Artykuł metodologiczny

Metody zbierania mleka dla myszy i jelenia Muntjac Reevesa

20.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51007

⸱

19 lipca 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Prion Research Center, Colorado State University

W tym artykule

Podsumowanie

Pobieranie mleka z modeli zwierzęcych ułatwia różne ścieżki badań: zrozumienie odporności biernej, identyfikację patogenów odpowiedzialnych za transgeniczne przenoszenie i, dzięki wykorzystaniu transgenicznych myszy, nawet komercyjną produkcję białek znajdujących się w ludzkim mleku matki. Tutaj ilustrujemy prostą metodę zbierania mleka u myszy i jeleni muntjac Reevesa.

Streszczenie

Modele zwierzęce są powszechnie używane w laboratoriach badawczych do osiągnięcia tego, co normalnie byłoby uważane za niepraktyczne w rodzimym gospodarzu patogenu. Pobieranie mleka od zwierząt daje naukowcom możliwość zbadania wielu aspektów reprodukcji, w tym transmisji pionowej, odporności biernej, biologii gruczołu sutkowego i laktacji. Uzyskanie odpowiedniej ilości mleka do tych badań jest trudnym zadaniem, zwłaszcza w przypadku małych modeli zwierzęcych. Tutaj ilustrujemy niedrogą i łatwą metodę zbierania mleka u myszy i jeleni muntjac Reevesa, która nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani intensywnego treningu. Ta szczególna metoda wymaga dwóch badaczy: jednego do odciągania mleka i ustabilizowania zwierzęcia, a drugiego do zebrania mleka do odpowiedniego pojemnika z modelu Muntjac lub myszy. Model mysi wymaga również użycia pipetmana P-200 i odpowiednich końcówek do pipet. Chociaż metoda ta jest tania i stosunkowo łatwa do wykonania, należy pamiętać, że znieczulenie zwierzęcia jest wymagane w celu optymalnego pobrania mleka.

Wprowadzenie

Modele zwierzęce dostarczają wglądu w patologię choroby, którego nie można uzyskać za pomocą analizy in vitro. Aby zapewnić najbardziej skuteczne wyniki, ważne jest, aby użyć modelu zwierzęcego, który jest ściśle związany z chorobą i gatunkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Na przykład muntjac Reevesa (Muntiacus reevesi), mały jeleń azjatycki1,2 i transgeniczne myszy wyrażające białko prionowe jeleniowatych (CerTgPrP)3 są użytecznymi modelami zwierzęcymi dla gatunków jeleniowatych. Oba gatunki są wielorujowe, co pozwala na rozmnażanie się przez cały rok, a zatem są stałym źródłem tkanek i płynów związanych z ciążą w celu badania określonych mechanizmów w biologii jeleniowatych. Badania nad mlekiem mają szeroki wachlarz zastosowań, które są prostsze (i nietańsze) realizowane w modelach zwierzęcych niż u ludzi. Naukowcy mogą badać mleko i siarę jako potencjalne źródło 1) przenoszenia chorób zakaźnych, 2) immunoglobulin przenoszonych z matki na potomstwo w procesie rozwoju odporności biernej4 i 3) laktoferyny, białka znajdującego się w mleku matki biorącego udział w odporności biernej, które naukowcy próbują obecnie wyprodukować komercyjnie5.

Zebranie znacznej ilości mleka od małych zwierząt może okazać się trudnym zadaniem. Rogers zaproponował metodę zbierania mleka od szczurów6, która została następnie zastosowana u myszy. DePeters i Hovey zaproponowali dwie metody zbierania mleka, jedną wykorzystującą ręcznie generowaną próżnię wytwarzaną przez gumową gruszkę pipety przymocowaną do pipety Pasteura, a drugą wymagającą budowy jednostki udojowej, która jest następnie podłączona do źródła podciśnienia (takiego jak kran) w celuzbierania mleka myszy7. Tutaj proponujemy prostą, tanią metodę zbierania mleka zarówno od myszy, jak i jelenia muntjac Reevesa, która wymaga jedynie łatwo dostępnego sprzętu laboratoryjnego i podstawowych umiejętności technicznych. Nasza metoda pozwala uzyskać wystarczającą ilość mleka do różnych zastosowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Protokół dojenia myszy

Metody opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez IACUC.

