Artykuł metodologiczny

Generowanie mapy przyczepności przy ścinaniu przy użyciu syntetycznych sieci mikronaczyniowych SynVivo

DOI:

10.3791/51025

⸱

25 maja 2014

 ,  , 
1Biomedical Technology, CFD Research Corporation

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komory przepływowe używane w eksperymentach adhezyjnych zazwyczaj składają się z liniowych ścieżek przepływu i wymagają wielu eksperymentów przy różnych prędkościach przepływu, aby wygenerować mapę adhezji ścinania. SynVivo-SMN umożliwia generowanie mapy przyczepności przy ścinaniu przy użyciu pojedynczego eksperymentu z wykorzystaniem objętości mikrolitrów, co skutkuje znaczną oszczędnością czasu i materiałów eksploatacyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy adhezji komórek/cząstek są kluczowe dla zrozumienia interakcji biochemicznych związanych z patofizjologią choroby i mają ważne zastosowania w dążeniu do rozwoju nowych terapii. Testy wykorzystujące warunki statyczne nie są w stanie uchwycić zależności adhezji od ścinania, co ogranicza ich korelację ze środowiskiem in vivo. Równoległe komory przepływowe płytowe, które określają ilościowo przyczepność pod wpływem fizjologicznego przepływu płynu, wymagają wielu eksperymentów w celu wygenerowania mapy przyczepności przy ścinaniu. Ponadto nie reprezentują one skali i morfologii in vivo i wymagają dużych objętości (~ml) odczynników do eksperymentów. W tym badaniu demonstrujemy generowanie mapy adhezji przy ścinaniu na podstawie pojedynczego eksperymentu przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego opartego na sieci mikronaczyniowej, SynVivo-SMN. To urządzenie odtwarza złożone naczynia krwionośne in vivo, w tym skalę geometryczną, elementy morfologiczne, cechy przepływu i interakcje komórkowe w formacie in vitro, zapewniając w ten sposób biologicznie realistyczne środowisko dla podstawowych i stosowanych badań nad zachowaniem komórek, dostarczaniem leków i odkrywaniem leków. Test został zademonstrowany poprzez badanie interakcji cząstek pokrytych biotyną o wielkości 2 μm z powierzchniami mikroczipa pokrytymi awidyną. Cały zakres ścinania obserwowanego w mikrokrążeniu uzyskuje się w jednym teście umożliwiającym mapę adhezji i ścinania cząstek w warunkach fizjologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne testy do badania interakcji komórka-komórka i cząstka-komórka zazwyczaj obejmują statyczny format płytki, w której cząstki lub komórki są inkubowane na matrycach białkowych lub przylegających komórkach. Pod koniec określonego czasu inkubacji liczbę przylegających cząstek lub komórek określa się ilościowo za pomocą mikroskopii1. Mimo że testy te dostarczają istotnych informacji na temat procesów biochemicznych stojących za tymi interakcjami, kluczowym ograniczeniem jest brak fizjologicznego przepływu płynu (typowy dla mikrokrążenia) i jego wpływ na adhezję cząstek.

Aby przezwyciężyć to ograniczenie, w ostatnich latach opracowano komory przepływowe in vitro. Wspólnym elementem tych komór przepływowych jest przezroczysty aparat perfundowany przy niskich liczbach Reynoldsa, aby dopasować się do szybkości ścinania ścian obserwowanych w naczyniach krwionośnych in vivo2. Ściana naczynia jest modelowana przez powlekanie biomolekuł lub wzrost komórek na jednej powierzchni komory przepływowej3. Cząstki4-7 lub komórki8-16 są następnie wprowadzane w pożądanym zakresie natężeń przepływu w celu ilościowego określenia liczby przylegających cząstek przy różnych szybkościach ścinania.

Jednak użycie równoległych komór przepływowych do badania i walidacji zjawisk biochemicznych jest dość kosztowne i czasochłonne. Wynika to głównie z faktu, że należy przeprowadzić wiele eksperymentów w celu wygenerowania mapy ścinania płynu w stosunku do liczby przylegających cząstek/komórek. Ponadto komory przepływowe płytkowe wymagają dużych ilości odczynników ze względu na ich duży rozmiar (wysokość > 250 μm i szerokość > 1 mm). Wreszcie, urządzenia te nie modelują dokładnie cech geometrycznych (np. bifurkacji) i warunków przepływu (np. przepływów zbieżnych i rozbieżnych), które występują in vivo.

