Artykuł metodologiczny

Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

DOI:

10.3791/51010

⸱

28 sierpnia 2014

 ,  , 
1Laboratoire Interfaces et Fluides Complexes, Université de Mons

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy nowy hydrożel poliakrylamidowy, zwany hydroksy-PAAm, który umożliwia bezpośrednie wiązanie białek ECM przy minimalnych kosztach i specjalistycznej wiedzy. Połączenie hydrożeli hydroksy-PAAm z nadrukiem mikrokontaktowym ułatwia niezależną kontrolę wielu sygnałów naturalnego mikrośrodowiska komórkowego w celu badania mechanostransdukcji komórkowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teraz dobrze wiadomo, że wiele funkcji komórkowych jest regulowanych przez interakcje komórek z fizykochemicznymi i mechanicznymi sygnałami środowiska ich macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Komórki eukariotyczne stale wyczuwają swoje lokalne mikrośrodowisko za pomocą mechanoczujników powierzchniowych, aby przekształcić fizyczne zmiany ECM w sygnały biochemiczne i zintegrować te sygnały w celu osiągnięcia określonych zmian w ekspresji genów. Co ciekawe, parametry fizykochemiczne i mechaniczne ECM mogą łączyć się ze sobą w celu regulowania losu komórki. Dlatego kluczem do zrozumienia mechanotransdukcji jest rozdzielenie względnego wpływu sygnałów ECM na funkcje komórkowe.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół eksperymentalny do szybkiego i łatwego generowania biologicznie istotnych hydrożeli do niezależnego dostrajania sygnałów mechanotransdukcji in vitro. Chemicznie zmodyfikowaliśmy hydrożele poliakrylamidowe (PAAm), aby przezwyciężyć ich wewnętrznie nieadhezyjne właściwości poprzez włączenie hydroksylowych monomerów akryloamidu podczas polimeryzacji. Otrzymaliśmy nowy hydrożel PAAm, zwany hydroksy-PAAm, który pozwala na immobilizację dowolnej pożądanej natury białek ECM. Połączenie hydrożeli hydroksy-PAAm z drukowaniem mikrokontaktowym pozwala na niezależną kontrolę morfologii pojedynczych komórek, sztywności matrycy, charakteru i gęstości białek ECM. Oferujemy prostą i szybką metodę, którą można zastosować w każdym laboratorium biologicznym do badania procesów mechanotransdukcji komórek in vitro. Weryfikujemy tę nowatorską dwuwymiarową platformę, przeprowadzając eksperymenty na komórkach śródbłonka, które wykazują mechaniczne sprzężenie między sztywnością ECM a jądrem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele aspektów lokalnego mikrośrodowiska komórkowego (np. sztywność, wielkość porów, natura białek czy gęstość komórek i ligandów) dostarcza zestawu współrzędnych sygnałów regulacyjnych, które kontrolują procesy komórkowe, takie jak ruchliwość, proliferacja komórek, różnicowanie i ekspresja genów. Modyfikacje właściwości fizykochemicznych środowiska zewnątrzkomórkowego mogą być odbierane przez komórki i powodować różne konsekwencje fizjologiczne, w tym deformację polaryzacji komórkowej, migracji i różnicowania. Nie jest jednak jasne, w jaki sposób komórki tłumaczą modyfikacje ECM na komórkowe sygnały biochemiczne. Dlatego tak ważne jest opracowanie kontrolowanych mikrośrodowisk in vitro, które mogą odtwarzać interakcje między komórkami i ich mikrośrodowiskiem w celu badania szlaków mechanotransdukcji. Aby rozwiązać ten problem, niedawno wprowadziliśmy nową metodę1, zwaną hydrożelami hydroksy-PAAm, do łatwego generowania dwuwymiarowych miękkich matryc, które pozwalają na niezależne kontrolowanie ważnych sygnałów mechanotransdukcji: sztywności matrycy, geometrii i uwięzienia komórki, charakteru białka i gęstości liganda komórki.

