Profilaktyczne i terapeutyczne szczepienia często nie stymulują silnej odpowiedzi immunologicznej z powodu tygodniowego drenażu szczepionki do węzłów chłonnych, a w konsekwencji słabego zaangażowania komórek odpornościowych. Poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych, tzw. wstrzyknięcie dolimfatyczne, można znacznie poprawić skuteczność szczepionki i zmniejszyć dawki szczepionki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Immunoterapia dolimfatyczna i szczepienie u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szczepionki są zazwyczaj wstrzykiwane podskórnie lub domięśniowo w celu stymulacji odpowiedzi immunologicznej. Powodzenie tego procesu wymaga skutecznego drenażu szczepionki do węzłów chłonnych, w których komórki prezentujące antygen mogą wchodzić w interakcje z limfocytami w celu wytworzenia pożądanej odpowiedzi immunologicznej. Siła i rodzaj indukowanych odpowiedzi immunologicznych zależą również od gęstości lub częstotliwości oddziaływań, a także od mikrośrodowiska, a zwłaszcza zawartości cytokin. Ponieważ tylko niewielka część szczepionek wstrzykiwanych obwodowo dociera do węzłów chłonnych, szczepienia myszy i ludzi wykonywano poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do pachwinowych węzłów chłonnych, tj. wstrzyknięcie dolimfatyczne. U człowieka procedura jest prowadzona przez ultradźwięki. U myszy wykonuje się małe (5-10 mm) nacięcie w okolicy pachwinowej znieczulonych zwierząt, węzeł chłonny jest lokalizowany i unieruchamiany kleszczami, a objętość 10-20 μl szczepionki wstrzykuje się pod kontrolą wzrokową. Nacięcie zamyka się pojedynczym szwem za pomocą szwów chirurgicznych. Myszy zaszczepiono plazmidowym DNA, RNA, peptydem, białkiem, cząstkami i bakteriami, a także adiuwantami i zaobserwowano silną poprawę odpowiedzi immunologicznej przeciwko wszystkim typom szczepionek. Metoda szczepienia dolimfatycznego jest szczególnie odpowiednia w sytuacjach, gdy konwencjonalne szczepienie powoduje niewystarczającą odporność lub gdy ilość dostępnej szczepionki jest ograniczona.
Wprowadzenie
Szczepionki są zazwyczaj wstrzykiwane podskórnie lub domięśniowo w celu stymulacji odpowiedzi immunologicznej. Powodzenie tej procedury wymaga skutecznego drenażu szczepionki do węzłów chłonnych, gdzie komórki prezentujące antygen mogą wchodzić w interakcje z limfocytami w celu wytworzenia odpowiedzi limfocytów T i B. Ponadto siła i rodzaj wywołanych odpowiedzi immunologicznych zależą również od gęstości lub częstotliwości takich interakcji, a także od samego mikrośrodowiska, a zwłaszcza od zawartości cytokin. Ponieważ tylko niewielka część szczepionki wstrzyknięta do tkanki obwodowej dociera do węzła chłonnego, przeprowadzono szczepienia myszy i ludzi poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych, w miejscu, w którym generowana jest odpowiedź immunologiczna. U człowieka procedura jest prowadzona przez ultradźwięki, procedurę stosowaną również do podawania środków obrazowych do wizualizacji i diagnostyki w układzie limfatycznym. U myszy zabieg jest inwazyjny. Tutaj wykonuje się małe (5-10 mm) nacięcie w okolicy pachwinowej znieczulonych zwierząt1, węzeł chłonny jest lokalizowany i unieruchamiany kleszczami, a objętość 10-20 μl szczepionki wstrzykuje się pod kontrolą wzrokową; 10 μl stosuje się do pierwszych wstrzyknięć i u młodych myszy z małymi węzłami chłonnymi, podczas gdy 20 μl można