Zbieranie i identyfikacja robaków od dzikich zwierząt

Kręgowce są pasożytowane przez cztery główne grupy robaków pasożytniczych. Dwie z tych grup, przywry lub przywry i tasiemce, należą do gromady Platyhelminthes. Pozostałe dwie grupy to nicienie lub glisty (Nematoda) i acanthocephalans, czyli robaki kolczaste (Acanthocephala). Wiele z tych pasożytów zostało udokumentowanych jako przyczyny zachorowalności i śmiertelności dzikich ptaków i ssaków^1,2.

Większość robaków ma skomplikowane cykle życiowe obejmujące więcej niż jednego gospodarza^1,2 . Na przykład przywry mają jednego lub dwóch żywicieli pośrednich (zwykle bezkręgowców) i żywiciela końcowego. Wszyscy żywiciele muszą być dostępni, aby cykl został zakończony, a tym samym, aby dorosłe robaki pasożytnicze były obecne w końcowych żywicielach (co jest tematem tego manuskryptu). Dlatego ważne jest, aby pamiętać, że mogą wystąpić sezonowe wahania w występowaniu i intensywności niektórych gatunków robaków pasożytniczych, a długoterminowe monitorowanie jest pożądane w celu uchwycenia pełnego robaka auna danego żywiciela.

Optymalna metoda zbierania robaków to badanie gospodarza, który został poddany eutanazji. Pozwala to na zbieranie robaków, gdy są jeszcze żywe oraz na ich właściwe rozluźnienie i utrwalenie. Materiał od żywicieli, którzy byli martwi dłużej niż 24 godziny lub zostali zamrożoni i rozmrożeni w celu zbadania, jest często gorszy i trudny do zidentyfikowania. Dziwaki i tasiemce od zamrożonych lub sformalizowanych gospodarzy są często źle przykurczone i utraciły struktury kluczowe dla identyfikacji, takie jak kolce ustne na przywrach lub haczyki na skoleksie tasiemców. Jednak rzeczywistość jest taka, że większość materiału dostępnego obecnie od kręgowców jest zamrożona lub zakonserwowana.

Bazy danych zawierające informacje o sekwencji DNA robaków szybko się rozrastają, a tym samym identyfikacja taksonomiczna jest już możliwa dla wielu gatunków. Dlatego robaki pasożytnicze powinny być w jak największym stopniu zachowane do potencjalnych analiz DNA. Jednak DNA dobrej jakości nie jest możliwe, jeśli próbki są utrwalone w formalinie. Przedstawione tutaj metody zbierania i zabijania robaków pasożytniczych pozwolą uzyskać materiał odpowiedni do ekstrakcji DNA i analiz genetycznych.

Poniżej opisujemy szczegółowe metody przeprowadzania sekcji zwłok kręgowców (,, ptaków i ssaków; monogeniczne przywry ryb nie są uwzględnione) w celu zebrania robaków, a następnie procedury dotyczące ich konserwacji i przetwarzania w celu identyfikacji taksonomicznej.

Zwierzęta użyte w poniższych eksperymentach zostały znalezione martwe jako ofiary śmiertelne