1. Oddzielenie matki od potomstwa

  1. Wybierz matkę, która ma być dojona. Wybierz matkę z miotem 4 lub więcej młodych, która jest 8-12 dni po porodzie, aby zapewnić maksymalny odbiór mleka - chociaż odbiór jest możliwy w dowolnym momencie po porodzie do 21 dni.
  2. Oddzielić matkę od ściółki co najmniej 2 godziny przed udojem.
    Uwaga: W przypadku chęci wydojenia więcej niż jednej matki w danym okresie czasu, dopuszczalne jest trzymanie oddzielonych matek w tej samej klatce z odpowiednim zaopatrzeniem w pokarm i wodę.

2. Podawanie oksytocyny, środka znieczulającego i lubrykantu do oczu

  1. Podawać dootrzewnowo (IP) 2 j.m./kg oksytocyny. Oksytocyna jest hormonem, który działa na gruczoły sutkowe samic w okresie laktacji, stymulując uwalnianie mleka. Oksytocynę można nabyć od weterynarza.
  2. Podawać mieszaninę znieczulającą zawierającą 80-100 mg/kg ketaminy w połączeniu z 5-10 mg/kg ksylazyny IP. Na przykład 10 ml podstawowej mieszaniny znieczulającej można przygotować z wyprzedzeniem dla myszy o wadze około 30 g i będzie ona zawierać 0,1 ml ksylazyny, 8,9 mlH2Oi 1,0 ml ketaminy. 0,25 ml całkowitego środka znieczulającego uspokoi mysz tej wielkości na około 20-30 minut, co powinno zapewnić odpowiedni czas na pobranie mleka.
    Uwagi: Aby ustalić, czy zwierzę zostało pomyślnie znieczulone, delikatnie połóż je na brzuchu na twardej powierzchni; Nie powinna poruszać stopami ani próbować wstać, jeśli jest w pełni znieczulona. W przypadku, gdy mysz nie jest w pełni znieczulona pierwotną dawką, badacz może podać kolejne 1/4 lub 1/2 pierwotnej dawki mieszaniny znieczulającej, w zależności od wielkości myszy i/lub poziomu uspokojenia, który mysz już osiągnęła. Może to jednak zwiększyć ryzyko wystąpienia niepożądanej reakcji na znieczulenie, a także może spowodować, że mysz będzie głębiej znieczulona i/lub znieczulona przez dłuższy czas.
    Uwaga: W przypadku dojenia więcej niż jednej matki konieczne jest rozłożone w czasie podawanie oksytocyny i zastrzyków znieczulających ze względu na krótki okres półtrwania oksytocyny i czas sedacji ketaminy i ksylazyny.
  3. Nałóż niewielką ilość lubrykantu do oczu w kącikach każdego oka i rozprowadź, aby zapobiec wysuszeniu oczu myszy podczas znieczulenia.

3. Odbiór mleka

Najłatwiej jest przeprowadzić zbiórkę mleka przez dwóch badaczy: jednego badacza, który trzyma znieczuloną mysz podczas ręcznego odciągania mleka (określanego jako R1), a drugiego badacza zbiera mleko ( R2). Ta metoda może być również wykonywana z jedną osobą, jeśli mysz jest zabezpieczona na płaskiej powierzchni, aby uniknąć obrażeń.