wstrzyknąć do węzłów chłonnych starszych lub już przygotowanych myszy, które mają większe węzły chłonne. Nacięcie można zamknąć pojedynczym szwem za pomocą szwów chirurgicznych. Dzięki tej metodzie myszy zaszczepiono plazmidowym DNA2,3, informacyjnym RNA4, peptydem1,3,5,6, białkiem7-10, cząstkami11, bakteriami12 oraz adiuwantami7,13 i zaobserwowano silną poprawę odpowiedzi immunologicznej przeciwko wszystkim typom szczepionek. Metoda szczepienia dolimfatycznego jest szczególnie odpowiednia w sytuacjach, gdy konwencjonalne szczepienie powoduje niewystarczającą odporność lub gdy ilość dostępnej szczepionki jest ograniczona lub bardzo kosztowna. U ludzi dolimfatyczną metodę immunizacji zastosowano u pacjentów z alergią14,15 lub u pacjentów z rakiem16-21. Chociaż obecnie uważa się, że metoda dolimfatyczna jest bardziej inwazyjna niż inne metody iniekcyjne, takie jak wstrzyknięcia domięśniowe i podskórne, odczuwanie bólu nie jest wyższe niż po punkcji żylnej15. Oczekuje się, że szczepienie dolimfatyczne stanie się alternatywą lub uzupełnieniem innych metod szczepień profilaktycznych, a zwłaszcza terapeutycznych. W tym artykule szczegółowo opisano, w jaki sposób przeprowadza się procedurę szczepienia dolimfatycznego u myszy. Wszystkie opisane procedury zostały zatwierdzone przez Kantonalną Agencję Weterynaryjną w Zurychu i wykonane zgodnie ze szwajcarskimi wytycznymi federalnymi i dyrektywami dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Znieczulenie myszy
- Przygotuj środki znieczulające, mieszając ketaminę (znieczulenie dysocjacyjne) i ksylazynę (uspokajające i przeciwbólowe) w buforowanej soli fizjologicznej. Stężenia ketaminy i ksylazyny w roztworze końcowym wynoszą odpowiednio 12,5 i 2 mg/ml.
- Wstrzyknąć środki znieczulające myszom po podaniu dootrzewnowym za pomocą strzykawki z igłą 25-30 G. Stosować 0,1 ml/10 g masy ciała.
- Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
- Upewnij się, że mysz jest wystarczająco znieczulona, ściskając jej stopę lub palec u nogi kleszczami. Jeśli mysz nie reaguje odruchowo na szczypanie, przystąp do operacji. Jeśli mysz zareaguje na szczypanie odruchami lub skurczami mięśni, odczekaj 1-2 minuty i powtórz test szczypania. Jeśli mysz nadal reaguje, zastąp ją nowym zwierzęciem i powtórz procedury od kroku 1.2.
2. Chirurgiczne nacięcie okolicy pachwinowej myszy
- Umieść mysz na plecach.
- Zwilż jedną okolicę pachwinową dezynfekującym etanolem (70%). Aby zapewnić lepszą dezynfekcję, okolicę pachwinową można ogolić w celu usunięcia sierści przed dezynfekcją etanolem.
- Chwyć tylną nogę i zegnij staw biodrowy, aby uzyskać kąt stawu biodrowego pod kątem około 90°.
- Za pomocą zakrzywionych kleszczy do mikropreparacji weź skórę myszy w okolicy pachwinowej, w której zgięty jest staw biodrowy i lekko pociągnij zwilżoną skórę do góry.
- Przytrzymując skórę kleszczami, wytnij małe nacięcie (<5 mm) na wylot skóry za pomocą nożyczek chirurgicznych.
- Umieść końcówkę zamkniętych nożyczek w nacięciu i dalej otwórz nacięcie, otwierając nożyczki, trzymając je wewnątrz nacięcia. Spowoduje to rozerwanie się skóry i powinno mieć średnicę mniejszą niż 10 mm. Uwaga: W celu poprawy widoczności można użyć zimnego źródła światła z elastycznymi światłowodami. U starszych myszy, zwłaszcza samców, identyfikacja węzła chłonnego może być trudna ze względu na dużą ilość tkanki tłuszczowej w okolicy pachwinowej.