1. Sekcja zwłok zwierząt i badanie przesiewowe głównych organów do kolekcji robaków

1. Ułóż zwierzę na płaskiej powierzchni i zbadaj wszystkie otwory zewnętrzne, w tym uszy, jamę ustną i oczy, za pomocą szkła powiększającego pod kątem obecności nicieni (okrągłych) i przywr (płaskich i niesegmentowanych) (patrz ryc. 1).
2. Jeśli pracujesz z ptakami, umyj je wodą z kranu, aby zwilżyć pióra przed preparacją.
3. Za pomocą ostrego ostrza lub noża i za pomocą kleszczy preparacyjnych wykonaj nacięcie nad jamą brzuszną, uważając, aby nie rozerwać żadnych narządów. W przypadku żółwi z twardym pancerzem użyj piły ręcznej, aby przeciąć kość w obszarze mostu między tarczami piersiowymi i brzusznymi.
4. Otwórz klatkę piersiową jak wyżej; w przypadku dużych zwierząt może być potrzebne obcinacze do kości lub mała piła ręczna, aby przeciąć żebra.
5. Jeśli pracujesz z ptakami, zbadaj worki powietrzne na miejscu przed usunięciem jakichkolwiek narządów. W razie potrzeby użyj szkła powiększającego.
6. Zbadaj obie jamy pod kątem glisty filarialnej i dużych przywr.
7. Przed usunięciem przewodu pokarmowego z jamy brzusznej należy zawiązać nić w pobliżu początku przełyku, a drugą na końcu jelita grubego (odbytnicy).
8. Na szalki Petriego (lub szklane tace, jeśli narządy są zbyt duże) do badania pod mikroskopem stereoskopowym (10-30X) należy rozdzielić następujące narządy klatki piersiowej: serce i główne naczynia krwionośne, tchawica i płuca.
9. Usunąć wątrobę, woreczek żółciowy i przewody, trzustkę, śledzionę, nerki i pęcherz moczowy i zbadać zgodnie z opisem w kroku 1.8.
10. Wyjmij cały układ trawienny i umieść każdą sekcję w szklanych naczyniach/tacach.
11. Po usunięciu narządów umyj jamę ciała wężem lub butelką ze spryskaczem wypełnioną 0,9% solą fizjologiczną do sita o oczkach 106 μm i zbadaj zawartość sita pod mikroskopem stereoskopowym pod kątem obecności robaków filarialnych lub trematod krwi.
12. Otwórz nożyczkami każdy odcinek przewodu pokarmowego, zeskrob błonę śluzową i dokładnie zbadaj pod kątem obecności dużych pasożytów (>1 cm). W razie potrzeby użyj szkła powiększającego. Trąbka akantocefalanów jest często głęboko osadzona w ścianie jelita i może być konieczne ostrożne odkurzenie tkanki za pomocą kleszczy i/lub małych nożyczek.
13. Umieść każdą otwartą sekcję pod bieżącą wodą i umyj całą zawartość na sicie 106 μm, jak opisano w kroku 1.11.
14. Otwórz serce i główne naczynia krwionośne (płucne i aortę), tchawicę oraz pęcherzyki moczowe i żółciowe i zbadaj zawartość w ten sam sposób.
15. Pokrój i rozdziel narządy stałe, takie jak płuca, wątroba, nerki, śledziona i trzustka, za pomocą ostrego ostrza i kleszczy. Umyj je pod bieżącą wodą na sicie o wielkości 106 μm, jak opisano w kroku 1.11.
16. Zapisz rodzaje znalezionych pasożytów, liczbę każdego typu i narząd(y), w których się znajdują. Metody utrwalania i barwienia są wymienione poniżej.
17. Oznacz fiolki/słoiki, umieszczając mały kawałek zwykłej karty indeksowej napisanej ołówkiem (atrament i karty indeksowe w linię będą "spływać" w próbkach alkoholu i plam
).

