Izolacja i hodowla komórek śródbłonka z zarodka przodomózgowia

Podsumowanie

Ten film demonstruje łatwą i niezawodną strategię przygotowania czystych kultur komórek śródbłonka z embrionalnej przodomózgowia w ciągu 10-12 dni i będzie przydatny do badań skoncentrowanych na wielu aspektach angiogenezy mózgowej.

Streszczenie

Embrionalne komórki śródbłonka mózgu mogą służyć jako ważne narzędzie w badaniach nad angiogenezą oraz rozwojem i interakcjami nerwowo-naczyniowymi. Dwie sieci naczyniowe embrionalnej przodomózgowia, pialna i okołokomorowa, są przestrzenne i mają różne pochodzenie i wzorce wzrostu. Komórki śródbłonka z sieci naczyniowej i okołokomorowej mają unikalne profile ekspresji genów i funkcje. W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji, hodowli i weryfikacji czystych populacji komórek śródbłonka z okołokomorowej sieci naczyniowej (PVEC) zarodkowego przodomózgowia (kresomózgowie). W tym podejściu kresomózgowie pozbawione błony płucnej uzyskane od myszy w 15. dniu embrionalnym jest mielone, trawione kolagenazą/dyspazą i rozpraszane mechanicznie do zawiesiny pojedynczej komórki. PVEC są oczyszczane z zawiesiny komórkowej przy użyciu pozytywnej selekcji przeciwciałem anty-CD-31/PECAM-1 sprzężonym z mikrokulkami przy użyciu metody silnej separacji magnetycznej. Oczyszczone komórki hoduje się na szalkach hodowlanych pokrytych kolagenem 1 w pożywce do hodowli komórek śródbłonka, aż staną się zlewające się i dalej subhodowane. PVEC uzyskane za pomocą tego protokołu wykazują fenotypy w kształcie kostki brukowej i wrzeciona, co zostało uwidocznione za pomocą mikroskopii światła z kontrastem fazowym i mikroskopii fluorescencyjnej. Czystość kultur PVEC ustalono za pomocą markerów komórek śródbłonka. W naszych rękach metoda ta niezawodnie i konsekwentnie daje czyste populacje PVEC. Protokół ten przyniesie korzyści badaniom mającym na celu uzyskanie mechanistycznego wglądu w angiogenezę przodomózgowia, zrozumienie interakcji PVEC i wzajemnych oddziaływań z typami komórek neuronalnych i ma ogromny potencjał terapeutyczny w angiogenezie.

Wprowadzenie

Angiogeneza, neurogeneza i migracja neuronów są krytycznymi wydarzeniami w rozwoju, naprawie i regeneracji ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Kilka eleganckich badań wykazało, że komórki śródbłonka stymulują proliferację neuronów i odwrotnie poprzez uwalnianie rozpuszczalnych czynników i bezpośredni kontakt. Za ciekawe uznałyśmy fakt, że w większości tych badań^1-3, podczas gdy neuronalne komórki progenitorowe/nerwowe komórki macierzyste są izolowane z mózgu embrionalnego, są one współhodowane z komórkami śródbłonka z dorosłego mózgu, innymi źródłami tkanek dorosłych lub liniami komórkowymi śródbłonka. Może to być częściowo spowodowane trudnościami technicznymi związanymi z izolacją i hodowlą czystych populacji komórek śródbłonka z mózgu embrionalnego. Jednak angiogeneza, neurogeneza i migracja neuronów są równoczesnymi zdarzeniami zachodzącymi o rzędy wielkości silniej w mózgu embrionalnym niż w normalnym mózgu dorosłego. Okołokomorowa sieć naczyniowa zarodkowego przodomózgowia (kresomózgowie) pochodzi z naczynia znajdującego się w obrębie zawiązka zwojów podstawy i rozwija się w postaci uporządkowanego gradientu od brzusznej do grzbietowej kresomózgowia do 11. dnia embrionalnego (E11)^4,5. Ten splot naczyń sieci naczyniowej okołokomorowej różni się od naczyń pialnych na podstawie pochodzenia, położenia anatomicznego, wzorców wzrostu i regulacji rozwoju^4,5. Kierunek propagacji gradientu angiogenezy okołokomorowej jest zgodny z poprzecznym gradientem neurogenetycznym kresomózgowia. W obrębie kresomózgowia gradient angiogenezy okołokomorowej i gradient neuronów GABA migrujących stycznie nakładają się również przestrzennie⁶. Jeśli chodzi o czas, gradient angiogenezy wyprzedza gradient neurogenetyczny i gradient neuronów GABA o około jeden dzień. W związku z tym komórki śródbłonka okołokomorowego są dobrze usytuowane przestrzennie i czasowo, aby dostarczyć krytycznych wskazówek wspierających neurogenezę kresomózgowia i migrację neuronów^4,6. W związku z tym wykorzystanie embrionalnych komórek śródbłonka okołokomorowego w eksperymentach kokulturowych z neuronalnymi progenitorami i / lub neuronami zapewniłoby bardziej korzystny model do badania interakcji nerwowo-naczyniowych i opracowywania nowych dróg leczenia chorób neurodegeneracyjnych lub niedokrwiennego/urazowego uszkodzenia mózgu.

