Badania przesiewowe genetyki za pośrednictwem VIGS w celu identyfikacji genów zaangażowanych w oporność na zwierzęta inne niż gospodarz

Podsumowanie

Wyciszanie genów wywołane przez wirusa jest użytecznym narzędziem do identyfikacji genów zaangażowanych w odporność roślin na brak gospodarza. Pokazujemy zastosowanie patogenów bakteryjnych eksprymujących GFPuv w identyfikacji roślin wyciszonych genowo podatnych na patogeny niebędące gospodarzem. Takie podejście jest łatwe, szybkie i ułatwia badania przesiewowe na dużą skalę, a podobny protokół można zastosować do badania różnych innych interakcji roślina-mikroorganizm.

Streszczenie

Odporność roślin na choroby niebędące żywicielem na patogeny bakteryjne jest kontrolowana przez złożone szlaki obronne. Zrozumienie tego mechanizmu jest ważne dla opracowania trwałych, odpornych na choroby roślin przeciwko szerokiej gamie patogenów. Badania przesiewowe genetyki z wyprzedzeniem oparte na wyciszaniu genów indukowanych przez wirusy (VIGS) są użytecznym podejściem do identyfikacji genów obronnych roślin nadających odporność na zwierzęta niebędące gospodarzem. Wektor VIGS oparty na wirusie grzechotki tytoniu (TRV) jest jak dotąd najskuteczniejszym wektorem VIGS i został skutecznie wykorzystany do wyciszenia endogennych genów docelowych u Nicotiana benthamiana.

W tym manuskrypcie demonstrujemy podejście do badań przesiewowych genetyki w celu wyciszenia pojedynczych klonów z biblioteki cDNA w N. benthamiana i oceny odpowiedzi roślin wyciszonych genami na upośledzoną odporność niegospodarza na patogeny niebędące gospodarzem, Pseudomonas syringae pv. pomidor T1, P. syringae pv. glycinea i X. campestris pv. pęcherzyki. Te patogeny bakteryjne są zaprojektowane tak, aby wyrażać białko GFPuv, a ich zielone fluorescencyjne kolonie można zobaczyć gołym okiem w świetle UV w roślinach zaszczepionych patogenami niebędącymi gospodarzem, jeśli wyciszony gen docelowy jest zaangażowany w przekazywanie odporności na osobę nieposiadającą gospodarza. Ułatwia to niezawodną i szybszą identyfikację roślin z wyciszonymi genami, podatnych na patogeny niebędące gospodarzem. Co więcej, obiecujące informacje o genach kandydujących można poznać poprzez sekwencjonowanie insercji genu roślinnego w wektorze TRV. Tutaj pokazujemy wysoką przepustowość genetyki naprzód za pośrednictwem VIGS w celu identyfikacji genów zaangażowanych w oporność na osoby niebędące gospodarzem. W przybliżeniu 100 cDNA można indywidualnie wyciszyć w ciągu około dwóch do trzech tygodni, a ich znaczenie w oporności nie-gospodarza na kilka patogenów bakteryjnych niebędących gospodarzem można zbadać w ciągu tygodnia. W niniejszym manuskrypcie wymieniamy szczegółowe etapy tego badania. Podejście do badań przesiewowych genetyki za pośrednictwem VIGS można rozszerzyć nie tylko o identyfikację genów odpowiedzialnych za oporność na osoby niebędące gospodarzem, ale także o badanie genów odpowiedzialnych za różne tolerancje na stres biotyczny i abiotyczny u różnych gatunków roślin.

Wprowadzenie

Oporność na osobę niebędącą żywicielem to odporność wszystkich gatunków roślin na rasy określonego patogenu^1,2. Nadaje to roślinom szerokie spektrum i trwałą odporność na choroby^2,3. Jednak jego mechanizm, szczególnie przeciwko patogenom bakteryjnym, nie jest dobrze poznany⁴. Badania przesiewowe pod kątem mutantów lub wyciszonych roślin, które obniżają oporność na organizm niebędący gospodarzem, oraz profilowanie transkryptów o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji podczas oporności na organizm inny niż gospodarz^5-9 to dwa główne podejścia stosowane wcześniej do analizy oporności bakterii na osoby niebędące gospodarzem. Ponieważ oporność na organizm niebędący gospodarzem jest kontrolowana przez złożony mechanizm (mechanizmy)⁴ z udziałem wielu genów, wysokowydajne podejście genomiczne do identyfikacji genów ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia mechanizmów oporności na organizmy inne niż gospodarz.