3. Wstrzyknięcie dolimfatyczne
- Przygotować strzykawkę (0,5 ml lub mniej) z igłą podskórną o sile 28-30 g; krótkie skos może być lepszy niż długi skos. Pobrać 10 μl szczepionki do wstrzyknięcia i upewnić się, że strzykawka jest wolna od powietrza.
- Zlokalizuj pachwinowy węzeł chłonny za pomocą zakrzywionych kleszczy i końcówki zamkniętych nożyczek. Węzeł chłonny będzie wyglądał na szarawy w bardziej białawej tkance tłuszczowej i może być dalej identyfikowany przez naczynia włosowate doprowadzające i odprowadzające wchodzące i wychodzące z węzła chłonnego.
- Unieruchomić węzeł chłonny, trzymając go między gałęziami zakrzywionych kleszczy.
- Wziąć strzykawkę i wprowadzić igłę do węzła chłonnego skosem skierowanym do góry, upewniając się, że cały skos wchodzi do węzła chłonnego.
- Wstrzyknąć szczepionkę (10 μl). Jeśli węzeł chłonny puchnie (powiększa się), można założyć, że wstrzyknięcie się powiodło. Jeśli igła nie zostanie umieszczona wystarczająco głęboko w węźle chłonnym, część lub cała szczepionka może wycieknąć i nie dostać się do węzła chłonnego. Jeśli igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko, wstrzyknięta szczepionka zostanie uwolniona podskórnie poniżej węzła chłonnego. W tym drugim przypadku należy powtórzyć wstrzyknięcie lub wymienić mysz na nową, nieleczoną mysz.
4. Zamykanie nacięcia przez zszywanie
- Otwórz opakowanie sterylnych szwów chirurgicznych.
- Chwycić igłę do szycia za pomocą uchwytu igły w dystalnej części korpusu igły. Dokręcić uchwyt igły, ściskając go, aż pierwsza grzechotka się złapie.
- Chwyć skórę po jednej stronie nacięcia za pomocą kleszczy (w zależności od preferencji chirurga można użyć kleszczy zębatych lub nieząbkowanych lub haczyków do skóry). Wbić igłę ok. 2-3 mm od krawędzi nacięcia, wchodząc od zewnątrz skóry.
- Poluzuj uchwyt skóry kleszczami i chwyć kleszczami przeciwną stronę nacięcia. Wbić igłę ok. 2-3 mm od krawędzi nacięcia, wchodząc od wewnętrznej strony skóry.
- Poluzować uchwyt igły i chwycić koniec igły kleszkami. Przeciągnij igłę z bieżnikiem przez skórę, pozostawiając dogodną długość bieżnika poza pierwszym punktem wkłucia igły (jeśli ma być leczonych kilka myszy, pozostaw krótszy koniec; 5-10 myszy można operować za pomocą jednej igły/bieżnika do szycia).
- Wykonaj preferowany węzeł zgodnie ze standardowymi protokołami chirurga. Jeden szew jest wystarczający, jeśli nacięcie nie jest większe niż 10 mm. W przypadku większych nacięć wykonaj drugi ścieg.
5. Leczenie pooperacyjne
- Umieść mysz w klatce i przykryj chusteczkami, aby się ogrzały. Podczas leczenia wielu myszy umieść je blisko siebie, aby się ogrzać. Alternatywnie umieść myszy na ciepłej podkładce, aż się obudzą.
- Obserwuj myszy, aż się obudzą.