Podkreślamy znaczenie usunięcia błony nabłonkowej, nie tylko w celu ograniczenia zanieczyszczenia komórek nabłonkowych, ale także w celu oddzielenia komórek śródbłonka, które są molekularnie i funkcjonalnie różne od komórek śródbłonka sieci naczyniowej okołokomorowej^4,6 (określanych jako PVEC dla odróżnienia od EC nabłonka). W tym miejscu opisujemy metodę, którą rutynowo stosujemy w naszym laboratorium, aby uzyskać bogatą i czystą wydajność PVEC. Te komórki śródbłonka są przygotowywane z embrionalnej przodomózgowia wyizolowanej od pojedynczej myszy w ciąży. Można je rozszerzać, subkulturować i z powodzeniem zamrażać do wykorzystania w przyszłości.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników i roztworów

1. Powłoka naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm: Roztwór kolagenu typu 1 jest dostarczany w postaci roztworu wodnego w 20 mM kwasie octowym (~100 mg białka/fiolkę). Rozcieńczyć odpowiednią objętość roztworu kolagenu do stężenia roboczego 0,01% przy użyciu sterylnej wody do hodowli tkankowych. Naczynia należy pokryć 1 ml roztworu kolagenu przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej (RT) lub 37 °C lub przez noc w temperaturze 2-8 °C. Usunąć nadmiar roztworu z powlekanego naczynia i pozostawić do wyschnięcia na noc. Opłucz naczynie wodą z kultur tkankowych lub PBS przed dodaniem pożywki. Naczynia powlekane można przechowywać w temperaturze 4 °C przez jeden miesiąc.
2. Przygotuj kompletne podłoże Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Uzupełnij DMEM (500 ml) w 10% FBS i roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (1x stężenie; 1 ml/100 ml). Kompletny DMEM może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez dwa miesiące.
3. Przygotować podwielokrotność (50 ml) DMEM z DNazą I (0,001 mg/ml) (określaną jako DMEM-DNaza I).
4. Przygotować kolejną porcję (10 ml) DMEM z kolagenazą i dypazą (1 mg/ml) (określaną jako DMEM-kolagenaza/dispaza).
5. Przygotować pożywkę do hodowli komórek śródbłonka (ECCM, 500 ml), uzupełnioną EGF (5 μg), EKG (100 mg) i 5 μl roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego. ECCM można przechowywać w temperaturze 4 °C przez dwa miesiące.
6. Podgrzej wszystkie media przed użyciem.
7. Przygotować bufor oczyszczający: PBS, pH 7,2 z 0,5% BSA i 2 mM EDTA. Przechowywać bufor w niskiej temperaturze (2-8 °C).