ECM kieruje procesami komórkowymi poprzez gradienty morfogenów (chemotaksja), białek adhezyjnych (haptotaksja) i sztywności (durotaxis). W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano zaawansowane platformy in vitro w celu wyizolowania tych sygnałów zewnątrzkomórkowych w celu ustalenia, w jaki sposób komórki są w stanie tłumaczyć cechy biochemiczne i biofizyczne na procesy fizjologiczne2-5. Wiązkaelektronów6, fotolitografia7, immobilizacja fotochemiczna8 lub techniki wspomaganeplazmą9 zostały opracowane w celu kierowania wzrostem żywych komórek na podłożach mikrowzorcowych. Chociaż techniki te przyniosły ważne wyniki, większość z nich nie pozwala na rozróżnienie między indywidualnym wpływem różnych sygnałów na zachowanie komórek i wymagają zaplecza technicznego, na które niewiele laboratoriów może sobie pozwolić. Wśród tych technik druk mikrokontaktowy (μCP) okazał się solidną i dostępną metodą tworzenia mikrowysp adhezyjnych10. Ostatnio podjęto szeroko zakrojone wysiłki11-14 w celu opracowania μCP na hydrożelach o regulowanej sztywności w celu odtworzenia szerokiego zakresu sztywności obserwowanych w żywych tkankach. Wśród tych prac popularny stał się poliakrylamid (PAAm)15 i jest już jedną z najczęściej stosowanych matryc na bazie polimerów do testów biomechaniki komórki.

PAAm powierzchnie są powszechnie funkcjonalizowane za pomocą heterobifunkcyjnego sieciera N-sulfosukcynimidylo-6-[4'-azydo-2'-nitrofenyloamido] (sulfo-SANPAH), a białka ECM są połączone z powierzchnią przez aktywację UV grup azydekowych nitrofenylu SANPAH16. Inna technika polega na sprzęganiu hydrazyny z białkami, które zostały silnie utlenione periodianem17. Hynd i współpracownicy wprowadzili technikę modelowania powierzchni biomimetycznego hydrożelu za pomocą białka i peptydów, która wymaga fotopolimeryzacji w obecności monomeru akroylowo-streptawidyny18. Niedawno Tseng i in. opisali nową metodę mikromodelowania19 opartą na głębokiej ekspozycji PAAm na promieniowanie UV przez optyczną maskę kwarcową, która wymaga inkubacji aktywowanych żeli PA z roztworami wodnymi chlorowodorku 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo] karbodimidu (EDC) i N-hydroksysukcynimidu (NHS) przed dodaniem białka. Pomimo zdolności tych technik do tworzenia jednorodnych i powtarzalnych mikrowzorów białek, większość z nich ma poważne ograniczenia: długie procesy syntezy (np. dializa, liofilizacja itp.), drogie związki chemiczne (np. kwas hialuronowy, sulfo-SANPAH) czy głębokie naświetlanie promieniowaniem UV. Ponadto techniki te nie pozwalają na niezależną modulację sztywności podłoża, geometrii mikrowzoru, charakteru białka ECM i gęstości komórka-ligand.

Biorąc pod uwagę te ograniczenia, opracowaliśmy nowatorskie i proste podejście oparte na akrylamidzie, które pozwala na immobilizację różnych białek i biomolekuł na miękkich hydrożelach i pozwala na niezależne dostrajanie sygnałów mechanotransdukcji w celu rozszyfrowania ich roli w funkcjach komórkowych. Zamiast traktować hydrożele PAAm ostrymi związkami chemicznymi, wprowadzamy komercyjny monomer akryloamidu z grupami hydroksylowymi podczas polimeryzacji PAAm. Ta prosta operacja pozwala przezwyciężyć wewnętrzne właściwości antyadhezyjne hydrożeli PAAm bez żadnych innych wymagań technicznych.

Obecność grup hydroksylowych prowadzi do wysokiego powinowactwa hydrożeli hydroksy-PAAm do białek i biomolekuł, które tworzą oddziaływania wiążące wodór. W połączeniu z μCP, hydrożele hydroksy-PAAm umożliwiają szybkie generowanie dwuwymiarowej platformy hodowlanej z niezależną kontrolą sztywności matrycy, rodzaju białek ECM, gęstości komórka-ligand i ograniczonej adhezji, które mają być potężną platformą do badania mechanotransdukcji.