Ostatnie postępy w mikroprodukcji opartej na litografii17-19 przyspieszyły rozwój urządzeń typu lab-on-a-chip20-21. Urządzenia te odegrały zasadniczą rolę w opracowaniu zminiaturyzowanej wersji równoległej komory przepływowej z płytką o wymiarach w reżimie mikrometrycznym. Zmniejszenie wymiarów przynosi również znaczące korzyści pod względem ilości odczynników, komórek lub cząstek wymaganych do eksperymentów. Jednak kluczowym ograniczeniem obecnie dostępnych urządzeń jest wykorzystanie kanałów liniowych do modelowania mikronaczyń, co nie naśladuje złożonego mikrokrążenia obserwowanego in vivo.

Niedawno opracowaliśmy nowatorską metodologię odtwarzania sieci mikronaczyniowych na jednorazowych podłożach z tworzywa sztucznego, co daje syntetyczne odwzorowanie warunków in vivo. Urządzenia te, zwane SynVivo-Syntetycznymi Sieciami Mikronaczyniowymi (SMN), są opracowywane przy użyciu procesu miękkiej litografii opartego na PDMS. Urządzenia SynVivo-SMN mogą być używane do uzyskiwania mapy adhezji przy ścinaniu adhezji komórek/cząstek22, badania ukierunkowanego dostarczania leków23 i zostały zweryfikowane na podstawie danych in vivo 24-25. W artykule przedstawiono protokół, który umożliwia wygenerowanie mapy przyczepności przy ścinaniu na podstawie pojedynczego eksperymentu w objętościach tak małych jak 1-5 μl, co skutkuje znaczną oszczędnością zasobów i czasu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego SynVivo-SMN

  1. Każdy port (wlot/wylot) urządzenia składa się z dwóch równoległych portów – jeden służy do wprowadzania składników powłoki powierzchniowej (cząsteczek adhezyjnych, macierzy wzrostowych itp.) i/lub komórek do wysiewu, a drugi do przeprowadzania analizy (Rycina 1A).
  2. Całkowicie zanurz mikroprzepływowe urządzenie SynVivo-SMN (Rycina 1B) w czsubplotku zawierającym sterylną wodę dejonizowaną (DI) i umieść go w eksykatorze próżniowym. Pozostaw eksykator włączony do czasu usunięcia całego powietrza z kanałów urządzenia. Powinno to zająć około 15 min.
  3. Przed wyjęciem urządzenia z wody, za pomocą pęsety z cienkimi końcami, wprowadź do każdego portu urządzenia przygotowane wcześniej (przepłukane wodą) rurki Tygon (średnica zewnętrzna 0,06" i wewnętrzna 0,02"). Rurki powinny mieć długość około 1 cala. Teraz urządzenie można wyjąć z wody. Rycyna 1C przedstawia obraz urządzenia z zamontowanymi rurkami.

2. Powlekanie urządzenia mikroprzepływowego wybranym białkiem (np. awidyną)

  1. Za pomocą pipety nanieś kroplę wody (około 100 µl) wokół podstawy rurki jednego z portów wlotowych. Ostrożnie usuń rurkę służącą do przygotowania urządzenia. Kropla wody zapobiegnie przedostaniu się powietrza do wnętrza urządzenia.
  2. Przygotuj strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną awidyną o stężeniu 20 µg/ml. Połącz strzykawkę z igłą ze stali nierdzewnej 24 G  oraz rurką. Wprowadź rurkę do jednego z portów wlotowych urządzenia. Nieużywany port wlotowy zaciśnij zaciskiem szczękowym.
  3. Wstrzyknij awidynę z prędkością przepływu 1 µl/min przez 10 min, aby umożliwić całkowitą perfuzję urządzenia. Po upływie czasu przepływu zaciśnij rurkę zaciskiem szczękowym i pozostaw urządzenie w temperaturze 4 °C przez noc.