Wyciszanie genów wywołane przez wirusa (VIGS) zostało z powodzeniem wykorzystane do wyciszenia endogennych genów roślin u wielu gatunków roślin^10,11. Nicotiana benthamiana jest jedną z najlepiej nadających się roślin do VIGS^10,12, a jej wstępna sekwencja genomu jest teraz dostępna¹³. VIGS oparty na wirusie grzechotki tytoniu (TRV) jest szeroko stosowany jako narzędzie genetyki odwrotnej do charakteryzowania genów zaangażowanych w oporność na osoby niebędące gospodarzem^2,4,14. Te wektory VIGS i pochodne są teraz dostępne za pośrednictwem Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC, http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html). VIGS został również wykorzystany jako narzędzie genetyki do identyfikacji genów zaangażowanych w odporność roślin^15-17, zwłaszcza odporność na osoby niebędące gospodarzem^6,18. Ocena śmierci komórek wywołanej przez nadwrażliwość (HR) wywołana przez rośliny przeciwko określonemu patogenowi niebędącemu gospodarzem oraz ocena śmierci komórki wywołanej chorobą to dwa główne testy stosowane głównie do identyfikacji podatnych roślin wyciszonych genowo. Jednak śmierć komórek HR jest indukowana tylko przeciwko patogenom typu II niebędącym gospodarzem, a nie przeciwko patogenom typu I niebędącym gospodarzem². W związku z tym testy HR nie mogą być powszechnie stosowane do identyfikacji strategii oporności niebędących gospodarzami stosowanych przez rośliny, zwłaszcza przeciwko szerokiemu zakresowi patogenów typu I niebędących gospodarzem. Ponadto częściowa utrata odporności na organizmy inne niż gospodarz w roślinie wyciszonej genami nie zawsze prowadzi do objawów chorobowych⁶, a zatem ocena choroby nie może być wykorzystana do identyfikacji roślin osłabiających odporność na organizmy niebędące gospodarzem. W przeciwieństwie do tego, ocena wzrostu patogenów niebędących gospodarzem w roślinach wyciszonych genami jest lepszą metodą badania utraty odporności na patogeny niebędące gospodarzem w roślinach wyciszonych genowo

.

W porównaniu z konwencjonalnym testem wzrostu^6,19, szybsza metoda oceny wzrostu bakterii niebędących gospodarzem na roślinach wyciszonych genami może skrócić czas wymagany do przeprowadzenia badań przesiewowych genetyki. Wcześniej opisaliśmy metodę obserwacji wzrostu patogenów bakteryjnych na liściach gołym okiem w świetle ultrafioletowym (UV) przy użyciu bakterii eksprymujących białko zielonej fluorescencji (GFP)¹⁹. W tym manuskrypcie pokazujemy przydatność GFPuv eksprymujących patogeny bakteryjne niebędące gospodarzem w celu łatwej identyfikacji roślin wyciszonych genowo, które są zagrożone pod kątem oporności na organizmy niebędące gospodarzem. Metodologia ta jest dokładna w identyfikacji roślin podatnych i nadaje się do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości.