Celem tego protokołu jest dostarczenie niezbędnych informacji do łatwego wytwarzania hydrożeli hydroksy-PAAm bez żadnej wiedzy z zakresu materiałoznawstwa. Ostatecznym celem jest zapewnienie naukowcom środków do zadawania fizjologicznie istotnych pytań na poziomie komórkowym i tkankowym, które mogą prowadzić do lepszego zrozumienia szlaków mechanotransdukcji zaangażowanych w mechanizmy patofizjologiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Aktywacja powierzchni szklanych szkiełek nakrywkowych

  1. Umieścić szklane okrągłe szkiełka nakrywkowe (o średnicy 25 mm) na szalce Petriego i rozsmarować na niej 0,1 M roztwór NaOH przez 5 minut (zalecany wyciąg chemiczny).
  2. Usuń roztwór NaOH i całkowicie zanurz szkiełka nakrywkowe w sterylnym ddH2O na 20 minut, delikatnie kołysząc na kołyszącej się płytce w sterylnym kapturze hodowlanym.
  3. Odcedzić sterylny ddH2O i powtórzyć krok 1.2.
  4. Usuń szkiełka nakrywkowe sterylną pęsetą i umieść je na nowej szalce Petriego aktywowaną stroną zadrukowaną do góry.
  5. Suche szkiełka nakrywkowe przy stałym przepływie azotu o wysokiej czystości.
  6. W sterylnym kapturze hodowlanym rozsmarować cienką warstwę akrylanu 3-(trimetoksysililo)propylu (92%) po aktywowanej stronie szkiełka nakrywkowego przez 1 godzinę.
  7. Szkiełka nakrywkowe należy dokładnie umyć 3 popłuczynami sterylnego ddH2O i zanurzyć je w sterylnym ddH2O na nowej szalce Petriego.
  8. Postukaj w szalkę Petriego Parafilmem i umieść ją na talerzu kołyskowym pod delikatnym mieszaniem przez 10 minut.
  9. Usunąć szkiełka nakrywkowe z ddH2O za pomocą sterylnej pęsety z cienkimi końcówkami i umieścić je na nowej szalce Petriego aktywowaną stroną zadrukowaną do góry.
  10. Przechowywać w RT w suchym miejscu z folią aluminiową, aby uniknąć przywierania kurzu do szkiełek nakrywkowych.

2. Przygotowanie hydrożeli Hydroxy-PAAm

  1. Przygotować 65 mg N-hydroksyetyloakryloamidu (HEA) w 1,5 ml probówki Eppendorfa. Ważne jest, aby przygotować świeży roztwór HEA.
  2. Dodać 1 ml 50 mM buforu HEPES do HEA i mieszać za pomocą wirownika aż do całkowitego rozpuszczenia HEA.
  3. Dodać 400 μl 40% w/w w roztworze akryloamidu HEPES i wymaganą objętość 2% w/w w roztworze bis-akrylamidu HEPES (patrz Tabela 1), aby osiągnąć pożądaną sztywność hydrożelu. Za pomocą 50 mM HEPES doprowadzić do końcowej objętości 5 ml.
  4. Wymieszać roztwór za pomocą wirownika i odgazować go w komorze próżniowej przez 20 minut w celu zmniejszenia stężenia tlenu w roztworze, co zapobiega polimeryzacji hydroksy-PAAm.
  5. Pod sterylnym kapturem przefiltruj odgazowany roztwór za pomocą filtra o wielkości porów 0,2 μm w celu jego sterylizacji.
  6. Aktywuj okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe (o średnicy 22 mm) w środku czyszczącym UV/ozonem przez 7 minut.
  7. Przygotować 100 μl 10% roztworu nadsiarczanu amonu (APS), czyli 10 mg APS w 100 μl ddH2O. Ważne jest, aby przygotować świeży roztwór APS.
  8. Dodać 2,5 μl tetrametylenodiaminy (TEMED) i 25 μl roztworu APS do wysterylizowanego roztworu hydroksy-PAAm (krok 2.5), aby rozpocząć polimeryzację. Wymieszać roztwór przez 3 kolejne pipetowanie bez wprowadzania pęcherzyków, w sterylnych warunkach.
  9. Pod sterylnym kapturem umieścić 25 μl kropli roztworu hydroksy-PAAm na szkiełku nakrywkowym o średnicy 25 mm (dostępne od kroku 1.9) i natychmiast umieścić szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm (przygotowane w kroku 2.5) na wierzchu kropli, aby wycisnąć roztwór hydroksy-PAAm. Wyśrodkuj szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm sterylną pęsetą i wygładź wszelkie pęcherzyki.
  10. Pozostawić hydrożele hydroksy-PAAm do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Odwrócić ręcznie pozostały roztwór hydroksy-PAAm w probówce Eppendorfa, aby zakończyć proces polimeryzacji.
  11. Całkowicie zanurz szkiełka nakrywkowe w sterylnym ddH2O i ostrożnie oddziel szkiełka nakrywkowe o średnicy 22 mm, wprowadzając krawędź żyletki między szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 22 mm a warstwę hydrożelu hydroksy-PAAm.
  12. Umyj hydrożele hydroksy-PAAm sterylnym PBS (3 wymiany PBS) i pozostaw żele całkowicie zanurzone w sterylnym PBS, aby utrzymać nawilżenie.
  13. Hydrożele hydroksy-PAAm należy przechowywać w sterylnym PBS w temperaturze 4 °C przez okres do 3 dni.

