Artykuł metodologiczny

Monitorowanie zmian polarności błony, integralności błony i stężeń jonów wewnątrzkomórkowych w Streptococcus pneumoniae przy użyciu barwników fluorescencyjnych

DOI:

10.3791/51008

⸱

17 lutego 2014

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University at Buffalo, State University of New York, 2Witebsky Center for Microbial Pathogenesis and Immunology, University at Buffalo, State University of New York, 3New York State Center of Excellence in Bioinformatics and Life Sciences, University at Buffalo, State University of New York

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przeciwieństwie do tego, co obserwuje się u eukariontów, istnieje niedostatek badań, które szczegółowo opisują depolaryzację błony i zmiany stężenia jonów u bakterii, przede wszystkim dlatego, że ich mały rozmiar utrudnia konwencjonalne metody pomiaru. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokoły monitorowania takich zdarzeń w znaczącym patogenie Gram-dodatnim Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem technik fluorescencyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Depolaryzacja błony i strumienie jonów to zdarzenia, które były intensywnie badane w systemach biologicznych ze względu na ich zdolność do głębokiego wpływu na funkcje komórkowe, w tym energetykę i transdukcję sygnału. Podczas gdy zarówno metody fluorescencyjne, jak i elektrofizjologiczne, w tym użycie elektrod i zaciskanie plastrów, zostały dobrze rozwinięte do pomiaru tych zdarzeń w komórkach eukariotycznych, metodologia pomiaru podobnych zdarzeń w mikroorganizmach okazała się trudniejsza do opracowania ze względu na ich niewielki rozmiar w połączeniu z bardziej złożoną zewnętrzną powierzchnią bakterii osłaniających błonę. Podczas naszych badań nad inicjacją śmierci u Streptococcus pneumoniae (pneumokoki) chcieliśmy wyjaśnić rolę zdarzeń błonowych, w tym zmian polarności, integralności i stężeń jonów wewnątrzkomórkowych. Przeszukując literaturę, stwierdziliśmy, że istnieje bardzo niewiele badań. Inni badacze monitorowali wychwyt lub równowagę radioizotopów w celu pomiaru strumieni jonów i potencjału błonowego, a ograniczona liczba badań, głównie na organizmach Gram-ujemnych, odniosła pewien sukces przy użyciu barwników fluorescencyjnych karbocyjaniny lub oksonolu do pomiaru potencjału błonowego lub ładowania bakterii przepuszczalnymi dla komórek wersjami estrów acetoksymetylowych (AM) wrażliwych na jony. W związku z tym opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy protokoły pomiaru potencjału błonowego, pękania i transportu jonów w organizmie Gram-dodatnim S. pneumoniae. Opracowaliśmy protokoły wykorzystujące barwnik bis-oksonolowy DiBAC4 (3) i nieprzepuszczalny dla komórek barwnik jodek propidyny do pomiaru odpowiednio depolaryzacji i pęknięcia błony, a także metody optymalnego obciążenia pneumokoków estrami AM barwników ratiometrycznych Fura-2, PBFI i BCECF w celu wykrycia zmian w wewnątrzkomórkowych stężeniach Ca2+, K+ i H+, odpowiednio, za pomocą czytnika płytek z detekcją fluorescencji. Protokoły te są pierwszymi tego rodzaju w przypadku pneumokoków, a większość tych barwników nie była stosowana u żadnych innych gatunków bakterii. Chociaż nasze protokoły zostały zoptymalizowane pod kątem S. pneumoniae, uważamy, że te podejścia powinny stanowić doskonały punkt wyjścia do podobnych badań na innych gatunkach bakterii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasze laboratorium zidentyfikowało kompleks białkowo-lipidowy z mleka ludzkiego o nazwie HAMLET (od Human Alpha-lactalbumin Made LEthal to Tumor cells), który indukuje apoptozę w komórkach nowotworowych, ale jest również w stanie zabić różne gatunki bakterii1,2. Gatunki, które okazały się szczególnie wrażliwe, to te, które atakują drogi oddechowe, przy czym Streptococcus pneumoniae (pneumokoki) wykazywały największą wrażliwość i fenotyp śmierci podobny do apoptozy2,3. Depolaryzacja błony i specyficzne zdarzenia transportu jonów są dobrze opisanymi i kluczowymi zdarzeniami podczas apoptozy w komórkach eukariotycznych, szczególnie w mitochondriach, gdzie radioaktywne jony TPP+ i barwniki fluorescencyjne, w tym JC-1 i TMRE, zostały użyte do wykazania depolaryzacji błony mitochondrialnej3-5. W związku z tym staraliśmy się dowiedzieć więcej o wpływie projektu HAMLET na te związane z błonami cechy pneumokoków, koncentrując nasze wysiłki na lepszym zrozumieniu mechanistycznych składników fenotypu podobnego do apoptozy u bakterii, z dużym potencjałem identyfikacji nowych terapii przeciwbakteryjnych lub kandydatów na szczepionki w tym procesie.