2. Usuwanie zarodków i rozwarstwianie kresomózgowia

Wszystkie eksperymenty z użyciem zwierząt laboratoryjnych są zatwierdzane przez komitety ds. opieki nad zwierzętami i ich użytkowania w McLean Hospital i są zgodne z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Użyj ciężarnych myszy CD1 w czasie (15 dzień embrionalny). Dzień odkrycia czopa dopochwowego jest uważany za dzień embrionalny 0 (E0). Matki CD1 na ogół produkują duże mioty, więc od ciężarnej matki oczekuje się 10-12 zarodków.
2. W przypadku histerotomii należy znieczulić ciężarne myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (100 mg / kg) / ksylazyny (5 mg / kg). W przypadku myszy o wadze około 20-30 g należy dostarczyć 0,3 ml roztworu znieczulającego o stężeniu 10 ml/kg ketaminy/ksylazyny i upewnić się, że ból i niepokój są minimalne podczas dootrzewnowych wstrzyknięć środka znieczulającego. Do wstrzykiwań należy stosować środki przytrzymujące ręce.
3. Sprawdź głębokie znieczulenie przez uszczypnięcie palca u nogi. Usuń zarodki od głęboko znieczulonych myszy. Odetnij głowę każdemu zarodkowi natychmiast po usunięciu go od matki. Umieść głowy zarodków na sterylnych szalkach Petriego w lodowatym PBS.
4. Po histerektomii należy dokonać natychmiastowej eutanazji z przedawkowaniem środka znieczulającego (130 mg/kg pentobarbitalu, i.p.), metody eutanazji, która jest zgodna z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt: wydanie z 2013 r.
5. Pod mikroskopem stereoskopowym usuń mózg z głowy za pomocą cienkich nożyczek z mikrokońcówkami i cienkich kleszczy. Uwaga: Wysokiej jakości sekcja jest niezbędna do skutecznego usunięcia błony jajowej z mózgu embrionalnego. Osiąga się to poprzez praktykę. Cienkie kleszcze i nożyczki z mikrokońcówkami są również kluczowymi narzędziami do uzyskania dobrej sekcji.
6. Użyj kleszczy, aby mocno chwycić mózg i nożyczek z mikrokońcówkami, aby odkleić błonę włosową. Usuń śródmózgowie i śródmózgowie i odizoluj kresomózgowie. Przenieść kresomózgowie wolne od pialu ze wszystkich zarodków do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm z 2 ml PBS w lodzie.

3. Izolacja komórek

1. Zmielić kresomózgowie na fragmenty o średnicy 1-2 mm za pomocą ostrza skalpela i zebrać tkankę w 15 ml probówce Falcon zawierającej 2 ml kompletnego DMEM.
2. Delikatnie, ale dokładnie rozdzielić tkankę za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aż do zniknięcia grudek i uzyskania mlecznej zawiesiny.
3. Odwirować zdysocjowane komórki przy 800-1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w DMEM-DNaza I. Delikatnie ponownie rozdzielić komórki za pomocą pipety 1 ml i odwirować przy 800-1,000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Ponownie zawiesić osad w ciepłym, kompletnym DMEM. Przefiltruj komórki przez sterylną siatkę nylonową o grubości 70 μm. Zbierz przefiltrowane komórki i trzymaj w lodzie.
6. Zebrać części komórek zatrzymane na siatce i dalej trawić za pomocą kolagenazy DMEM/dypazy (2 ml) przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej. Przemyć komórki 3x w DMEM-DNazie I przez wirowanie w temperaturze 800-1000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Połączyć te komórki z przefiltrowanymi komórkami zebranymi w kroku 3.5. Umyj wszystkie komórki raz za pomocą kompletnego DMEM. Kontynuuj określanie numeru komórki i etapów etykietowania magnetycznego. Uwaga: Ważne jest, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową przed etykietowaniem magnetycznym.