3. Wytwarzanie mikroznaczków z polidimetylosiloksanu (PDMS)

UWAGA: Przed rozpoczęciem produkcji mikrostempla PDMS wymagane jest wyprodukowanie wzorca krzemowego. To mikrowytwarzanie wzorca krzemowego można wykonać technikami litograficznymi, co wymaga specjalistycznego sprzętu i szkolenia. Zachęca się do współpracy z zakładem zajmującym się nanofabrykacją w celu wytworzenia wzorca krzemowego. Możesz też skontaktować się z firmą, która na żądanie wytwarza na żądanie mikrostrukturalne wzorce krzemowe. Ważne jest, aby pamiętać, że produkcja wzorca krzemowego musi być wykonana tylko raz. Rzeczywiście, mikrostrukturalne wzorce krzemowe mogą być używane w nieskończoność do produkcji stempli elastomerowych.

  1. Wymieszaj PDMS i utwardzacz w proporcji 10:1 w plastikowej zlewce i dokładnie mieszaj za pomocą pipety przez 10 minut.
  2. Odgazować mieszaninę PDMS w próżni w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, które powstały podczas kroku 3.1.
  3. Umieść mikrostrukturalny wzorzec krzemowy na szalce Petriego i rzuć na niego warstwę odgazowanej mieszaniny PDMS o grubości 10 mm, nie tworząc pęcherzyków.
  4. Pozostaw PDMS do utwardzenia przez 2 godziny w temperaturze 60 °C w piekarniku.
  5. W środowisku wolnym od kurzu należy odkleić warstwę PDMS i wyciąć skalpelem 1 cm2 mikrostemple
    6. .
  6. Za pomocą kleszczy umieść mikrostemple PDMS na szalce Petriego.

4. Hydrożele hydrożelowe Hydroxy-PAAm do mikromodelowania

  1. Umieść mikrostemple PDMS w roztworze etanolu/wody (50/50) i poddaj sonikacji przez 15 minut.
  2. Wysuszyć stemple strumieniem strumienia azotu i umieścić je w urządzeniu do czyszczenia UV/Ozone (λ < 200 nm) na 7 minut.
  3. Pod sterylnym kapturem umieść 150 μl kropli pożądanego roztworu białkowego (np. 100 μg/ml lamininy w PBS lub 25 μg/ml fibronektyny w PBS) na mikrostrukturalnej powierzchni 1-cm2 stempla PDMS.
  4. Opcjonalnie: Zmodyfikuj stężenie roztworu białkowego, aby modulować gęstość liganda komórkowego.
  5. Rozprowadź roztwór białka na powierzchni stempla, przesuwając go sterylną końcówką pipety w kierunku każdego rogu stempla.
  6. Pozostaw roztwór białkowy do adsorpcji na stemplu PDMS na 60 minut pod sterylnym kapturem. Wyłącz lampy, aby uniknąć uszkodzenia białka.
  7. Pod sterylnym kapturem przenieś szkiełka nakrywkowe pokryte hydroksy-PAAm (dostępne od kroku 2.13) na szalkę Petriego.
  8. Usunąć nadmiar PBS z powierzchni substratów hydroksy-PAAm za pomocą strumienia o niskiej zawartości azotu w sterylnych warunkach. Przerwij procedurę, gdy tylko nie zauważysz śladów stojącej wody na powierzchni żelu. Na tym etapie żelu nie należy dokładnie suszyć.
  9. Dokładnie osusz strukturalną powierzchnię stempla PDMS stałym strumieniem azotu o wysokiej czystości.
  10. Chwyć stempel pokryty białkiem za pomocą kleszczyków do tkanek opatrunkowych i umieść strukturalną powierzchnię w kontakcie z wysuszoną powierzchnią hydrożelu. Nakładaj krótkie punkty nacisku końcówką pęsety na górze stempla PDMS, aby zapewnić dobry kontakt między mikroelementami stempla a powierzchnią hydrożelu.
  11. Pozostaw stempel PDMS na powierzchni hydrożelu na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  12. Delikatnie usuń stempele PDMS z hydrożeli hydroksy-PAAm za pomocą kleszczyków do tkanek opatrunkowych i postępuj zgodnie z krokiem 4.1, aby wyczyścić stempel.
  13. Tłoczone hydrożele hydroksy-PAAm należy dokładnie przemyć przez 3 wymiany PBS (pH = 7,4) w sterylnych warunkach przez 10 minut na wymianę.
  14. Opcjonalnie: Dodatkowe mikrowzorce innych białek ECM można dodać do powierzchni hydroksy-PAAm, wykonując kroki od 4.5 do 4.11.
  15. Pasywować niezadrukowane strefy sterylnym roztworem BSA w dawce 5 mg/ml w PBS przez jedną noc w temperaturze 4 °C pod delikatnym mieszaniem na kołyszącej się płycie.
  16. Intensywnie myć przez 3 wymiany PBS (pH = 7,4) w sterylnych warunkach przez 10 minut na wymianę. Na tym etapie tłoczone hydrożele hydroksy-PAAm można przechowywać w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia.