Szukając protokołów dla naszych badań mechanistycznych, odkryliśmy, że w przeciwieństwie do dobrze opisanej metodologii w systemach eukariotycznych, istnieje bardzo niewiele opublikowanych badań szczegółowo opisujących elektrofizjologię i mechanizmy transportu jonów w błonie bakteryjnej6,7. Przypisuje się to przede wszystkim mniejszym rozmiarom mikroorganizmów i architekturze ich powierzchni, w szczególności obecności ściany komórkowej, która ogranicza dostępność błony do stosowania konwencjonalnych metod eukariotycznych, takich jak zaciskanie łat, chociaż niektóre badania z użyciem gigantycznych protoplastów zostały przeprowadzone z mieszanym powodzeniem8,9. Ponieważ praca z tymi gigantycznymi protoplastami nie jest idealną, ani nawet praktyczną metodą dla większości gatunków bakterii, ponieważ wymaga manipulowania bakteriami w nienaturalnym i abiotycznym stanie, ograniczone badania polarności błony bakteryjnej, które zostały przeprowadzone, obejmowały przede wszystkim cytometrię przepływową oraz użycie barwników fluorescencyjnych cyjaniny i oksonolu10-16.

Zamiast cytometrii przepływowej, która zbiera indywidualne odczyty fluorescencji z jednej bakterii w jednym punkcie czasowym, zdecydowaliśmy się użyć czytnika płytek do wykrywania fluorescencji do wykrywania intensywności fluorescencji zawiesin bakteryjnych w formacie płytki 96-dołkowej w czasie. Umożliwiło nam to leczenie populacji bakterii w różnych punktach czasowych ze znacznie większą prostotą i łatwością oraz ciągłe monitorowanie kinetyki fluorescencji całej populacji przez dłuższy czas, co jest trudne do osiągnięcia przy użyciu cytometrii przepływowej. Po przetestowaniu szerokiej gamy potencjalnie wrażliwych barwników fluorescencyjnych (w tym wymienionych powyżej do stosowania w mitochondriach), osiągnęliśmy najlepszy sukces techniczny i praktyczny przy użyciu barwnika bis-oksonolowego o nazwie DiBAC4(3) (kwas bis-(1,3-dibutylobarbiturowy) trimetyny oksonolu) do monitorowania zmian polarności.

Uznaliśmy również za cenne jednoczesne monitorowanie zakłóceń integralności membrany za pomocą jodku propidyny (PI). Barwnik ten fluoryzuje po związaniu się z kwasem nukleinowym, ale jest w stanie to zrobić tylko wtedy, gdy integralność błony bakteryjnej jest naruszona, co czyni go popularnym składnikiem używanym do wykrywania martwych komórek w testach barwienia żywych-martwych. Oprócz PI, SYTOX green i TO-PRO-1 są barwnikami fluorescencyjnymi o podobnym działaniu i były wcześniej stosowane w przypadku bakterii w kilku badaniach z wykorzystaniem metod wykrywania cytometrii przepływowej17. Zdecydowaliśmy się na użycie PI ze względu na jego długość fali wzbudzenia, która pozwoliła nam monitorować jego fluorescencję jednocześnie z DiBAC w danej próbce.