  1. R2 powinien być wyposażony w sterylne waciki nasączone alkoholem, pipetarkę P-200, czystą końcówkę pipety do każdej myszy oraz pojemnik do przechowywania mleka, taki jak probówka Eppendorfa o pojemności 1,5 ml lub kriowial o pojemności 1,2 ml (patrz tabela materiałów).
  2. Gdy oksytocyna zacznie działać, upływ mleka stanie się widoczny w okolicy sutka myszy (patrz ryc. 1A). R1: Rozpakuj sterylną wkładkę nasączoną alkoholem i delikatnie przetrzyj obszar sutkowy myszy, aby oczyścić obszar przed dojeniem. Ręcznie odciągaj pokarm ze smoczka, delikatnie masując i ściskając tkankę sutkową kciukiem i palcem wskazującym ruchem do góry, aż u podstawy smoczka zacznie tworzyć się widoczna kropla mleka.
  3. Dociśnij tłok pipetmana P-200 do pierwszego oporu, aby uwolnić powietrze z końcówki pipety i przygotować się do pobierania mleka.
  4. Umieść końcówkę pipety na górze kropli mleka i delikatnie wciągnij mleko do końcówki pipety, powoli zwalniając nacisk na tłok. Uważaj, aby nie umieszczać końcówki zbyt blisko smoczka lub skóry (patrz Rysunek 1B). Nie ma potrzeby całkowitego zwalniania tłoka, ponieważ spowoduje to pociągnięcie mleka do górnej części końcówki pipety i utrudni wylanie często lepkiego mleka do pojemnika do przechowywania.
  5. Wylać mleko do pojemnika, naciskając kciukiem tłok poza pierwszy ogranicznik (patrz Rysunek 1C). Aby ułatwić wydalanie małych objętości, należy docisnąć końcówkę pipety do boku probówki, tak aby nie doszło do utraty płynu.
  6. Kontynuuj ręczne odciąganie mleka z każdego smoczka, przesuwając się w kierunku zgodnym lub przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby nie pominąć żadnego smoczka. Dopuszczalne i użyteczne jest zarówno powracanie do mleka z tego samego smoczka, jak i ciągłe odciąganie pokarmu, jeśli produkuje on więcej mleka niż inny.

4. Odwrócenie znieczulenia w zaporze

  1. W większości przypadków często zdarza się, że zapora zaczyna się budzić podczas procesu doju. Jeśli tak nie jest, umieść komatkę w klatce pośrednio pod źródłem ciepła, takim jak podgrzewany koc krążący, aż zacznie się budzić.
    Uwaga: Gdy tama zacznie się budzić, uważnie obserwuj jej aktywność, dopóki nie będzie w stanie samodzielnie chodzić po klatce.
  2. Gdy tama będzie poruszać się po klatce bez walki, umieść ją z powrotem w oryginalnej klatce z miotem. Nie zaobserwowano żadnych negatywnych skutków w odniesieniu do zdolności szczeniąt do karmienia po pobraniu mleka.

2. Protokół doju Muntjac

Metody opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez IACUC.

1. Oddzielenie łani od potomstwa

  1. Wybierz łanię do dojenia. Jeleń muntjac Reevesa zazwyczaj rodzi jednego jelonka2. Wydoić łanię dzień po urodzeniu, aby umożliwić jelonkowi dostęp do niezbędnych składników odżywczych zawartych w siarze8,
    Uwaga: Jelonek zwykle chowa się i nie pojawia się ponownie podczas zabiegu; Rozdzielenie pary matka-potomstwo nie jest konieczne.