Protokół

1. Wzrost roślin i wyciszanie genów docelowych

1. Warunki wzrostu roślin:
   1. Wysiewaj nasiona N. benthamiana na bezglebowej mieszance doniczkowej Metro-Mix 350 i kiełkuj nasiona w komorze wzrostowej. Zamiast Metro-Mix można również użyć dowolnego innego podłoża glebowego lub bezglebowego.
   2. Trzytygodniowe sadzonki należy przesadzić do pojedynczych doniczek i wyhodować je w szklarni utrzymywanej w temperaturze 21±2 °C wraz z innymi warunkami wzrostu, jak opisano w poprzedniej literaturze¹². Dwa do trzech dni po przesadzeniu rośliny można wykorzystać do inokulacji TRV.
2. Uprawa klonów TRV2:
   TRV jest wirusem dwudzielnym, a jego genom składa się z RNA1 i RNA2. RNA1 koduje zależną od RNA polimerazę RNA i białko ruchu^20,21. RNA2 koduje białko płaszcza (CP) i dwa białka niestrukturalne z subgenomowych RNA²¹. Zarówno RNA1, jak i RNA2 są niezbędne do tworzenia dojrzałych cząstek wirusa i ich rozprzestrzeniania^{się 20,21}. Budowa biblioteki cDNA w wektorze TRV2 została opisana w dotychczasowej literaturze^22,23. Krótko mówiąc, biblioteka VIGS wykorzystana w tym badaniu została zbudowana z RNA wyekstrahowanego z tkanek liści wystawionych na działanie różnych elicytorów biotycznych i abiotycznych.
   1. Wyjmij Agrobacterium (szczep GV2260) zawierający klony cDNA w wektorze TRV2 (płytka 96-dołkowa) z zamrażarki. Stopniowo je rozmrażaj, a gdy kultury osiągną temperaturę pokojową, zaszczepij poszczególne kultury Agrobacterium na płytce agarowej Luria-Bertani (LB) ryfampicyną (10 μg/ml) i kanamycyną (50 μg/ml) za pomocą 96-pinowego replikatora.
   2. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C przez dwa dni. Zwykle hodujemy cztery replikowane kolonie dla każdego klonu, tak aby dostępna była odpowiednia ilość inokulum Agrobacterium do nakłucia dwóch roślin. Wykonaj wszystkie kroki w sterylnych warunkach.
3. VIGS:
   1. Uprawiać Agrobacterium (GV2260) niosącego TRV1 w temperaturze 28 °C w płynnym podłożu LB z antybiotykami wymienionymi powyżej. Zebrać komórki przez odwirowanie z kultur wyhodowanych przez noc, ponownie zawiesić w buforze inokulacyjnym (10 mM MES, pH 5,5; 200 μM acetosyringonu) i inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością 50 obr./min.
   2. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić w buforze MES o pojemności 5 mM (pH 5,5) i zaszczepić (OD₆₀₀ = 0,3) po stronie abaksjalnej 3-4 liści N. benthamiana za pomocą strzykawki bezigłowej. Szczegółowa procedura inokulacji została przedstawiona w dotychczasowej literaturze²⁴. Następnie, w miejscu inokulacji TRV1, zaszczepić odpowiednie kolonie TRV2, nakłuwając liście wykałaczką.
   3. Utrzymuj rośliny z odpowiednim odżywianiem, ponieważ energiczny wzrost jest ważny dla wydajnego VIGS¹². Około dwa tygodnie po inokulacji transkrypty docelowych genów zaczną się zmniejszać, a rośliny będą gotowe do inokulacji patogenów po trzech tygodniach od inokulacji TRV.

2. Przygotowanie kultur patogenów niebędących żywicielami i inokulacja roślin

1. Szczegółowe informacje na temat patogenów wykorzystanych w tym badaniu:
   Pseudomonas syringae pv. tabaci, P. syringae pv. pomidor T1, P. syringae pv. glycinea i Xanthomonas campestris pv. W tym badaniu wykorzystano vesicatoria. Szczepy P. syringae należy uprawiać w płynnym podłożu King's B (KB) uzupełnionym ryfampicyną (10 μg/ml), kanamycyną (50 μg/ml) w temperaturze 28 °C przez 12 godzin. Uprawiać X. campestris pv. pęcherzyki w płynnym podłożu LB przez 16 godzin. Wszystkie patogeny zawierają plazmid, który może wyrażać GFPuv, jak opisano w poprzedniej literaturze¹⁹.
2. Przygotowanie kultur patogenów do inokulacji roślin:
   1. Zbierz komórki bakteryjne przez odwirowanie i potwierdź obecność zielonej fluorescencji za pomocą lampy UV o długiej długości fali w ciemności. Umyj komórki dwukrotnie sterylną wodą i ponownie zawiesić je do pożądanego stężenia za pomocą sterylnej wody.
   2. Zaszczepić odpowiedni patogen(y) po stronie wyciszonych liści genu docelowego (od 5^do 8^cm) w postaci plamek (o średnicy około 1,5 cm). Kilka patogenów niebędących gospodarzami może być jednocześnie testowanych pod kątem ich wzrostu w roślinach wyciszonych przez gen docelowy. Jednocześnie zaszczepić patogen gospodarza, ponieważ może to być wykorzystane jako kontrola pozytywna do oglądania wzrostu bakterii planta. Zaszczepij również rośliny kontroli wektorów (TRV::00).

3. Obserwacja rozwoju patogenów bakteryjnych u roślin

1. Wystaw zaszczepione liście na działanie światła UV o dużej długości fali w ciemności. Kolonie bakteryjne można postrzegać jako zielone fluorescencyjne kropki po stronie abaksjalnej liścia na tle czerwonej fluorescencji emitowanej przez powierzchnię liścia.
2. Obserwuj wzrost patogenu od 2 dni po inokulacji (dpi) do 5 dpi. Codzienna obserwacja w tym przedziale czasowym jest konieczna.
3. Po pierwszym badaniu przesiewowym należy sporządzić krótką listę klonów, których wyciszenie powoduje wzrost jednego lub więcej patogenów niebędących gospodarzami.
4. Powtórz VIGS dla wybranych klonów i ponownie przetestuj reakcję roślin wyciszonych genami na patogen(y) niebędące gospodarzem. Ten drugi poziom kontroli przesiewowej ma na celu usunięcie wyników fałszywie dodatnich uzyskanych podczas pierwszego badania.