W naszych badaniach zaobserwowaliśmy, że HAMLET, jak również inny pokrewny kompleks białkowo-lipidowy o działaniu bakteriobójczym, znany jako ELOA, indukowały depolaryzację i pęknięcie błony bakteryjnej, na co wskazuje wzrost fluorescencji obu barwników po leczeniu pneumokoków3,18,26. W przypadku obu kompleksów zaobserwowaliśmy, że intensywność fluorescencji DiBAC4 (3) wzrosła przed wzrostem intensywności PI, co wskazuje, że depolaryzacja nastąpiła przed pęknięciem, a zatem jest specyficznym zdarzeniem wywołanym przez nasze bakteriobójcze kompleksy białkowo-lipidowe. To rozróżnienie jest ważne, ponieważ pęknięcie membrany może samo w sobie powodować niespecyficzną depolaryzację. Jednoczesny pomiar i analiza kinetyki fluorescencji DiBAC4(3) i PI pozwolił nam zbadać tę zależność między dwoma zdarzeniami błonowymi, co jest dodatkową zaletą stosowania fluorometrii zamiast cytometrii przepływowej.

Do monitorowania przepływu jonów bakteryjnych odnieśliśmy pewne wcześniejsze sukcesy przy użyciu radioizotopów, w tym pomiar absorpcji 45Ca2+ w pneumokokach19,20, które również wykorzystaliśmy w naszych ostatnich badaniach 18,21. Jednak praca z tymi radioaktywnymi jonami ma kilka wad. Mogą być drogie, czasochłonne i niechlujne, a także mogą narazić osobę wykonującą eksperyment na szkody, w zależności od interesującego ją izotopu. Ponadto trudno jest monitorować szybkie zmiany w czasie. W związku z tym zwróciliśmy się w kierunku alternatywnej metody pomiaru, która wykorzystuje wersje estrów acetoksymetylowych (AM) wrażliwych na jony fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych. Sam barwnik wskaźnikowy jest naładowany i nie przechodzi łatwo przez membranę, ale po dodaniu lipofilowej grupy estrowej teraz nienaładowana cząsteczka może przejść przez błonę bakterii. Po dostaniu się do wnętrza esterazy bakteryjne rozszczepiają grupę estrową, pozostawiając barwnik wolny wewnątrz komórki i ponownie naładowany, znacznie spowalniając jego zdolność do opuszczania komórki i umożliwiając gromadzenie się barwnika w środku w miarę upływu czasu. Jednak zastosowanie tych barwników estrowych zostało opisane tylko u kilku gatunków bakterii w celu wykrycia zmian w wewnątrzkomórkowych Ca2 + 22-24 i H + 16, przy różnych metodach ładowania, wykrywania i sukcesu.

Z chęcią monitorowania zmian w wewnątrzkomórkowych poziomach Ca2+, a także K+ i H+ u S. pneumoniae po leczeniu HAMLET i innymi związkami, udało nam się stworzyć protokoły do efektywnego ładowania fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych do komórek bakteryjnych. Skuteczne ładowanie do bakterii wymagało zarówno probenecydu, który zwiększa retencję barwnika poprzez blokowanie transporterów anionów, jak i PowerLoad, zastrzeżonego związku firmy Life Technologies, który zwiększa wydajność ładowania. Fura-2/AM (wykrywający Ca2+), PBFI/AM (wykrywający K+) i BCECF/AM (wykrywający H+) z powodzeniem załadowano zarówno do niekapsułkowanych, jak i kapsułkowanych szczepów pneumokoków, umożliwiając pomiar otrzymanych wzorców fluorescencyjnych po dodaniu jonoforów, takich jak jonomycyna (rozprzęgaczCa2+), walinomycyna (rozprzęgacz K+) i CCCP (rozprzęgacz H+) za pomocą czytnika płytek do detekcji fluorescencji18, Lokal mieszkalny 21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie kultur bakteryjnych

  1. Uprawa kultury do wykorzystania w eksperymentach
    1. W bloku grzewczym o temperaturze 37 °C rozmrozić zamrożoną fiolkę z S. pneumoniae i dodać jej zawartość do 9 ml świeżego, wstępnie podgrzanego bulionu Todda-Hewitta z 0,5% ekstraktem drożdżowym (THY), co daje całkowitą objętość 10 ml w szklanej probówce hodowlanej.
    2. Inkubować statycznie w temperaturze 37 °C, aż kultura osiągnie środkową fazę logarytmiczną (Abs600nm ≈0,5-0,6).