2. Podawanie oksytocyny, środka znieczulającego i lubrykantu do oczu

  1. Podawać domięśniowo 10 j.m./kg oksytocyny (IM). Oksytocyna jest hormonem, który działa na gruczoły sutkowe samic karmiących piersią, stymulując wydzielanie mleka. Oksytocynę można nabyć od weterynarza.
  2. Podawać środek znieczulający BAM IM11 zawierający butorfanol 0,45 mg/kg, azaperon 0,25 mg/kg, medetomadyna 0,07 mg/kg. Jedna dawka mieszanki znieczulającej BAM uspokaja muntjaca na około 20-30 minut, co zapewnia wystarczająco dużo czasu na całkowite pobranie mleka. Inną opcją znieczulenia jest midazolam w dawce 1-2 mg/kg, który uspokaja muntjaca na około 10-15 minut. Chociaż zapewnia to odpowiedni czas na pobranie mleka, ten środek znieczulający jest metabolizowany szybciej niż BAM i zwierzę może próbować uciec pod koniec krótszego okresu.
    Uwaga: Minimalna reakcja na ból, drobne odruchy po dotknięciu uszu, a następnie zdolność R1 do utrzymania MJ bez walki wskazują, że zwierzę zostało pomyślnie znieczulone.
    Uwaga: W przypadku, gdy muntjac nie jest w pełni znieczulony pierwotną dawką, badacz może podać kolejne 1/4 lub 1/2 pierwotnej dawki mieszaniny znieczulającej, w zależności od wielkości zwierzęcia i/lub poziomu sedacji, który został już osiągnięty. Może to jednak zwiększyć ryzyko wystąpienia niepożądanej reakcji na znieczulenie, a także może spowodować, że muntjac będzie głębiej znieczulony i/lub znieczulony przez dłuższy czas.
  3. Nałóż niewielką ilość lubrykantu w kącikach każdego oka i rozprowadź, aby zapobiec wysuszeniu oczu muntjaca podczas znieczulenia.

3. Odbiór mleka

Najłatwiej jest przeprowadzić zbiórkę mleka przez dwóch badaczy; jeden badacz trzyma znieczulonego muntjaca na kolanach podczas ręcznego odciągania mleka (określa się jako R1), a drugi badacz utrzymuje głowę muntjaca w wygodnej i bezpiecznej pozycji i zbiera mleko (R2).

  1. W zależności od zastosowanego środka znieczulającego, dojenie powinno odbywać się 1) w kojcach, aby zapewnić bezpieczne miejsce w przypadku przebudzenia się podczas zabiegu (indukowane midazolamem) lub 2) w przedpokoju bez ściółki w celu utrzymania czystości (indukowane przez BAM).
  2. R1 i R2 powinny być wyposażone w gazę nasączoną etanolem i kilka stożkowych probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml do przechowywania mleka.
  3. Gdy oksytocyna zacznie działać, upływ mleka stanie się widoczny w okolicy sutka muntjaca. R1: Zdezynfekuj dłonie i palce w rękawiczkach, a także całe wymię i każdy pojedynczy strzyk zwierzęcia za pomocą gazy nasączonej etanolem. R2: Trzymaj głowę muntjaca w bezpiecznej i wygodnej pozycji, aby ułatwić oddychanie i zapobiec niedomykalności żwacza. Trzymaj rurkę zbiorczą blisko dojonego strzyka, nie dotykając jej, aby zapobiec potencjalnemu zanieczyszczeniu.
  4. Odciągnij pokarm z jednego smoczka, delikatnie ściskając tkankę sutkową kciukiem i palcem wskazującym ruchem w górę, aż smoczek pokryje się mlekiem, a następnie delikatnie rozwałkuj mleko ze smoczka do rurki, którą trzyma R2 (patrz Rysunek 2).
  5. Uwaga: Mleko wypływa strumieniem, dlatego ważne jest, aby rurka zbiorcza R2 była umieszczona w taki sposób, aby zmarnować niewiele mleka lub nie marnować go wcale.
  6. Wymię muntjaca jest podzielone na ćwiartki. R1: Kontynuuj odciąganie pokarmu z każdej ćwiartki, aż mleko przestanie płynąć swobodnie. Jeżeli nie można odciągnąć pokarmu z jednego strzyka, należy odciągnąć mleko ze wszystkich pozostałych strzyków przed powrotem do pierwszego. Dopuszczalne i użyteczne jest zarówno powracanie do mleka z tego samego smoczka, jak i ciągłe odciąganie pokarmu, jeśli produkuje on więcej mleka niż inny.

4. Odwrócenie znieczulenia u łania

Często zdarza się, że indukowane midazolamem łanie zaczynają się budzić podczas procesu dojenia. W większości przypadków łania będzie próbowała uciec, zanim całe mleko zostanie odciągnięte. Niewielkie ograniczenie stosuje się w celu zwiększenia wydajności mlecznej; Jednak bezpieczeństwo i komfort zarówno badaczy, jak i DOE są równie ważne.