2. Zachowanie robaków

1. W przypadku robaków, które muszą zostać zachowane do późniejszych badań genetycznych, umieść je bezpośrednio w 80-90% etanolu (bez gliceryny). Etanol powinien być wytwarzany przez rozcieńczenie 95% etanolu, najlepiej odczynnika (tabela 1). Nigdy nie pozwól, aby te próbki były wystawione na działanie formaliny, ponieważ formalina degraduje DNA do stanu bezużytecznego.
2. Umieść żywe przywry na szkiełku mikroskopowym w kropli soli fizjologicznej, umieść szklane szkiełko nakrywkowe i przełóż szkiełko nad płomieniem bez gotowania soli fizjologicznej.
   1. Wrzucić szkiełko do szalki Petriego zawierającej AFA (alkohol-formalina-kwas octowy, patrz tabela 1) i pozwolić szkiełku nakrywkowemu odpłynąć.
   2. Utrwal w AFA na jeden do kilku dni, spłucz wodą z kranu i przenieś do 5 ml szklanych fiolek (lub większych szklanych fiolek / słoików w zależności od wielkości i ilości pasożytów) wypełnionych 70% etanolem do długotrwałego przechowywania.
3. Napraw martwe przywry w AFA lub 10% buforowanej formalinie przez 48 godzin, a następnie przenieś do fiolki/słoika wypełnionego 70% etanolem w celu długotrwałego przechowywania.
4. Zrelaksuj żywe tasiemce na szalce Petriego, zalewając je prawie wrzącą wodą, a następnie przenieś do fiolki/słoika wypełnionego 70% etanolem w celu długotrwałego przechowywania.
5. Zrelaksuj żywe akantocefany, umieszczając je na szalce Petriego na jedną do kilku godzin w wodzie z kranu w lodówce (~4 °C), aż trąbka zostanie całkowicie usunięta (może to potrwać do 24 godzin). Przenieść do fiolki/słoika wypełnionego 70% etanolem lub AFA w celu długotrwałego przechowywania.
6. Martwe tasiemce i akantocefany należy traktować tak samo jak martwe przywry (patrz wyżej).
7. Uśmiercać żywe małe (<5 mm lub delikatne nicienie (np. trichostrongylidy, kapilarydy) w gorącym (prawie wrzącym) 70% etanolu i przechowywać w fiolce/słoiku wypełnionym 70% etanolem z dodatkiem 5% gliceryny (Tabela 1) w celu zachowania robaków w przypadku parowania.
8. Usunąć (i oczyścić) średnie i duże (>5 mm) nicienie (np. glisty, spirurydy, oksyurydy, filarydy) poprzez umieszczenie na szalce Petriego z zimnym lodowatym kwasem octowym (Tabela 1) i po 15 minutach przenieść do fiolki/słoika wypełnionego 70% etanolem i 5% gliceryną. Kwas octowy może być używany w ten sposób wielokrotnie.
9. Umieść martwe nicienie bezpośrednio w fiolce/słoiku wypełnionym 70% etanolem i 5% gliceryną.

3. Taksonomiczna identyfikacja robaków

1. Przygotuj hematoksylinę Harrisa, rozpuszczając hematoksylinę w alkoholu i rozpuszczając siarczan glinowo-amonowy w wodzie z ciepłem. Wymieszaj oba roztwory i doprowadź do wrzenia.
   1. Dodaj jodan sodu i gotuj przez 2-3 minuty. Roztwór filtrować (541 bibuła filtracyjna) po powrocie do temperatury pokojowej.
2. Nadmiernie przebarwić przywry, tasiemce i akantokocefalany, pozostawiając je na noc w rozcieńczonej (1:10) hematoksylinie Harrisa lub karminie Semichona (patrz Tabela 1).
   1. Odbarwiaj za pomocą 70% kwaśnego etanolu, aż narządy będą widoczne (może to potrwać od kilku sekund do ponad godziny i należy je uważnie obserwować).
   2. Zatrzymaj odbarwianie, przenosząc próbki do 70% podstawowego etanolu na co najmniej 30 minut. Następnie odwodnić je w serii stopniowanych etanoli (80%, 95%, 100%) i usunąć w ksylenie lub salicylanie metylu.
   3. Zamontuj próbki na szkiełku mikroskopowym po dodaniu kropli balsamu kanadyjskiego i szkiełka nakrywkowego. Pozostaw do wyschnięcia na noc.
3. Usunąć małe i średnie nicienie i akantocefany przez 15-30 minut w tymczasowych mocowaniach laktofenolu na szkiełku mikroskopowym ze szkiełkiem nakrywkowym.
   1. Stosuj 80% fenolu przez maksymalnie 60 minut w przypadku dużych nicieni (glistyków i spiruridów) i akantocefałów. Zbadaj pod mikroskopem świetlnym (40-400X) w celu oceny mniejszych struktur (męskie kolce i haczyki).
4. Skorzystaj z następujących podejść do badania struktur specjalnych.
   1. W przypadku tasiemców odciąć skoleks i umieścić na szkiełku mikroskopowym w laktofenolu i "zgniatać" z szkiełkiem nakrywkowym do pomiaru i liczenia haczyków rostellar (patrz ryc. 1B).
   2. W przypadku nicieni odciąć przedni koniec i zamontować en face na szkiełku mikroskopowym w kilku kroplach laktofenolu (bez szkiełka nakrywkowego) lub w galaretce glicerynowej w celu trwałego montażu (z szkiełkiem nakrywkowym) i obserwować aparat gębowy pod mikroskopem świetlnym (35-400X) (patrz ryc. 1D).
   3. Odciąć ogony dużych nicieni i zamontować na szkiełku mikroskopowym w laktofenolu ze szkiełkiem nakrywkowym, aby obserwować morfologię brodawek brzusznych i kolców samców pod mikroskopem świetlnym (patrz ryc. 1D).
5. Identyfikuj pasożyty w gatunkach, korzystając z kombinacji podstawowej literatury i standardowych odniesień taksonomicznych, takich jak:
   1. Trematodes: Yamaguti (1958, 1971)^3,4 oraz Gibson et al. ^5-7
   2. Akantocefalia: Yamaguti⁸
   3. Tasiemce: Yamaguti⁹, Schmidt¹⁰ oraz Khalil et al. ¹¹
   4. Nicienie: Yamaguti¹² i Anderson et al. ¹³

