Opisujemy tutaj prostą metodę fluorescencji in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii w tkankach owadów i roślin. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację mRNA w całych ujęciach i przekrojach mikroskopowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Fluorescencyjne hybrydyzacje in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii endosymbiotycznych w tkankach roślinnych i owadzich
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) to nazwa nadana różnym technikom powszechnie używanym do wizualizacji transkryptów genów w komórkach eukariotycznych i może być dalej modyfikowana w celu wizualizacji innych składników komórki, takich jak infekcja wirusami i bakteriami. Lokalizacja przestrzenna i wizualizacja wirusów i bakterii podczas procesu infekcji jest niezbędnym krokiem, który uzupełnia eksperymenty z profilowaniem ekspresji, takie jak mikromacierze i RNAseq w odpowiedzi na różne bodźce. Zrozumienie zakażeń czasoprzestrzennych tymi czynnikami uzupełnia eksperymenty biologiczne mające na celu zrozumienie ich interakcji ze składnikami komórkowymi. Kilka technik wizualizacji wirusów i bakterii, takich jak systemy genów reporterowych lub metody immunohistochemiczne, jest czasochłonnych, a niektóre ograniczają się do pracy z organizmami modelowymi i obejmują złożone metodologie. FISH, który celuje w gatunki RNA lub DNA w komórce, jest stosunkowo łatwą i szybką metodą badania czasoprzestrzennej lokalizacji genów oraz do celów diagnostycznych. Ta metoda może być solidna i stosunkowo łatwa do wdrożenia, gdy protokoły wykorzystują krótkie, hybrydyzujące, komercyjnie zakupione sondy, które nie są drogie. Jest to szczególnie przydatne, gdy przygotowanie, utrwalanie, hybrydyzacja i wizualizacja mikroskopowa próbki nie obejmują skomplikowanych etapów. W tym miejscu opisujemy protokół lokalizacji bakterii i wirusów w tkankach owadów i roślin. Metoda opiera się na prostym przygotowaniu, utrwaleniu i hybrydyzacji całych wierzchowców owadów i wypreparowanych organów lub ręcznie wykonanych skrawków roślin, z 20 parami zasad krótkich sond DNA sprzężonych z barwnikami fluorescencyjnymi na ich końcach 5' lub 3'. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do wielu tkanek owadów i roślin i może być stosowany do analizy ekspresji mRNA lub innych gatunków RNA lub DNA w komórce.
Wprowadzenie
Podczas badania interakcji między wirusami roślinnymi i innymi patogenami a ich zainfekowanymi gospodarzami roślinnymi, ważne jest, aby wizualizować patogeny i ich odpowiednie kwasy nukleinowe in situ, niezależnie od tego, czy powodują one negatywny wpływ na swoich gospodarzy. Jest to szczególnie ważne podczas badania przemieszczania się patogenów w obrębie komórek roślinnych i między nimi. Lokalizacja in situ produktów genowych patogenu jest niezbędnym krokiem, który uzupełnia inne podejścia do badania procesu patogenności. Wiele patogenów roślin, zwłaszcza wirusów, jest przenoszonych przez owady, wchodząc w złożone i bliskie interakcje ze swoimi wektorami. Lokalizacja tych wirusów w ich wektorach jest ważna dla badania drogi transmisji i możliwych miejsc interakcji wewnątrz wektora. Przenoszenie niektórych wirusów roślinnych przenoszonych przez owady jest wspomagane przez bakterie endosymbiotyczne, które znajdują się w tych owadach. Aby lepiej zbadać przenoszenie tych wirusów roślinnych przez ich wektory, niezbędna jest również wizualizacja bakterii endosymbiotycznych w ogóle, a w szczególności tych zaangażowanych w przenoszenie wirusa. Kolokalizacja wirusa i bakterii endosymbiotycznych jest zatem pożądana w celu zbadania możliwych relacji między tymi organizmami w obrębie ich owadziego gospodarza. Oprócz przenoszenia wirusów, bakterie endosymbiotyczne wpływają na kilka aspektów biologii wektorów owadów, dlatego lokalizacja przestrzenna tych bakterii w owadach jest bardzo interesująca i ważna.