  1. Podawać atipamezol w dawce 2,5 mg/mg medetodyny podskórnie w celu szybkiego odwrócenia działania znieczulonej przez BAM łani.
    Uwaga: W przypadku obu rodzajów znieczulenia konieczne jest ścisłe obserwowanie łani, dopóki nie będzie w stanie samodzielnie chodzić bez potykania się lub upadku, a także będzie w stanie jeść i pić bez obawy o zachłyśnięcie lub zadławienie. Nie zaobserwowano żadnych negatywnych skutków w odniesieniu do zdolności jelonka do karmienia piersią po pobraniu mleka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mysz

Z naszych eksperymentów wynika, że możliwe jest pobranie około 100-400 μl mleka od jednej myszy laboratoryjnej, w zależności od kilku zmiennych. Zmienne te obejmują 1) czas przeznaczony na pobieranie, 2) dawkę podanej oksytocyny, 3) liczbę piskląt, które samica aktualnie karmi, oraz 4) czas, jaki upłynął od porodu. Nasze badania wykazały, że najwyższą wydajność uzyskuje się, gdy samice są odseparowane od potomstwa przez co najmniej 2 hr, a na dojenie jednej myszy przeznac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mysz

Istnieje kilka czynników, które należy wziąć pod uwagę podczas pobierania mleka od myszy, w tym: 1) ilość czasu przeznaczonego na pobranie, 2) podana dawka oksytocyny, 3) liczba młodych, które matka obecnie karmi i 4) czas, jaki minął od porodu w momencie pobrania. Opierając się na wcześniejszych badaniach jako wytycznych, postanowiliśmy zoptymalizować warunki dla wydajności mlecznej.

Wcześniejsze badania bezpośrednio korelowały wydajność mlecz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Te eksperymenty zostały sfinansowane przez #RAI093634A grantu NIH. Wyrażamy ogromną wdzięczność dr Jenny Powers za pomoc w doju muntjac.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały— Mysia
Ketamina (KetaVed 100 mg/ml) (dawka: 80-100 mg/kg)MWI/Vedco011075
Ksylazyna (TranquiVed 100 mg/ml) (dawka: 5-10 mg/kg)MWI/VedcoNADA 139236
Smar do oczuMWI/Apexa701013
Oksytocyna (2 IU/kg)Vet One501013
Materials— Muntjac
Midazolam (1-2 mg/kg)Amerisource Bergen Drug Corp924326Opcjonalnie: badacz może stosować Midazolam samodzielnie lub kombinację BAM jako środek znieczulający
Winian butorfanolu (Torbugesic) (0,45 mg / kg)Fort Dodge Animal HealthNADA 135-780
Winian azaperonu (0,25 mg / kg)ZooPharm
Medetomadine HCl (0,07 mg / kg)ZooPharm
Chlorowodorek antypamezolu (Antisedan) (dawka: 0,25 mg/kg)Orion CorporationNADA 141-033
Oksytocyna (10 IU/kg)Vet One501013
Sprzęt— Mysz
P-200 PipetmanGilsonF123601
200 μ l końcówki do pipetLight LabsB-2004-SH
Strzykawki 1 mlMWI005427
igły 27 GMWI002031
Sprzęt— Probówki stożkowe Muntjac
15 mlVWR21008-918
Igły 22 GMWI873
Strzykawki Luer Lock 3 mlMWI001377

Bibliografia

  1. Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
  2. Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
  3. Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
  4. Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
  5. Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
  6. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
  7. Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  8. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
  9. Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
  10. Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
  11. Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

model myszypodawanie oksytocynyprocedura znieczuleniar czne wyciskaniepipeta P 200sterylne prob wki do zbierania pr bekmasa tkanki gruczo owej piersirekonwalescencja i bezpiecze stwo zwierz t

Powiązane artykuły