2. Wykrywanie depolaryzacji i pęknięcia membrany

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Przygotować zapas 50 μM DiBAC4(3) w 100% DMSO i zapas 2 mg/ml PI w ddH2O. Stado DiBAC4(3) jest stabilne w temperaturze -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy. Stado PI jest stabilne w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 miesięcy.
    2. Zawiń buliony w folię, aby chronić przed światłem.
  2. Ładowanie bakterii
    1. Osadzać komórki bakteryjne z kroku 1.2.2 przez odwirowywanie przy 2 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przemyć dwukrotnie, usuwając supernatant, ponownie zawieszając osad w 10 ml 1 x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ponownie wirować przy 2 400 x g przez 10 minut.
    2. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w PBS do pierwotnej objętości. Zapewni to około 108 jednostek tworzących kolonie bakterii na ml. Usunąć 1 ml (wystarcza na 5 próbek) umytych komórek i umieścić w probówce do mikrowirówki.
    3. Do tych komórek dodać 25 μl 1 M sterylizowanego przez filtr roztworu podstawowego glukozy (przygotowanego w ddH2O i przefiltrowanego przez filtr 0,45 μm) do końcowego stężenia 25 mM glukozy i inkubować w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C przez piętnaście minut. UWAGA: Dostarcza to energię do wszystkich zależnych od ATP kanałów błonowych i składników komórkowych. Potrzeba wykonania tego kroku może się różnić w zależności od eksperymentu.
    4. Dodać 5 μl z 50 μM podstawowego DiBAC4(3) i 10 μl z 2 mg/ml PI. Przewiduje to końcowe stężenia odpowiednio 250 nM i 20 μg/ml. Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Dodać 200 μl tej zawiesiny komórek do każdej studzienki na próbkę z przezroczystej 96-dołkowej płytki.
  3. Wykrywanie fluorescencji
    1. Umieścić płytkę we wstępnie podgrzanym (37 °C) czytniku płytek do wykrywania fluorescencji.
    2. Upewnij się, że znajdują się odpowiednie filtry do wykrywania DiBAC4(3) (wzbudzenie 490 nm, emisja 516 nm) i PI (wzbudzenie 535 nm, emisja 617 nm).
    3. Aby umożliwić (i jednocześnie monitorować) równowagę DiBAC4(3) nad membraną, ustaw czytnik tak, aby wykonywał pomiary fluorescencji co minutę przez około 30-40 minut lub do momentu, gdy odczyt się ustabilizuje; służy to jako odczyt "przed obróbką".
    4. Wysunąć płytkę i dodać wybrany czynnik eksperymentalny, a następnie natychmiast umieścić płytkę z powrotem w czytniku, aby kontynuować monitorowanie DiBAC4(3) i fluorescencji PI przez żądany okres czasu. W przypadku jednoczesnego traktowania kilku próbek, pomocne może być użycie pipety wielokanałowej w celu jednoczesnego dodania środka do wszystkich studzienek.
    5. Eksportuj odczyty do programu do analizy danych, takiego jak Microsoft Excel. Wykreśl fluorescencję w czasie, aby ocenić depolaryzację i pęknięcie błony. Rosnąca fluorescencja DiBAC i PI wskazuje, że zachodzi depolaryzacja i pęknięcie.