3. Przepływ biotynylowanych cząsteczek w eksperymentach adhezyjnych

  1. Pozostawić urządzenie do czasu osiągnięcia przez nie temperatury pokojowej. Umieścić urządzenie na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w zmotoryzowany stół oraz kamerę o wysokiej rozdzielczości.
  2. Przygotuj roztwór 2 µcząsteczki biotynilowane w stężeniu 5 x 106 cząsteczek/ml w buforze fosforanowym (PBS). Przenieść cząsteczki do strzykawki o pojemności 1 ml. Przygotować drugą strzykawkę o pojemności 1 ml zawierającą wyłącznie PBS. Umieścić każdą strzykawkę w pompie strzykawkowej, a następnie podłączyć igłę i prowadnice.
  3. Za pomocą pipety nanieś kroplę wody (około 100 µl) wokół podstawy rurki wlotowej. Ostrożnie usuń rurkę służącą do powlekania urządzenia. Kropla wody zapobiegnie przedostaniu się powietrza do wnętrza urządzenia.
  4. Ostrożnie włóż rurki dla cząsteczek biotynilowanych oraz buforu PBS z kroku 3.2 do poszczególnych portów wlotowych. Rycina 2A pokazuje obraz układu doświadczalnego.
  5. Rozpocząć wtryskiwanie biotynilowanych cząsteczek z szybkością przepływu 2,5 µl/min. Monitorować wlot mikroskopu. Przy pierwszej pojawiącej się cząsteczce uruchomić stoper i kontynuować przepływ przez 3 min.
  6. Po upływie 3 min zatrzymaj przepływ biotynylowanych cząstek, jednocześnie rozpoczynając przepływ PBS z prędkością 2,5. µl/min. Pozostawić PBS w urządzeniu przez 3 min w celu wypłukania nie związanych cząsteczek.

4. Pozyskiwanie obrazów i wykonywanie pomiarów obszaru zainteresowania (AOI) przy użyciu oprogramowania do obrazowania (NIKON Elements)

  1. Użyj funkcji „scan large image” w oprogramowaniu do obrazowania, aby pozyskać obraz całego urządzenia.
  2. Ponumeruj kolejno rozgałęzienia w urządzeniu i utwórz okrągły obszar zainteresowania (AOI) o średnicy dwukrotnie większej od średnicy kanałów. W tym przypadku ustaw średnicę AOI na 200 µm, ponieważ średnica kanału wynosi 100 µm.
  3. Użyj funkcji automatycznego zliczania w oprogramowaniu do obrazowania, aby wyeksportować liczbę cząstek w każdym AOI do arkusza MS Excel.
  4. Podobnie, skorzystaj z funkcji automatycznego zliczania, aby wyeksportować liczbę cząstek w całym urządzeniu.

5. Analiza strumienia cząstek z wykorzystaniem modeli obliczeniowej dynamiki płynów (CFD)

  1. Symulacje CFD są przeprowadzane przy użyciu dostępnego komercyjnie oprogramowania (CFD-ACE+, ESI Inc.) dla topologii urządzenia SynVivo-SMN. Wyniki są przechowywane w bazie danych w celu analizy obserwacji eksperymentalnych. Wyniki symulacji zawierają informacje o szybkościach ścinania przy ściankach, prędkości, strumieniu cząstek oraz adhezji w urządzeniu.
  2. Wyniki symulacji są wykorzystywane do określenia liczby cząstek wnikających do każdego AOI na podstawie zadanej stężenia cząstek na wlocie.

6. Generowanie mapy adhezji ścinającej

  1. Oblicz % adhezji, dzieląc liczbę cząstek przyległych w rozwidleniu przez liczbę cząstek przepływających w rozwidleniu, zgodnie z równaniem 6.1.
    figure-protocol-1
    gdzie liczba cząstek przyległych oraz liczba cząstek przepływających są odpowiednio uzyskane z kroków protokołu 4.3 i 5.2.
  2. Wykreśl mapę adhezji ścinającej, wykorzystując prędkość ścinania w każdym rozwidleniu sieci uzyskane z bazy danych w kroku (5.1) oraz wartości % adhezji obliczone na podstawie równania 6.1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rycina 1A przedstawia schemat oraz obraz w jasnym polu urządzenia SynVivo-SMN. Rycina 1B przedstawia urządzenie SynVivo-SMN zamocowane na szkiełku przedmiotowym. Rycina 1C przedstawia urządzenie z rurkami po przeprowadzeniu procesu płukania wodą w deskrykatorze próżniowym.