Wirus żółtej kędzierzawości liści pomidora (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) jest najważniejszym kompleksem chorób wirusowych uprawianych pomidorów na świecie1-4. TYLCV jest wirusem ograniczonym do łyka i jest przenoszony wyłącznie przez mączlika Bemisia tabaci 5,6. Zaproponowano model opisujący translokację begomowirusów w ich wektorach mączlików6-9. Podczas tej transmisji krążeniowej aktywnie przekraczane są dwie specyficzne bariery: bariera jelita środkowego/hemolimfy i hemolimfy/gruczołów ślinowych. Przypuszcza się, że w tym procesie transmisji pośredniczą nieznane receptory, które rozpoznają kapsyd wirusa. Uważa się, że TYLCV przenika przez B. tabaci w jelicie środkowym6,10 i jest wchłaniany przez pierwotny gruczoł ślinowy6 przed wstrzyknięciem do rośliny. W hemolimfie mączlika TYLCV oddziałuje z białkiem GroEL wytwarzanym przez wtórną endosymbiotyczną bakterię owada Hamiltonella. Interakcja ta zapewnia bezpieczny transport TYLCV w hemolimfie i chroni go przed atakiem układu odpornościowego owadów11. Hamiltonella i Portiera, główny endosymbiont mączlików, są przechowywane w bakteriocytach, komórkach owadów znajdujących się w hemolimfie i domach bakterii endosymbiotycznych11. B. tabaci zawiera dodatkowe bakterie endosymbiotyczne, w tym Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia i Fritschea, które mogą być zlokalizowane wewnątrz lub na zewnątrz bakteriocytów i mają różnorodny wpływ na biologię owada12.
Kilka raportów próbowało badać lokalizację TYLCV u roślin i mączlików za pomocą czasochłonnych i kosztownych protokołów, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), przeciwciała i RNA in situ na mikroskopijnym przekroju10,13, niedawne badanie opisało lokalizację wirusów roślinnych wewnątrz ich roślin i wektorów gospodarzy za pomocą prostego protokołu14. Tutaj opisujemy prosty protokół lokalizacji TYLCV w wypreparowanych jelitach środkowych i gruczołach ślinowych B. tabaci oraz w skrawkach przygotowanych z roślin zakażonych TYLCV. Dalej opisujemy lokalizację Portiera, pierwotnego endosymbionta B. tabaci, oraz jego drugorzędowych endosymbiontów Hamitonella, Rickettsia i Arsenophonus. Protokół ten opiera się na użyciu krótkich sond DNA, które są znakowane fluorescencyjnie na końcu 5' i specyficznie hybrydyzują z sekwencjami komplementarnymi w sekwencjach genów wirusowych lub bakteryjnych. Przetwarzanie próbki jest stosunkowo łatwe, a uzyskany sygnał jest bardzo specyficzny. Opisany protokół może być stosowany do lokalizacji wirusów, bakterii i innych patogenów w ich roślinach, zwierzętach i owadach gospodarzach, a następnie może być używany do lokalizacji mRNA w dowolnej tkance.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Ogólne preparaty mączlików, roślin i wirusów do analizy FISH
- Tylne mączliki biotypu B i Q na siewkach bawełny (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) i utrzymują się w klatkach i pomieszczeniach hodowlanych odpornych na owady w standardowych warunkach 25±2 °C, wilgotności względnej 60% i 14-godzinnego światła / 10-godzinnego ciemnego fotoperiodu.
- Wykonaj PCR, aby przetestować zakażenie endosymbiontami przy użyciu starterów specyficznych dla endosymbiontów, jak opisano wcześniej15-19.
- Kup sadzonki pomidorów (Solanum esculentum cv. Beefsteak) z komercyjnej szkółki lub posadź nasiona pomidorów.
- Utrzymywać w tych samych warunkach chowu, które opisano powyżej, aż rośliny osiągną fazę czterech prawdziwych liści, czyli wiek najbardziej odpowiedni do inokulacji TYLCV15 za pośrednictwem mączlików (patrz sekcja 4.1 poniżej).
2. Obchodzenie się z owadami, fiksacja, projektowanie sond, hybrydyzacja i wizualizacja dla endosymbiont FISH
- Zbierz 10 dorosłych mączlików przez aspirację z roślin bawełny lub zbierz 10 nimf 3 lub 4 z liści bawełny.
- Natychmiast zanurzyć w utrwalaczu Carnoya (chloroform-etanol-lodowaty kwas octowy, 6:3:1, obj./obj.) wewnątrz probówek Eppendorfa. Fix na 2 godziny do nocy (najlepiej na noc).