3. Wykrywanie zmian w wewnątrzkomórkowych stężeniach Ca2+ lub K+

  1. Przygotowanie odczynników i załadowanie bufora
    1. Przygotować następujące odczynniki: 5 mM zapasu jonowego barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na jony (Fura-2/AM lub PBFI/AM; dodać odpowiednią ilość DMSO do probówki zawierającej 50 μg barwnika), "100x" probenecydu (dodać 1 ml PBS do fiolki 77 mg). Rozpuszczone barwniki można jednokrotnie zamrozić w temperaturze -20 °C i są one stabilne w roztworze przez 3 miesiące, podczas gdy probenecyd jest stabilny w roztworze w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy.
    2. Przygotuj 1 ml 2x buforu ładującego w następujący sposób: Na dno 15 ml plastikowej stożkowej probówki wlej 20 μl 100x koncentratu PowerLoad (stabilnego w temperaturze 2-8 °C przez 6 miesięcy), a następnie 2 μl barwnika wrażliwego na jony 5 mM bezpośrednio do PowerLoad. Krótko zmieszaj, aby wymieszać. Dodać 960 μl PBS, a następnie 20 μl 100x probenecydu. Zmieszaj mieszaninę po raz ostatni. Zawiń w folię, aby chronić przed światłem.
  2. Ładowanie bakterii barwnikiem
    1. Osadzać i przemywać kulturę bakteryjną w środkowej fazie logarytmicznej, jak opisano w ppkt 2.2.1. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml PBS, aby uzyskać zawiesinę komórek "2x".
    2. Dodać 1 ml zawiesiny 2x komórkowej do 2x buforu ładującego. Zapewni to końcową objętość 2 ml i końcowe stężenia 1x PowerLoad, 5 μM barwnika fluorescencyjnego i 1x probenecydu. UWAGA: Ta zawiesina zapewnia wystarczającą objętość dla 10 próbek, ponieważ każda próbka do pomiaru będzie zawierać 200 μl.
    3. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 75 minut, chroniąc przed światłem. UWAGA: Barwnik jest ładowany do komórek bakteryjnych przy braku jakichkolwiek substratów glikolitycznych i w obecności probenecydu w celu zminimalizowania wypływu barwnika.
    4. PŁUKANIE 1: Osadzać komórki przez odwirowanie przy 2 400 x g przez 10 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 2 ml PBS zawierającym 1x probenecyd. WASH 2, 3: Powtórz krok 3.2.4 2x. Inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 30 minut. Da to esterazom bakteryjnym czas na hydrolizę grupy estrów AM z dala od zinternalizowanych barwników fluorescencyjnych.
    5. PŁUKANIE 4: Osadzać komórki przez odwirowanie przy 2 400 x g przez 10 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 2 ml PBS zawierającego 1x probenecyd. UWAGA: W zależności od eksperymentu, glukoza może zostać dodana z powrotem w tym miejscu, aby ponownie pobudzić bakterie.
  3. Wykrywanie fluorescencji
    1. Rozgrzej płytkę z czytnikiem fluorescencji do czytnika płytek do pomiaru temperatury 37 °C.
    2. Dla każdej żądanej próbki dodać 200 μl załadowanych komórek (z kroku 3.2.8) do dołków płytki 96-dołkowej. (Wykonaj następujące kroki, aby zakończyć dla jednego dołka/próbki na raz).
    3. Aby ustalić odczyt linii bazowej dla studzienki, umieść płytkę w czytniku płytek do wykrywania fluorescencji, aby zmierzyć fluorescencję (wzbudzenie 340 nm / emisja 510 nm dla "wartości 1" i wzbudzenie 380 nm / emisja 510 nm dla "wartości 2") co sekundę przez jedną minutę.
    4. Wysunąć płytkę, dodać wybrany preparat do tej studzienki (w małej objętości około 5 μl), szybko pipetować w górę i w dół kilka razy, aby wymieszać, i natychmiast umieścić z powrotem w płytce do wykrywania fluorescencji, aby odczytywać co sekundę żądany okres czasu. (Jeśli dostępne są wtryskiwacze powiązane z czytnikiem płytek, można je również wykorzystać do bezproblemowego dodania żądanego zabiegu, eliminując potrzebę zatrzymywania odczytu i wysuwania płytki).
    5. Eksportuj odczyty do programu do analizy danych, takiego jak Microsoft Excel. Oblicz stosunek wartości fluorescencji dla każdego punktu czasowego, dzieląc wartość 1 przez wartość 2, a następnie narysuj wartości współczynnika na wykresie.