5. Osadzanie komórek na mikrowzorcowych hydrożelach hydroksy-PAAm

  1. Inkubować szkiełka nakrywkowe w pożywce komórkowej przez 30-45 minut przed posiewem komórek.
  2. Przemyć przylegające komórki hodowane w kolbie hodowlanej o długości 75cm2 sterylnym PBS w temperaturze 37 °C i odłączyć je 3 ml trypsyny-EDTA lub akutazy na 10 minut.
  3. Przenieść żądaną ilość wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki wzrostowej odpowiedniej dla danej linii komórkowej do kolby zawierającej oderwane komórki i odwirować zawiesinę komórek przez 3 minuty przy 650 x g.
  4. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety i ponownie zawiesić komórki w kompletnej pożywce hodowlanej w stężeniu 15-20 000 komórek/ml.
  5. Dodać 4 ml roztworu komórkowego do szkiełka nakrywkowego z mikrowzorem (otrzymanego z kroku 5.1) i umieścić szkiełko nakrywkowe pokryte komórkami w inkubatorze do hodowli w temperaturze 37 °C i wilgotności 5% na 1-2 godziny.
  6. Odessać delikatnie odczepione komórki i wymienić pożywkę hodowlaną. Umieść przyczepione komórki z powrotem w inkubatorze i pozwól im się całkowicie rozprzestrzenić (3-6 godzin, w zależności od typu komórki).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1A przedstawia kopolimeryzację akrylamidu (AAm) i bisakryloamidu (bis-AAm) z monomerami N-hydroksyetyloakrylamidu (HEA) zawierającymi pierwszorzędowy hydroksyl utworzony przez losową polimeryzację rodnikową, hydrofilową sieć poliakrylamidu z osadzonymi grupami hydroksylowymi (hydroksy-PAAm). W tym protokole waga 65 mg HEA musi być rozcieńczona w objętości 1 ml HEPES. Wiedząc, że gęstość HEA jest w przybliżeniu równa jeden, zakładamy, że otrzymujemy objętość roboczą 1,065 μl (HEA+HEPES). Jak przed...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele obserwacji in vitro we współczesnej biologii komórki przeprowadzono na szkiełkach nakrywkowych ze szkiełka nakrywkowego, często pokrytych cienką warstwą białek ECM lub syntetycznych peptydów zawierających sekwencję RGD. Jednak takie podstawowe substraty hodowlane nie podsumowują całej złożoności fizykochemicznej ECM, a tym samym nie zapewniają dokładnego modelu do badania komórkowych procesów mechanotransdukcji. Aby rozwiązać ten problem, proponujemy prostą alternatywę dla funkcjonalizacji dwuwymiarowych h...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Belgijską Narodową Fundację Badań Naukowych (F.R.S.-FNRS) poprzez granty "MIS Confocal Microscopy", "Crédit aux Chercheurs" oraz "Nanomotorility FRFC project" (nr 2.4622.11). Stypendium doktoranckie T.G. jest wspierane przez Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). Autorzy dziękują Sylvainowi Desprezowi za charakterystykę mechaniczną i Géraldine Circelli za obrazowanie konfokalne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fotoreaktor UV/ozon Produkty ultrafioletoweModel PR-100
Płyta kołyszącaIKAcWerkeModel KS 130 Podstawowy
wirownikPrzemysł naukowyModel Vortex Genie2
Komora odgazowywania próżniowegoStosowana inżynieria próżniowaDP-8-KIT
ParafilmSigma-AldrichP7793-1EA
Kleszczyki ze stali nierdzewnej z cienką końcówkąSigma-AldrichZ225304-1EA
Kleszczyki do opatrunkówtkankowych Sigma-AldrichF4392-1EA
Szalki Petriego z polistyrenuSigma-AldrichP5731-500EA
Folia aluminiowa, grubość 0,5  mmSigma-Aldrich266574-3.4G
Filtr membranowy izoporowy (0,2 &mikro; m wielkość porów)MilliporeGTTP Kod
Okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe (średnica 22 mm)NeuvitroGG-22
Okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe (średnica 25 mm)NeuvitroGG-25
Mikropipeta o zmiennej objętościSigma-AldrichZ114820
Probówki do mikrowirówek białkowychSigma-AldrichZ666505-100EA
Uchwyty do skalpeliSigma-AldrichS2896-1EA
Ostrza skalpelaSigma-AldrichS2771-100EA
Kolby do hodowli komórkowych (75 cm2)Sigma-AldrichCLS430641
Ultradźwiękowa brodzik do kąpieli, lita (stal nierdzewna)Sigma-AldrichZ613983-1EA
