments64-0102TermistorWarner Instruments64-0108Podwójny automatyczny regulator temperaturyWarner InstrumentsTC-344BFlaming/Brown Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP-97Interfejs systemu fluorescencjiIonOptixmodel FSI-700Kleszcze i nożyczki World Precision InstrumentsIon Wizard-Core and AnalysisIonOptixIon Wizard 6.0Rurki laboratoryjneSilastic508-005Samiec Sprague Dawley szczurHarlan LaboratoriesMaster flex napęd konsoliCole-parmerMilli-Q Plus Ultrapure Water System MilliporeZD5211584Okulistyczny monofilamentowy nylonowy szew Ethicon9007GMikroskop fotometryczny i wymiarowyMotic Regulator ciśnienia AE31z pompą perystaltyczną i przetwornikiem ciśnieniaOprzyrządowanie systemów żywychPS-200Mikroskop stereoskopowyNikon Instruments IncSMZ660Oprzyrządowanie systemów żywych wkomorze naczyniaCH-1Naczynie preparacyjneOprzyrządowanie systemów żywychDD-90-SCienkościenne szklane kapilaryWorld Precision InstrumentsTW120-6MicroforgeStoelting51550Tabela 3.

Bibliografia

  1. Christensen, K. L., Mulvany, M. J. Location of resistance arteries. J Vasc Res. 38, 1-12 (2001).
  2. Rietzschel, E. R. Oxidized low-density lipoprotein cholesterol is associated with decreases in cardiac function independent of vascular alterations. Hypertension. 52, 535-541 (2008).
  3. Hill, M. A., Ege, E. A. Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats. Effect of aminoguanidine treatment. Diabetes. 43, 1450-1456 (1994).
  4. Osol, G., Cipolla, M. Interaction of myogenic and adrenergic mechanisms in isolated, pressurized uterine radial arteries from late-pregnant and nonpregnant rats. Am J Obstet Gynecol. 168, 697-705 (1993).
  5. Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28, 176-180 (1997).
  6. Ren, Y., et al. Enhanced myogenic response in the afferent arteriole of spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298, H1769-H1775 (2010).
  7. Hayashi, K., Epstein, M., Saruta, T. Altered myogenic responsiveness of the renal microvasculature in experimental hypertension. J Hypertens. 14, 1387-1401 (1996).
  8. Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96, 313-326 (1999).
  9. Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J Vis Exp. , (2011).
  10. Buus, N. H., Vanbavel, E., Mulvany, M. J. Differences in Sensitivity of Rat Mesenteric Small Arteries to Agonists When Studied as Ring Preparations or as Cannulated Preparations. British Journal of Pharmacology. 112, 579-587 (1994).
  11. Falloon, B. J., Stephens, N., Tulip, J. R., Heagerty, A. M. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am J Physiol. 268, H670-H678 (1995).
  12. Schubert, R., Wesselman, J. P. M., Nilsson, H., Mulvany, M. J. Noradrenaline-induced depolarization is smaller in isobaric compared to isometric preparations of rat mesenteric small arteries. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 431, 794-796 (1996).
  13. Khurana, S., Raina, H., Pappas, V., Raufman, J. P., Pallone, T. L. Effects of deoxycholylglycine, a conjugated secondary bile acid, on myogenic tone and agonist-induced contraction in rat resistance arteries. PLoS One. 7, e32006(2012).
  14. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28, 220-231 (1902).
  15. Hughes, J. M., Bund, S. J. Arterial myogenic properties of the spontaneously hypertensive rat. Exp Physiol. 87, 527-534 (2002).
  16. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
  17. Raina, H., Zacharia, J., Li, M., Wier, W. G. Activation by Ca2+/calmodulin of an exogenous myosin light chain kinase in mouse arteries. J Physiol. 587, 2599-2612 (2009).
  18. Fenger-Gron, J., Mulvany, M. J., Christensen, K. L. Mesenteric blood pressure profile of conscious, freely moving rats. J Physiol. 488 (Pt 3), 753-760 (1995).
  19. Davis, M. J., Hill, M. A. Signaling mechanisms underlying the vascular myogenic response). Physiol Rev. 79, 387-423 (1999).
  20. Osmond, J. M., Mintz, J. D., Dalton, B., Stepp, D. W. Obesity increases blood pressure, cerebral vascular remodeling, and severity of stroke in the Zucker rat. Hypertension. 53, 381-386 (2009).
  21. Ge, Y., et al. Endogenously produced 20-HETE modulates myogenic and TGF response in microperfused afferent arterioles. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 102-103, 42-48 (2013).
  22. Ryan, M. J., et al. Placental ischemia impairs middle cerebral artery myogenic responses in the pregnant rat. Hypertension. 58, 1126-1131 (2011).
  23. Bagi, Z., et al. Type 2 diabetic mice have increased arteriolar tone and blood pressure: enhanced release of COX-2-derived constrictor prostaglandins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 1610-1616 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Napi cie naczyniowekaniulacja t tnicyci nienie w wietle naczyniaocena wazoaktywno cifizjologiczny roztw r soli pozbawiony wapniauszkodzenie r db onkaprzenikanie przez t tnic

Powiązane artykuły