4. Wykrywanie zmian w pH wewnątrzkomórkowym

  1. Przygotowanie odczynników i kalibracyjnych
    1. Przygotować następujące odczynniki: 5 mM zapasu BCECF/AM (dodać odpowiednią ilość DMSO do probówki zawierającej 50 μg barwnika. Stado to utrzymuje się na stabilnym poziomie -20 °C przez 3 miesiące); 100x probenecyd (dodać 1 ml PBS do fiolki 77 mg); 1 mM preparat podstawowy nigerycyny w etanolu (wymagany do zrównoważenia wewnątrzkomórkowego pH (pHi) komórek z pH otaczającego buforu. Stado to utrzymuje się na stałym poziomie -20 °C przez 6 miesięcy); 0,5 mM zapasu 3-chlorofenylohydrazonu cyjanku karbonylu (CCCP) w DMSO (protonofor do rozprzęgania siły napędowej protonów. Stado to jest stabilne w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy)
    2. Przygotować 10 ml następujących o wysokiej zawartości potasu: 135 mM KH2PO4 / 20 mM NaOH (jednozasadowy) i 110 mM K2HPO4 / 20 mM NaOH (dwuzasadowy). Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,45 μm. (te mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do czasu użycia).
    3. Wymieszaj o wysokiej zawartości potasu w niezbędnych proporcjach, aby uzyskać o wysokiej zawartości potasu o co najmniej 5-6 wartościach pH w zakresie od 6,5 do 8,0.
    4. Przygotuj 1 ml buforu ładującego 2x w następujący sposób: Na dno plastikowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml dozuj 40 μl 100x PowerLoad, a następnie 20 μl barwnika wrażliwego na jony 5 mM bezpośrednio do PowerLoad. Krótko zmieszaj, aby wymieszać. Dodać 900 μl PBS, a następnie 40 μl 100x probenecydu. Zmieszaj mieszaninę po raz ostatni. Zawiń w folię, aby chronić przed światłem.
  2. Ładowanie bakterii barwnikiem
    1. Osadzać i przemywać 8 ml kultury bakteryjnej w środkowej fazie logarytmicznej, jak opisano w ppkt 2.2.1. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 2 ml PBS, aby uzyskać zawiesinę komórek "4x".
    2. Dodać 1 ml zawiesiny 4x komórkowej do 2x buforu ładującego. Zapewni to końcową objętość 2 ml i końcowe stężenia 2x komórek, 2x PowerLoad, 50 μM barwnika fluorescencyjnego i 2x probenecydu.
    3. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C przez 40 minut, chroniąc przed światłem. UWAGA: Barwnik jest ładowany do komórek bakteryjnych w niższej temperaturze 30 °C i przy braku jakichkolwiek substratów glikolitycznych w celu zminimalizowania wypływu barwnika.
    4. MYCIE 1: Osadzać komórki przez odwirowanie przy 2 400 x g przez 10 minut, usunąć supernatant w celu pozbycia się nadmiaru barwnika i ponownie zawiesić w 4 ml PBS zawierającym 2x probenecyd i 1 mM glukozy (w celu ponownego pobudzenia bakterii). PŁUKANIE 2, 3: Powtórzyć krok 4.2.7 dwukrotnie, z końcową rewizją w 4 ml PBS (dla końcowego stężenia 1x komórek) zawierającego 2x probenecyd i 10 mM glukozy.
    5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Pozwoli to komórkom w pełni się pobudzić i da czas esterazy bakteryjne na oddzielenie grupy estrów AM od zinternalizowanego BCECF.
  3. Wyznaczanie fluorescencji tła i krzywej kalibracyjnej in vivo
    1. Rozgrzej płytkę z czytnikiem fluorescencji do czytnika płytek do pomiaru temperatury 37 °C.
    2. Aby określić fluorescencję tła, należy przefiltrować i wysterylizować około 500 μl załadowanej i energetyzowanej zawiesiny bakteryjnej (od kroku 4.2.7) w celu usunięcia bakterii i dodać 200 μl filtratu do studzienki płytki 96-dołkowej.
    3. Umieścić płytkę w czytniku płytek do wykrywania fluorescencji, aby zmierzyć fluorescencję (wzbudzenie 490 nm / emisja 530 nm dla "wartości 1" i wzbudzenie 440 nm / emisja 530 nm dla "wartości 2") przez 1 min. Tę fluorescencję tła należy odjąć przed obliczeniem proporcji zarówno dla krzywej kalibracyjnej, jak i dla próbek doświadczalnych.
    4. Aby uzyskać krzywą kalibracyjną in vivo, należy przepłukać 500 μl podwielokrotności obciążonych i naenergetyzowanych komórek z kroku 4.2.7 i ponownie zawiesić w o wysokiej zawartości potasu przy różnych wartościach pH (w zakresie 6,5-8,0).