4. Etykietowanie magnetyczne

1. Ten protokół pokazuje magnetyczne znakowanie 10⁷ komórek. W przypadku komórek o numerach mniejszych niż 10⁷ należy użyć tej samej objętości odczynnika, a w przypadku liczby komórek większej niż 10⁷ należy odpowiednio zwiększyć wszystkie objętości odczynników i objętości całkowite (np. w przypadku komórek o wymiarach 2 x 10⁷ należy użyć podwójnej objętości wszystkich wskazanych odczynników). Trzymaj wszystkie odczynniki i komórki w lodzie.
2. Określ numer komórki za pomocą hemocytometru.
3. Odwirować zawiesinę komórek przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie odessać supernatant.
4. Dodać 90 μl/10⁷ komórek buforu oczyszczającego do osadu komórkowego, a następnie 10 μl mikrokulek CD31. Mikrogranulki dostarczone przez producenta są sprzężone z monoklonalnym przeciwciałem anty-mysim CD31.
5. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w lodówce. Uwaga: Wyższe temperatury i/lub dłuższy czas inkubacji podczas etykietowania magnetycznego mogą skutkować niespecyficznym wiązaniem.
6. Przemyć komórki, dodając 1-2 ml/10⁷ komórek buforu oczyszczającego i odwirować przy 300 x g przez 10 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu oczyszczającego. Przejdź do etapu separacji magnetycznej lub oczyszczania.

5. Oczyszczanie

1. Umieść kolumnę MS w polu magnetycznym separatora MACS.
2. Przepłukać kolumnę 500 μl buforu oczyszczającego.
3. Nałóż zawieszenie komórek na kolumnę. Załaduj odpowiednią liczbę komórek do kolumny MS, ponieważ większa liczba komórek może zatkać kolumnę. Uwaga: Każda kolumna MS może pomieścić maksymalną liczbę komórek 2 x 10⁷, aby uzyskać większą liczbę komórek, użyj większej liczby kolumn.
4. Zbierz i wyrzuć przepływowe komórki zawierające nieoznakowane komórki.
5. Przepłukać kolumnę trzykrotnie 500 μl buforu oczyszczającego. Podczas etapów mycia należy upewnić się, że zbiornik kolumny jest pusty przed dodaniem kolejnych podwielokrotności bufora oczyszczającego.
6. Wyjmij kolumnę z separatora MACS i umieść ją na probówce Falcon o pojemności 15 ml.
7. Tłok jest dostarczany wraz z kolumną MS. Odpipetować 1 ml buforu oczyszczającego na kolumnę MS i natychmiast wypłukać magnetycznie znakowane komórki, mocno wciskając tłok do kolumny.
8. Płytki na szalce hodowlanej o średnicy 35 mm wstępnie pokrytej kolagenem typu 1 i hodować komórki w ECCM w inkubatorze ustawionym na 37 °C z 95%_O2 i 5% CO_{2 .}
9. Zmieniaj podłoże co cztery dni. Użyj PVEC do eksperymentów lub subkultury po 10-12 dniach, gdy danie jest zlewne.

6. Subkultura PV ECS

1. Wyjąć ECCM i przepłukać monowarstwę PVECS 1-2 ml sterylnego PBS.
2. Delikatnie dodaj 1,5 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA, aby pokryć monowarstwę komórki.
3. Włóż naczynie z powrotem do inkubatora. W ciągu 5-7 minut komórki oderwą się od powierzchni naczynia.
4. Po odłączeniu komórek natychmiast dodaj równą objętość inhibitora trypsyny i kilkakrotnie rozcieraj.
5. Przenieść komórki do sterylnej probówki Falcon o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 5 minut.
6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml podgrzanego ECCM.
7. Zasiej komórki w celu namnażania hodowli, obrazowania lub innych testów.