- Całkowicie usuń utrwalacz i odbarwij w 6% H2O2 w etanolu przez 2 godziny.
- Próbki należy przechowywać w absolutnym etanolu przez kilka dni do kilku tygodni w temperaturze pokojowej lub przejść do następnego etapu.
- Zaprojektuj sondy jako komplementarne startery odwrotnego DNA oparte na 16-sowych genach rybosomalnego RNA każdej bakterii. Przy projektowaniu sond należy wziąć pod uwagę te same względy, co przy projektowaniu starterów PCR. Użyj sond oligonukleotydowych BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3', Rb1 5'-Cy3-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', BTH 5'-Cy3-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3' i Ars2 5'-cy3-TCATGACCACACACCAAA-3' do specyficznego celowania odpowiednio w Portiera, Rickettsia, Hamilonella i Arsenophonus.
- Hybrydyzować próbki przez noc w ciemności w buforze hybrydyzacyjnym (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,9 M NaCl, 0,01% [wag./obj.] dodecylosiarczan sodu, 30% [obj./obj.] formamid) zawierającym 10 pmol sondy fluorescencyjnej na ml. W razie potrzeby połączyć więcej niż jedną sondę z różnymi barwnikami fluorescencyjnymi. Używaj niezakażonych mączlików z docelową bakterią i próbkami bez sondy jako kontroli negatywnej.
- Umieścić próbki w całości, na szkiełku mikroskopowym, w buforze hybrydyzacyjnym zawartym w blokerze cieczy, przykryć szkiełkiem nakrywkowym, uszczelnić lakierem do paznokci i obejrzeć pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym.
3. Sekcja narządów mączlika, fiksacja, hybrydyzacja i wizualizacja dla TYLCV FISH
- Dorosłe mączliki należy zbierać w sposób ciągły hodowany na roślinach pomidora zakażonych TYLCV przez aspirację i znieczulenie przez ekspozycję na ręcznik papierowy nasączony acetonem. Mączliki należy wystawiać tylko na 1-2 minuty, ponieważ zbyt długa ekspozycja na aceton może utrwalić tkanki mączlików. Używaj niewirusowych mączlików hodowanych na niezakażonych roślinach pomidora i nie pobieraj próbek sondowych do kontroli, aby potwierdzić specyficzną hybrydyzację.
- Zamontuj mączliki na szkiełkach mikroskopu depresyjnego w celu wypreparowania narządów za pomocą mikroskopu stereoskopowego.
- Oderwij głowę owada od przedtułowia i wypreparuj gruczoły ślinowe w 1x PBS uzupełnionym 1% niebieskim barwnikiem toluidynowym dla lepszej wizualizacji, ze względu na ich mały rozmiar. Pozostaw plamę do wchłonięcia przez 2-3 minuty.
- Rozsuń owada na styku między klatką piersiową a brzuchem, aby obserwować i wydalić jelito środkowe. Wydal zawartość brzucha, naciskając kleszczami na czubek brzucha.
- Delikatnie usuń PBS i błękit toluidynowy z udanych sekcji i delikatnie dodaj 300 μl utrwalacza Carnoya, aby utrwalić narządy przez 5 minut.
- Dodaj utrwalacz z jednej strony wgłębionej studzienki, a nie od góry, aby zapobiec niekontrolowanemu ruchowi wypreparowanych narządów. Po dotknięciu utrwalacza narządy przylgną do szkła i przez cały czas trwania procesu nie będą się poruszać.
- Usunąć utrwalacz i dodać 500 μl buforu hybrydyzacyjnego uzupełnionego 10 pmol fluorescencyjnej sondy DNA Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3', która jest komplementarna do sekwencji w genie białka płaszcza TYLCV.
- Hybrydyzuj przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności, inkubując szkiełko z próbką w małej wilgotnej komorze składającej się z małego plastikowego pudełka z mokrym ręcznikiem na dole.
- Po hybrydyzacji należy pobrać narządy za pomocą drobnego narzędzia do preparowania i szybko przenieść je na świeże szkiełko mikroskopowe zawierające 30 μl nowego buforu hybrydyzacyjnego uzupełnionego DAPI (0,1 mg / ml w 1x PBS) i zawierającego bloker cieczy.