4. Potwierdzenie zakwalifikowanych roślin pod kątem obniżonej odporności na brak żywiciela

1. Wycisz klony cDNA wybrane z ekranu, jak opisano powyżej. Zaszczep całą roślinę patogenem (patogenami) niebędącym żywicielem, zanurzając rośliny w odpowiednich kulturach patogenów 0,01% (v/v) Silwet L-77 i poddając zanurzone rośliny próżni przez 3 - 5 minut. Określ ilościowo wzrost bakterii za pomocą konwencjonalnego testu wzrostu^6,18,19, jak opisano poniżej.
2. Po 0 godzinach od inokulacji (hpi), 3 dpi i 5 dpi należy pobrać dwie próbki liści z pięciu powtórzeń biologicznych dla każdego zaszczepionego patogenu (patogenów) niebędącego gospodarzem (patogenów) za pomocą stempla do liści (0,5^cm2). Próbki liści zmielić, seryjnie rozcieńczyć i rozlać sok na pożywkę agarową KB uzupełnioną odpowiednimi antybiotykami i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 dni. Policz kolonie bakteryjne za pomocą licznika kolonii i oblicz wzrost bakterii w liściach zgodnie z opisem w poprzedniej literaturze⁶.
3. Rośliny podatne na patogen(y) niebędące żywicielem powinny wykazywać większą liczbę patogenów w porównaniu do zwalczania wektorów.

5. Sekwencjonowanie insercji i identyfikacja genu docelowego

1. Wykonaj PCR kolonii dla wybranego klonu przy użyciu starterów attB1 i attB2 lub przy użyciu starterów flankujących miejsce klonowania w wektorze TRV2. Uruchom produkt PCR na żelu i sprawdź, czy pojedyncze prążki są wzmocnione.
2. Insercja genu roślinnego w wektorze TRV2 może być sekwencjonowana przy użyciu starterów attB lub starterów flankujących miejsce klonowania.
3. Wykonaj BLAST przy użyciu sekwencji i zidentyfikuj szczegóły genu.
4. Uzyskaj pełną długość sekwencji genów wraz z regionami nieulegającymi translacji (UTR).
5. Wybierz fragmenty o długości 300-400 pz z trzech różnych regionów sekwencji i sklonuj je do wektora TRV2. Niezależne wykonanie VIGS przy użyciu wszystkich trzech konstruktów VIGS i potwierdzenie naruszenia odporności na brak gospodarza we wszystkich trzech roślinach wyciszonych genowo.

Wyniki

Głównym celem tego badania jest zademonstrowanie metody łatwej i dokładnej identyfikacji wyciszonych genami roślin N. benthamiana, które są zagrożone pod względem odporności na osoby niebędące gospodarzem. Metodologia ta składa się z czterech głównych etapów. Pierwszym krokiem jest indywidualne wyciszenie dużej liczby genów za pomocą TRV-VIGS. Wyciszyliśmy około 5000 genów^6,18 w ciągu około 1,5 roku, korzystając z protokołu przedstawionego na rycinie 1. Niektóre z roślin wyciszonych...

Dyskusja

Odporność roślin ogranicza wzrost patogenów niebędących gospodarzem, a zatem niewielka lub żadna zielona fluorescencja nie jest emitowana z liści roślin kontrolujących wektory zaszczepionych patogenem niebędącym gospodarzem w świetle UV o dużej długości fali (ryc. 3D). Jednakże, gdy gen zaangażowany w oporność na gospodarza jest wyciszony, rośliny wyciszone genem sprzyjają wzrostowi patogenu niebędącego gospodarzem i widoczna jest zielona fluorescencja (ryc. 3E). Jest to podstawowa zasad...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96-dołkowe płyty dolne w kształcie litery U	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)	35-3077
96-pinowy replikator ze stali nierdzewnej	Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)	250520
Lampy inspekcyjne UV o wysokiej intensywności, model B-100ap	Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)	6283K50	ID producenta 95-0127-01
Licznik	kolonii Stuart SC6Bibby Scientific Limited, Staffordshire, Wielka Brytania	SC6PLUS
Bezglebowa mieszanka doniczkowa, Metro-Mix 350	SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
Podkłady: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)	Niestandardowo syntetyzowany
MES, monohydrat	VWR international (Radnor, PA, USA)Nr	CAS 145224-94-8
Acetosyringon (dimetoksy-4'-hydroksyacetofenon)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)	Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)	VIS-30