- Obserwuj myszy codziennie pod kątem gojenia się ran, a także innych objawów klinicznych, takich jak infekcje ran. Rana jest zazwyczaj wystarczająco zamknięta w ciągu dwóch dni i zagojona w ciągu siedmiu dni od zabiegu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Procedura wtryskiwania wewnątrzlimfatycznego u myszy, mimo swojego chirurgicznego charakteru, jest prosta i stosunkowo szybka. Przeszkolona osoba może przeprowadzić tę procedurę w 3-4 min. Cięcie zamknięte jednym szwem zazwyczaj goi się w ciągu dwóch dni (Rysunek 1)
Szczepienia lub immunizację wewnątrzlimfatyczną przeprowadzano z wykorzystaniem mRNA, plazmidowego DNA, peptydów, białek, wirusów oraz bakterii. Rysunek 2 przedstawia produkcję przeciwciał po immun...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wykazano, że immunizacja dolimfatyczna i immunoterapia są odpowiednie do stymulacji zarówno odpowiedzi przeciwciał, jak i odpowiedzi limfocytów T. Jak wykazano w tym artykule wideo, dolimfatyczna procedura szczepienia jest szybką i łatwą metodą stymulowania silnej odpowiedzi immunologicznej u myszy. Przeszkolony chirurg może wykonać zabieg w ciągu 3-4 minut. Sesja może być również dzielona między dwóch chirurgów, z których jeden zazwyczaj wykonuje znieczulenie i szycie, a drugi chirurg wykonuje nacięcie i wstrzyknięcie. ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
TMK jest wymieniony jako wynalazca patentów dotyczących immunoterapii dolimfatycznej u ludzi. TMK był doradcą naukowym i otrzymał zwrot kosztów podróży od ImVisioN GmbH, Cytos Biotechnology, MannKind Corporation i XBiotech USA Inc. PJ nie ma żadnych sprzecznych interesów, aby ujawnić.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni za eksperymentalną pomoc w opracowaniu metody immunizacji dolimfatycznej u myszy od Iris Erdmann, Barbary von Beust i Julii Marii Martínez-Gómez. Dziękujemy również Maggy Arras i Nikoli Cesarovic za to, że pozwoliły nam wykorzystać swoją salę operacyjną do tej produkcji wideo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ketamina (Ketasol-100) | Graeub AG, Szwajcaria | Środki znieczulające | |
| Ksylazyna (Rompun) | Bayer, Niemcy | Środki znieczulające | |
| Viscotears Żel pod oczy | Novartis, Szwajcaria | Aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas znieczulenia. | |
| BD Micro-Fine 0,5 ml | BD Medical, Francja | 29 G Strzykawki insulinowe z igłami przymocowanymi na stałe | |
| 6-0 Dermalon Monofilament Nylon | Covidien, MA, USA | Do szwów (0,7 metrycznych, 18 G, 45 cm, niebieskich) | |
| Kleszcze zakrzywione, 4,5 cala | Polymed, Szwajcaria | Do nacinania i trzymania węzła chłonnego | |
| Proste nożyczki chirurgiczne, 4.5 w | Polymed, Szwajcaria | Do nacięcia | |
| Uchwyt igły, 5,5 cala | Polymed, Szwajcaria | Aby zamknąć nacięcie szwem |
Bibliografia
- Johansen, P., et al. Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity. Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).
- Maloy, K. J., et al. Intralymphatic immunization enhances DNA vaccination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3299-3303 (2001).
- Smith, K. A., et al. Enhancing DNA vaccination by sequential injection of lymph nodes with plasmid vectors and peptides. Vaccine. 27, 2603-2615 (2009).
- Kreiter, S., et al. Intranodal vaccination with naked antigen-encoding RNA elicits potent prophylactic and therapeutic antitumoral immunity. Cancer Res. 70, 9031-9040 (2010).
- Johansen, P., et al. Antigen kinetics determines immune reactivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).
- Smith, K. A., et al. Lymph node-targeted immunotherapy mediates potent immunity resulting in regression of isolated or metastatic human papillomavirus-transformed tumors. Clin. Cancer Res. 15, 6167-6176 (2009).
- Johansen, P., et al. Toll-like receptor ligands as adjuvants in allergen-specific immunotherapy. Clin. Exp. Allergy. 35, 1591-1598 (2005).
- Johansen, P., et al. Heat denaturation, a simple method to improve the immunotherapeutic potential of allergens. Eur. J. Immunol. 35, 3591-3598 (2005).
- Martinez-Gomez, J. M., et al. Intralymphatic injections as a new administration route for allergen-specific immunotherapy. Int. Arch. Allergy Immunol. 150, 59-65 (2009).
- Martinez-Gomez, J. M., et al. Targeting the MHC class II pathway of antigen presentation enhances immunogenicity and safety of allergen immunotherapy. Allergy. 64, 172-178 (2009).