Polidimetylosiloksan Zestawelastomerów silikonowych Dow Corning Sylgard 184
Akrylamid (proszek)Sigma-AldrichA3553
N,N'-Metylenobis(Akrylamid)Sigma-Aldrich146072
N-hydroksyetyloakryloamidSigma-Aldrich697931
N,N,N',N'-TetrametyloetylenodiaminaSigma-AldrichT9281
Persiarczan amonu (APS)Sigma-AldrichA3678
Akrylan 3-(trimetoksysililo)propyluSigma-Aldrich1805
Fibronektyna z ludzkiego osoczaMilliporeFC010
Laminina z EHSSigma-AldrichL2020
Hydroksyd soduSigma-Aldrich221465-25G
Woda podwójnie destylowana (ddH2O)
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonkaZastosowania komórek211K-500
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)InvitrogenC-003-5C
Laboratoria AccutasePAAL11-007
Roztwór buforowy HEPES 1 M w H2OSigma-Aldrich83264-500ML-F
Antybiotyki-leki przeciwgrzybiczeLaboratoria PAAP11-002
Bufor fosforanowy Roztwór soli fizjologicznejLaboratoria PAAH15-002
Alexa Fluor 488Sondy molekularneA12379
Przeciwciało anty-winkulinowe wytwarzane u myszySigma-AldrichV9131
Koza anty-mysz przeciwciało-tetrametylodaminaSondy molekularneT-2762
Anty-Fibronektyna (królik)Sigma-AldrichF3648
Streptawidyna Sigma-Aldrich41469
Przeciwciało anty-Laminin (królik)Sigma-AldrichL9393
Przeciwciało przeciw królikowi IgG-FITCSigma-AldrichF7512
Roztwór trypsyny-EDTASigma-AldrichT3924-100ML
Etanol absolutnySigma-Aldrich459844-2.5L
filtra Phaloidin

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
  2. Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking. Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).
  3. Atmanli, A., Domian, I. J. Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing. J. Vis. Exp. (73), e50288(2013).
  4. Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays. Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).
  5. Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes. Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).
  6. Rundqvist, J., et al. High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation. J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).
  7. Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications. Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).
  8. Holden, M. A., Cremer, P. S. Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces. J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).
  9. Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture. Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).
  10. Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching. Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).
  11. Tseng, Q., et al. New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).
  12. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS ONE. 7, e51499(2012).
  13. Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).
  14. Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli. Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).
  15. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
  16. Hemphill, M. A., et al. A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury. PLoS ONE. 6 (7), e22899(2011).
  17. Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
  18. Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).
  19. Tseng, Q., et al. new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells. Nat. Commun. 3, 671(2012).
  21. Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus. Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).
  22. Trappman, B., Chen, C. S. How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective. Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hydroxy PAAm HydrogelsMechanotransduction CuesPolyacrylamide HydrogelsMicrocontact PrintingECM Protein ImmobilizationCell Morphology ControlMatrix Stiffness TuningFluorescence MicroscopyEndothelial Cell AnalysisMechanical Coupling

Powiązane artykuły