    5. Dodać 20 μM nigerycyny do próbek, aby zrównoważyć wewnątrzkomórkowe pH komórek z pH otaczającego buforu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 200 μl kombinacji bakterii/buforu pH do dołków 96-dołkowej płytki.
    6. Umieść płytkę w czytniku płytek do wykrywania fluorescencji, aby mierzyć fluorescencję przez kilka minut, aby ustalić stały odczyt dla każdej studzienki. Eksportuj odczyty do programu do analizy danych, takiego jak Microsoft Excel.
    7. Po odjęciu wartości fluorescencji tła oblicz stosunek wartości fluorescencji, dzieląc wartość 1 przez wartość 2. Wykreślić wartości proporcji dla każdego buforu pH, aby utworzyć krzywą kalibracyjną. (Krzywa kalibracyjna powinna być generowana dla każdej nowej partii załadowanych komórek, ponieważ ilość barwnika fluorescencyjnego, który jest wprowadzany do bakterii, może się zmieniać za każdym razem).
  4. Pomiar zmian pH wewnątrzkomórkowego
    1. Dla każdej żądanej próbki dodać 200 μl załadowanych i zasilanych energią komórek (z kroku 4.2.7) do dołków 96-dołkowej płytki.
    2. Umieścić płytkę w czytniku płytek do wykrywania fluorescencji i mierzyć fluorescencję próbek co 5 sekund przez 5 minut.
    3. Wyrzucić płytkę i dodać 10 μM CCCP do jednego studzienki (służy jako kontrola pozytywna dla obniżenia wewnątrzkomórkowego pH) oraz czynnik(-i) doświadczalny(-e) będący(-e) interesujący(-e) dla pozostałych studzienek. Aby dokładnie porównać ich efekty w czasie, dodaj CCCP i wybrane środki w tym samym czasie za pomocą pipety wielokanałowej.
    4. Natychmiast włóż płytkę z powrotem do czytnika płytek i kontynuuj pomiar fluorescencji co 5 sekund przez 10 minut. Jako dodatkową kontrolę, wysunąć płytkę i dodać 20 μM nigerycyny do wszystkich próbek, aby zrównoważyć pHi bakterii z pH otaczającego buforu i czytać przez 5 minut.
    5. Po odjęciu wartości fluorescencji tła oblicz współczynniki fluorescencji dla każdej próbki. Interpolować pHi dla każdego odczytu z krzywej kalibracyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla wszystkich eksperymentów, w każdej studni występuje jedna próbka i zestaw warunków. W ten sposób każde śledzenie reprezentuje intensywność fluorescencji całej populacji bakterii w czasie. Wyniki powinny być łatwe do zinterpretowania, z wyraźnym rozróżnieniem między fluorescencją próbek poddanych działaniu substancji a fluorescencją próbek niepoddanych działaniu substancji kontrolnych. Kinetyka i stopień zaobserwowanej zmiany fluorescencji mogą dostarczyć informacji na temat możliwego mechanizmu i zakresu mon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo ograniczenia, jakie stwarza rozmiar przy stosowaniu klasycznych metod elektrofizjologii do wykrywania zmian polarności i integralności błony oraz zmian w stężeniach jonów w bakteriach, opisaliśmy sposób pomiaru tych zdarzeń u S. pneumoniae za pomocą barwników fluorescencyjnych. Nasze protokoły są pierwszymi tego rodzaju opisanymi dla pneumokoków i jednymi z niewielu opisanych dla gatunków bakterii w ogóle. Za pomocą czytnika płytek do wykrywania fluorescencji zdarzenia te można mierzyć w małych próbkach b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Fundację Billa i Melindy Gatesów (Grant 53085), Fundację JR Oishei i Amerykańskie Towarzystwo Chorób Płuc (Grant RG-123721-N) dla APH, oraz stypendium NIH (NIDCD) F31DC011218 dla EAC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rosół Todda-HewittaBacto, BD Diagnostics249240
Ekstrakt drożdżowyBacto, BD Diagnostics212750
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS; pH 7,2)Invitrogen (GIBCO)
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD5879DMSO
DiBAC4(3) (kwas bis-(1,3-dibutylobarbiturowy) trimetyna oksonol)Sondy molekularneB-438
Jodek propidynySigma-AldrichP4170Uzupełnianie w wodzie dejonizowanej
D-(+)-GlucoseSigma-Aldrich
PowerLoadP10020100x koncentrat