- Mohanan, D., et al. Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems. J. Control Release. 147, 342-349 (2010).
- Waeckerle-Men, Y., et al. Lymph node targeting of BCG vaccines amplifies CD4 and CD8 T-cell responses and protection against Mycobacterium tuberculosis. Vaccine. 31, 1057-1064 (2013).
- von Beust, B. R., et al. Improving the therapeutic index of CpG oligodeoxynucleotides by intralymphatic administration. Eur. J. Immunol. 35, 1869-1876 (2005).
- Senti, G., et al. Intralymphatic immunotherapy for cat allergy induces tolerance after only 3 injections. J. Allergy Clin. Immunol. 129, 1290-1296 (2012).
- Senti, G., et al. Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).
- Lesterhuis, W. J., et al. Route of administration modulates the induction of dendritic cell vaccine-induced antigen-specific T cells in advanced melanoma patients. Clin. Cancer Res. 17, 5725-5735 (2011).
- Fadul, C. E., et al. Immune response in patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme treated with intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccination after radiation chemotherapy. J. Immunother. 34, 382-389 (2011).
- Eizenberg, P., et al. Acceptance of Intanza(R) 9 mug intradermal influenza vaccine in routine clinical practice in Australia and Argentina. Adv. Ther. 28, 640-649 (2011).
- Durando, P., et al. Adjuvants and alternative routes of administration towards the development of the ideal influenza vaccine. Hum. Vaccin. 7, 29-40 (2011).
- Barth, R. J., et al. A randomized trial of ex vivo CD40L activation of a dendritic cell vaccine in colorectal cancer patients: tumor-specific immune responses are associated with improved survival. Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).
- Schwaab, T., et al. Clinical and immunologic effects of intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccine with Aldesleukin (Interleukin 2) and IFN-{alpha}2a therapy in metastatic renal cell carcinoma patients. Clin. Cancer Res. 15, 4986-4992 (2009).
- Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. Intralymphatic immunotherapy. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 9, 537-543 (2009).
- Catron, D. M., Itano, A. A., Pape, K. A., Mueller, D. L., Jenkins, M. K. Visualizing the first 50 hr of the primary immune response to a soluble antigen. Immunity. 21, 341-347 (2004).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nat. Immunol. 4, 733-739 (2003).
- Johansen, P., Mohanan, D., Martinez-Gomez, J. M., Kundig, T. M., Gander, B. Lympho-geographical concepts in vaccine delivery. J. Control Release. 148, 56-62 (2010).
- Johansen, P., von Moos, S., Mohanan, D., Kundig, T. M., Senti, G. New routes for allergen immunotherapy. Hum. Vacc. Immunother. 8, 1525-1533 (2012).
- Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. Intralymphatic immunotherapy: from the rationale to human applications. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 352, 71-84 (2011).
- Duthie, M. S., Windish, H. P., Fox, C. B., Reed, S. G. Use of defined TLR ligands as adjuvants within human vaccines. Immunol. Rev. 239, 178-196 (2011).
- Ribas, A., et al. Intra-lymph node prime-boost vaccination against Melan A and tyrosinase for the treatment of metastatic melanoma: results of a phase 1 clinical trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).
- Bedrosian, I., et al. Intranodal administration of peptide-pulsed mature dendritic cell vaccines results in superior CD8+ T-cell function in melanoma patients. J. Clin. Oncol. 21, 3826-3835 (2003).
- Lesimple, T., et al. Injection by various routes of melanoma antigen-associated macrophages: biodistribution and clinical effects. Cancer Immunol. Immunother. 52, 438-444 (2003).
- Brown, K., et al. Adenovirus-transduced dendritic cells injected into skin or lymph node prime potent simian immunodeficiency virus-specific T cell immunity in monkeys. J. Immunol. 171, 6875-6882 (2003).
- Fong, L., Brockstedt, D., Benike, C., Wu, L., Engleman, E. G. Dendritic cells injected via different routes induce immunity in cancer patients. J. Immunol. 166, 4254-4259 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