Rycina 2A przedstawia schemat układu doświadczalnego. Rycina 2B przedstawia typowe urządzenie SynVivo-SMN powlekane awidyną po związaniu bi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Równoległe komory przepływowe płytkowe, choć zapewniają istotny wgląd w interakcje komórka-komórka i komórka-cząstka, mają kilka ograniczeń, takich jak wysokie zużycie odczynników i konieczność przeprowadzenia wielu serii eksperymentalnych w celu wygenerowania mapy przyczepności przy ścinaniu. Zastosowanie SynVivo-Syntetycznych Sieci Mikronaczyniowych (SynVivo-SMNs) umożliwia wygenerowanie mapy adhezji przy ścinaniu na podstawie pojedynczego eksperymentu w warunkach naśladujących warunki in vivo . Ponadto uzysku...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opłata za publikację tego artykułu sponsorowana przez CFD Research Corporation.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia SynVivo została opracowana w ramach grantu #2R44HL076034 z NHLBI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SynVivo-SMNCFD ResearchSMN-001wyłącznie w CFDRC
CFD-ACE+ESI Inc.Nie dotyczy
AvidinInvitrogen43-4401Każde źródło awidyny będzie działać w tym teście
Biotynylowane cząstkiPolysciences24173-1Każde źródło biotynylowanych cząstek będzie działać w teście
Tygon RurkaVWR63018-044Rozmiar jest typowy do użytku z SynVivo-SMN
Elementy NIKONInstrumenty NIKONNie dotyczyWszelkie inne obrazowanie można korzystać z oprogramowania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weitz-Schmidt, G., Chreng, S. Cell adhesion assays. Methods Mol Biol. 757, 15-30 (2012).
  2. Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte recruitment under flow conditions. Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).
  3. Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment. Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).
  4. Adriani, G., et al. The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles. Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).
  5. Decuzzi, P., et al. Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles. Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).
  6. Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).
  7. Sakhalkar, H. S., et al. Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).
  8. Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
  9. Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J Vis Exp. 66 (66), (2012).
  10. Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7, (2012).
  11. Ploppa, A., Schmidt, V., Hientz, A., Reutershan, J., Haeberle, H. A., Nohé, B. Mechanisms of leukocyte distribution during sepsis: an experimental study on the interdependence of cell activation, shear stress and endothelial injury. Crit Care. 14, 201(2010).
  12. Oh, H., Diamond, S. L. Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium. J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).
  13. Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).
  14. Enders, S., Bernhard, G., Zakrzewicz, A., Tauber, R. Inhibition of L-selectin binding by polyacrylamide-based conjugates under defined flow conditions. Biochim Biophys Acta. 1770, 1441-1449 (2007).
  15. Prabhakarpandian, B., Goetz, D. J., Swerlick, R. A., Chen, X., Kiani, M. F. Expression and functional significance of adhesion molecules on cultured endothelial cells in response to ionizing radiation. Microcirculation. 8, 355-364 (2001).
  16. Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunology. 2, 9(2001).
  17. Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Precise control of cell adhesion by combination of surface chemistry and soft lithography. Adv Healthc Mater. 2, 95-108 (2013).
  18. Qian, T., Wang, Y. Micro/nano-fabrication technologies for cell biology. Med Biol Eng Comput. 48, 1023-1032 (2010).
  19. Biswas, A., Bayer, I. S., Biris, A. S., Wang, T., Dervishi, E., Faupel, F. Advances in top-down and bottom-up surface nanofabrication: techniques, applications & future prospects. Adv Colloid Interface Sci. 170, 2-27 (2012).
  20. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  21. McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21, 27-40 (2000).
  22. Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomed Microdevices. 10, 585-595 (2008).
  23. Rosano, J. M., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomed Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
  24. Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).
  25. Prabhakarpandian, B., et al. Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

SynVivo SMNurz dzenie mikrofluidyczneadhezja cz stekanaliza szybko ci cinaniasymulacje CFDmikroskopia fluorescencyjnacz stki biotynylizowanepow oka z awidyny

Powiązane artykuły