Wyniki

Charakterystyka fenotypowa PVEC od 1. do 12. dnia przedstawiona jest za pomocą mikroskopii świetlnej w kontraście fazowym (Rysunek 2). Komórki przytwierdzone do naczynia w 1. dniu wykazują morfologię charakterystyczną dla podziału komórkowego (Rysunek 2A). Między 5. a 8. dniem PVEC przechodzą z morfologii brukowanej w wrzecionowatą, typową dla komórek śródbłonka i bardziej zbliżoną do ich stanu in vivo (Rysunki 2B i 2C). Do 12. dnia kultura PVEC...

Dyskusja

PVEC są bardziej istotne fizjologicznie niż dorosłe komórki śródbłonka mózgu i EC z innych źródeł tkankowych dla badań koncentrujących się na interakcjach nerwowo-naczyniowych, a także mają potencjał terapeutyczny. W przypadku przygotowania PVEC bardzo ważne jest, aby rozpocząć od sekcji, aby pracować szybko, aby osiągnąć dobrą żywotność, ponieważ martwe komórki mogą wiązać się niespecyficznie z mikrokulkami CD31. Ponadto, jeśli zawieszenie pojedynczej komórki nie zostanie osiągnięte przed etapem etykietowania magnetyczn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DNase I	Sigma	D-4527
Kolagen, roztwór typu 1 z ogona szczura	Sigma	C3867
DPBS	Jakość Biologiczne	114057-131
EDTA	Fisher Scientific	M4055
BSA	Sigma	A2058
Kolumna MS	Miltenyi Biotech	130-042-201
Mikrogranulki CD31	Miltenyi Biotech	130-097-418
Separator MACS	Miltenyi Biotech	130-042-102
Wielofunkcyjne stanowisko MACS	Miltenyi Biotech	130-042-303
Sitko do komórek 70 i mikro; m	BD Bioscience	352350
Roztwór antybiotykowy i przeciwgrzybiczy	Sigma	A5955
FBS	Sigma	F4135
Kolagenaza/Rozkład	Roche	10269638001
DMEM	Lonza	12-604F
35 mm Naczynie hodowlane	BD Bioscience	353001
15 ml tubka Falcon	BD Bioscience	352097
50 ml probówka Falcon	BD Bioscience	352098
Zestaw ECCM	Zestaw 355054 BD Bioscience		Zawiera suplement na wzrost komórek śródbłonka, EGF i inhibitor trypsyny sojowej
Suplement na wzrost komórek śródbłonka (EKGS)	BD Bioscience	354006
Zastosowania ogniw	RBECGM	R819-500
DMEM F12	Technologie życiowe	10565-018
GlutaMAX	Life Technologies	305050-061
Woda klasy kulturowej	Technologie życia	15230162
0,25% Trypsyna	Technologie Życia	15050
Inhibitor trypsyny sojowej	BD Bioscience	5425
Matrigel	BD Bioscience	354234
Qtracker 655 Zestaw do etykietowania komórek Life Technologies		Q25021
CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0	Life Technologies	C10608
Biotynylowane przeciwciało izolektyny B4	Sigma	L2140
Czynnik anty-von Willebranda	Sigma	F3520
Anty-CD31/PECAM-1	BD Pharmingen	550274
VECTASHIELD Hardset Media montażowe z DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Ketamina	Butler Schein Zaopatrzenie Zdrowia Zwierząt	44028
Ksylazyna	Lloyd Laboratories	1009
Mikroskop stereoskopowy	Motic	SMZ-168
Hemocytometr	Fisher Scientific	267110
Mikroskop odwrócony	Olympus CK-40	CK-40
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus FSX-100	FSX-100
Kleszcze cienkie	Roboz Instrument Chirurgiczny	7 inox
Cienkie nożyczki z mikrokońcówkami	Roboz Instrument chirurgiczny	RS5611