Probenecydowesondy molekularneP36400Zrób 100x bulion, dodając 1 ml PBS do jednej fiolki
77 mgSondymolekularneF1221Opakowanie specjalne (50 &mikro; g aliquots)
PBFI/AMSondy molekularneP1267Opakowanie specjalne (50 &mikro; g aliquots)
NigericinSigma-AldrichN7143
KH2PO4JT Baker3246-01monobasic
NaOHJT Baker5565-01
K2HPO4JT Baker4012-01dwuzasadowe
sondy molekularneBCECF / AMB1170Opakowania specjalne (50 &mikro; g aliquots)
CCCPProtonofor Sigma-Aldricha, który powoduje napływ H+ do cytoplazmy, rozpraszając potencjał elektryczny i gradient H+.
Rurka hodowlana VWR53283-802Pasuje do spektrofotometru Spectronic; szkło borokrzemianowe
SpektrofotometrThermo ScientificSpectronic 20D+
15 ml Plastikowa rurka stożkowaCorning430790
Przezroczysta 96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania z polistyrenuFisher Scientific12-565-501
Czytnik płytekBioTekSynergy 2 Multi-Mode
OprogramowanieGen5 BioTekGen5&handel; Oprogramowanie
Sondy molekularne Fura-2/AM

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).
  2. Hakansson, A., et al. A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).
  3. Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex. PLoS One. 6 (3), (2011).
  4. Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria. Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).
  5. Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (Δψ m) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).
  6. Dominguez, D. C. Calcium signalling in bacteria. Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).
  7. Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family. Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).
  8. Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. A patch-clamp study of Bacillus subtilis. Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).
  9. Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).
  10. Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique. Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).
  11. Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).
  12. Shapiro, H. M. Membrane potential estimation by flow cytometry. Methods. 21 (3), 271-279 (2000).
  13. Shapiro, H. M. Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques. J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).
  14. Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions. Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).
  15. Suzuki, H., Wang, Z. -Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes. Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).
  16. Breeuwer, P., Abee, T. Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques. Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).
  17. Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).
  18. Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death. J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).
  19. Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential. J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).
  20. Trombe, M. C. Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence. J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).
  21. Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
  22. Futsaether, C. M., Johnsson, A. Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes. Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).
  23. Tisa, L. S., Adler, J. Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content. J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).
  24. Werthen, M., Lundgren, T. Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens. J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).
  25. Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).
  26. Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against. PLoS One. . 8, (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

depolaryzacja b onyprzerwanie b onytransport jonowydetekcja fluorescencyjnaczytnik p ytek

Powiązane artykuły