- Przykryj próbki szkiełkiem nakrywkowym, uszczelnij lakierem do paznokci i obejrzyj pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym .
4. Obchodzenie się z roślinami, ręczne cięcie, utrwalanie i hybrydyzacja dla TYLCV FISH
- Zaszczepić sadzonki pomidorów TYLCV za pomocą wirusowego inokulacji za pośrednictwem mączlika. Wirus można wykryć za pomocą tej metody FISH u roślin bezobjawowych tydzień po inokulacji. Typowe objawy chorobowe widoczne są po trzech tygodniach od szczepienia. Używaj niezakażonych pomidorów i nie pobieraj próbek sondowych do kontroli, aby potwierdzić specyficzną hybrydyzację.
- Użyj ostrej histologicznej żyletki do przygotowania ręcznie przyciętych podłużnych lub poprzecznych odcinków łodyg i liści pomidora o długości 2-4 cm.
- W probówkach Eppendorfa utrwalić skrawki utrwalacza Carnoya na 2 godziny do nocy w temperaturze pokojowej.
- Usuń utrwalacz i zachowaj skrawki w absolutnym etanolu przez kilka dni do kilku tygodni w temperaturze pokojowej lub przejdź do następnego kroku.
- Umyj sekcje trzy razy po 1 minutę każda, w buforze hybrydyzacyjnym.
- Zhybrydyzować skrawki za pomocą 500 μl buforu hybrydyzacyjnego uzupełnionego 10 pmol fluorescencyjnej sondy oligonukleotydowej Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3', która jest komplementarna do sekwencji w genie białka płaszcza TYLCV.
- Umyj sekcje trzy razy po 1 minutę każda, w buforze hybrydyzacyjnym.
- Zamontuj skrawki w całości w buforze hybrydyzacyjnym uzupełnionym DAPI (0,1 mg / ml w 1x PBS) i zawartym w blokerze cieczy, przykryj szkiełkiem nakrywkowym, uszczelnij lakierem do paznokci i obejrzyj pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
System opisany w niniejszym manuskrypcie przedstawiono na Rycina 1 i obejmuje roślinę zainfekowaną wirusem TYLCV oraz osobnika dorosłego i nimfę mączlika B. tabaci, oraz wewnętrzna anatomia mączlika, przedstawiająca drogę translokacji TYLCV wewnątrz owada. Rycina 2 pokazuje podwójną fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) pierwotnego symbionta u dorosłego mącznika Portiera oraz wtórny symbiont Arsenophonus. Rysunek 3 pokazuje podwójną hybry...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół lokalizacji wirusa roślinnego w jego żywicielu roślinnym i wektorze owada oraz bakterii endosymbiotycznych w ich specyficznym żywicielu mączlika, może być dostosowany do lokalizacji innych wirusów w roślinach, a nawet w tkankach zwierzęcych. Ponadto protokół może być stosowany do lokalizacji endosymbiotycznych i chorobotwórczych bakterii oraz innych mikroorganizmów w systemach roślinnych i zwierzęcych. Opisane metody opierają się na prostej koncepcji hybrydyzacji między krótką, znakowaną fluorescen...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badania w laboratorium w Ghanim były wspierane przez grant badawczy nr 908-42.12/2006 od Fundacji Niemiecko-Izraelskiej (GIF), grant nr. IS-4062-07 z Dwunarodowego Funduszu Badań i Rozwoju Rolnictwa Stanów Zjednoczonych i Izraela (BARD) oraz grant badawczy nr 884/07 z Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF) dla M.G.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Znakowane fluorescencyjnie Sondy | Metabion | 20 bp HPLC oczyszczona sekwencja | zaprojektowana przez klienta |
| Niebieski toluidyna | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Dodecylosiarczan sodu | Sigma-Aldrich | L3771 | Klasa biologii molekularnej |
| Formamid | Sigma-Aldrich | F9037 | Klasa biologii molekularnej |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Klasa biologii molekularnej |
| Lodowaty kwas octowy | Sigma-Aldrich | 320099 | Płynny bloker klasy biologii molekularnej |
| Ted Pella Inc. | Numer katalogowy 22309 |
Bibliografia
- Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
- Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
- Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
- Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
- Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
- Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
- Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
- Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
- Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
- Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
- Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
- Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
- Ghanim, M., Medina, V. Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. Czosnek, H. , Springer. New York. 175-187 (2007).
- Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
- Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
- Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
- Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
- Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