4. Depozytariusz robaków w U.S. National Parasite Collection

1. Zdeponuj reprezentatywne okazy robaków pasożytniczych w U.S. National Parasite Collection (USNPC). Jest to obowiązkowe dla większości czasopism pasożytniczych. Po złożeniu wniosku każdemu gatunkowi robaków przypisuje się numer akcesyjny w celu włączenia do manuskryptów.
2. Przesyłając próbki, należy podać następujące informacje: 1) nazwę naukową pasożyta; 2) informacje o żywicielu (gatunek, współrzędne długości/szerokości geograficznej lub położenie geograficzne); 3) narząd znaleziony w żywicielu; 4) imię i nazwisko osoby, która pobrała okazy, oraz datę pozyskania; 5) rodzaj użytego utrwalacza, bejcy lub środka czyszczącego/montażowego; 6) lokalizacji innych zbiorów (numery muzealne i akcesyjne), jeżeli dodatkowe okazy są zgłaszane w innym miejscu; oraz 7) informacje o publikacji i czasopiśmie. Dane te powinny być również przesyłane razem z próbkami i w osobnej okładce.
3. Zapakuj próbki w mocne pojemniki z odpornym na wstrząsy materiałem absorpcyjnym. Zaklej zakrętki taśmą/Parafilm na szklanych fiolkach i umieść każdą fiolkę w osobnej plastikowej torbie. Zawiń szkiełka w papier i umieść między nimi w pudełku na slajdy z materiałem amortyzującym.
4. Wyślij próbki i osobny list z informacjami o okazach na adres: U.S. National Parasite Collection, USDA, ARS, ANRI, Bldg. 1180, BARC-East, 10300 Baltimore Avenue, Beltsville, MD 20705-2350.

Korzystając z metod opisanych powyżej, w latach 2007-2011 przeprowadzono badanie robaków ryjówki maskowej, Sorex cinereus, w hrabstwie Missoula, w stanie Montana. W sumie 56 ryjówek zebrano z pułapek i zbadano w ciągu 2 godzin po śmierci. Ogólna częstość występowania infekcji wynosiła 96%; Tylko 2 ryjówki były wolne od pasożytów. Zidentyfikowano piętnaście gatunków robaków, w tym 9 gatunków tasiemców i 6 gatunków nicieni. Jeden gatunek z rodzaju tasiemców Staphylocystoides był wcześniej nieopisany. Zainfekowane organy obejmowały jelito cienkie (9 tasiemców, 3 nicienie), żołądek (1 nicienie), płuca (1 nicienie) i pęcherz moczowy (1 nicienie). Całkowita intensywność infekcji wahała się od 7 do 234 robaków na zakażonego gospodarza. Bogactwo gatunkowe (liczba gatunków robaków pasożytniczych na zakażonego żywiciela) wahało się od 1 do 8 ze średnią 4,1 (ryc. 2).

Rysunek 1. Reprezentatywne rysunki i fotografie grup robaków ukazujących główne cechy anatomiczne dla każdej gromady: A) Trematoda; b) Cestoda; c) Acanthocephala; oraz D) Nicienie. Do fotografii dołączono informacje o nazwie naukowej, narządzie i gospodarzu. Trematodes i tasiemce są hermafrodytami. Rysunki niekoniecznie są w tej samej skali. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 2. Podsumowanie wstępnych danych dotyczących robaków masowych Sorex cinereus zebranych w hrabstwie Missoula w stanie Montana w latach 2007-2011. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Nie mamy nic do ujawnienia