Techniki fizjologiczne i anatomiczne są demonstrowane w celu rozwiązania funkcji i struktury proprioceptorów stawów oraz receptorów napięcia mięśniowego u kończyn chodzących skorupiaków.
Artykuł metodologiczny
Receptory propriocepcji i napięcia w kończynach kraba: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Głównym celem tych procedur jest pokazanie dla celów dydaktycznych i badawczych, jak rejestrować aktywność żywych pierwotnych neuronów czuciowych odpowiedzialnych za propriocepcję, gdy wykrywają one pozycję i ruch stawów oraz napięcie mięśniowe. Aktywność elektryczna proprioceptorów skorupiaków i receptorów napięcia jest rejestrowana przez podstawowe oprzyrządowanie neurofizjologiczne, a przetwornik służy do jednoczesnego pomiaru siły generowanej przez stymulację nerwu ruchowego. Ponadto pokazujemy, jak barwić neurony w celu szybkiej oceny ich anatomicznego ułożenia lub trwałego utrwalenia. Barwienie ujawnia organizację anatomiczną, która jest reprezentatywna dla narządów strunowych u większości skorupiaków. Porównanie reakcji nerwów napięciowych z reakcjami proprioceptywnymi jest skutecznym narzędziem dydaktycznym w określaniu, w jaki sposób te neurony czuciowe są zdefiniowane funkcjonalnie i jak anatomia jest skorelowana z tą funkcją. Przedstawiono trzy techniki barwienia, które pozwalają badaczom i instruktorom wybrać metodę, która jest idealna dla ich laboratorium.
Wprowadzenie
Propriocepcja to odczucie pozycji kończyny i ruchu, które umożliwia skoordynowane zachowanie motoryczne. Proprioceptory składają się z receptorów pozycji (statycznych) i ruchowych (kinestetycznych). U owadów i skorupiaków narządy strunowce są strukturami, które dostarczają tę informację do OUN1. Nie wszystkie narządy strunowce obejmują staw, ale nadal mogą monitorować ruchy stawów ze względu na ich przyczepienie do apodemów (struktur przypominających ścięgna), które obejmują staw i poruszają się w połączeniu z mięśniami szkieletowymi i artykulacją stawu. Nogi kraba mają sześć stawów, z których każdy ma jeden lub dwa narządy strunowe2. Zazwyczaj narząd strunowy ma 60-100 lub więcej neuronów czuciowych osadzonych w elastycznym pasmie, neuronach, które sygnalizują statyczne położenie stawu, kierunek i prędkość ruchu3-6. Dane wejściowe z narządów strunowych w każdym stawie i nodze są następnie przetwarzane centralnie, umożliwiając skoordynowane ruchy zwierzęcia.
Siły, które mięśnie nóg wytwarzają podczas skurczów izometrycznych i izotonicznych, są wykrywane przez receptory napięcia związane z włóknami mięśniowymi i ich przyczepieniem do apodemów7-9. W następujących protokołach chodu skorupiaków prezentujemy metodologię zapisów z pierwotnych neuronów czuciowych, które monitorują propriocepcję oraz neuronów, które reagują na siły generowane przez włókna mięśniowe. Przedstawiono również technikę aktywacji ruchów nóg i ilościowego określania generowania siły, a także techniki anatomiczne, które można wykorzystać do scharakteryzowania układu tych struktur obwodowego układu nerwowego.
Procedury przedstawione poniżej umożliwiają analizę strukturalną i funkcjonalną neuronów, które unerwiają oba typy receptorów w stosunku do ich lokalizacji na elastycznej nici kosmówkowej i apodemie. Aby to zilustrować, używamy narządu strunowo-daktylopodytowego (PD), narządu, który obejmuje najbardziej dystalny segment nogi kraba3. Chociaż szczegółowe badania elektrofizjologiczne rozpoczęły się w latach trzydziestych XX wieku i są prowadzone do dziś, pewne aspekty stały się znane na temat segmentowych połączeń proprioceptorów w różnych stawach i ich roli w skoordynowanej kontroli mięśni10-16. Ustalenie relacji struktura-funkcja między narządami proprioceptywnymi, mięśniami i układem nerwowym pomoże w dalszym określeniu tych ról. Na przykład, znakowanie somatów i dystalnych zakończeń neuronów napięciowych wprowadzonych do apodemu ujawni ich położenie względem włókien mięśniowych8,17-21.
Prezentujemy trzy techniki barwienia nóg skorupiaków, które mogą być używane w laboratoriach badawczych lub akademickich. Barwienie błękitem metylenowym zapewnia odpowiedni kontrast dla mięśni i nerwów i jest zalecane jako prosta technika nauki anatomii dla studentów. Laboratoria, które mają konfiguracje do mikroskopii fluorescencyjnej, mogą osiągnąć bardziej selektywne barwienie neuronów poprzez krótkie wystawienie nerwów na działanie ważnego barwnika 4-di-2-ASP. Trzecią alternatywą jest zasypka CoCl2, która barwi i utrwala neurony i nie wymaga obrazowania fluorescencyjnego. Chociaż jest to pracochłonne i czasochłonne, ten proces barwienia zapewnia wysoki kontrast i specyficzność dla nerwów, które są wypełnione. Razem techniki te mogą być stosowane do porównywania różnych narządów strunowcowych, nie tylko w obrębie kończyny lub między kończynami, ale także wśród innych gatunków skorupiaków i owadów20-22. Kraby niebieskie (C. sapidus) używane w zapisach fizjologicznych i do barwienia anatomicznego są łatwo dostępne na całej południowej i południowo-wschodniej granicy Stanów Zjednoczonych. Gatunek ten służy jako przedstawiciel układów nerwów strunowych i napięciowych występujących u większości krabów. Laboratoria na zachodnim wybrzeżu będą wolały używać do tych eksperymentów znacznie większego kraba Dungeness (magister raka).
Protokół
1. Disekccja i rejestracja aktywności elektrycznej nerwu propodytu i daktylopodytu (PD)
- Przytrzymaj kraba za karapaks od tyłu i, unikając szczypiec, uciśnij proksymalną część meropoditu pęsetą. Noga ulegnie autotomii, aby zapobiec wykrwawieniu się zwierzęcia. Zachowaj ostrożność podczas pracy z krabami niebieskimi, ponieważ są one dość agresywne i bardzo szybkie.
Rysunek 1. Pierwsza noga kroczna kraba. Na schemacie naniesiono anatomiczną lokalizację organów chordotonalnych (obszary kreskowane). Podwójna strzałka wskazuje miejsce przecięcia nogi na potrzeby eksperymentów z nerwem PD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz. - Wykonaj cięcie między propoditem a karpoditem. Usuń karpopodit wraz z przymocowanym meropoditem (Rysunek 1).
- Za pomocą skalpela z ostrzem nr 11 wytnij duże okno w kutykuli po pigmentowanej (bocznej) stronie propoditu (Rysunek 2 i 3). Uwaga: Nie tnij zbyt głęboko.
- Usuń warstwę kutykuli, przesuwając ostrze skalpela pod kutykulą i równolegle do niej. Pozwala to na przecięcie włókien mięśniowych przytwierdzonych do kutykuli.
- Stosując tę samą technikę, wytnij mniejsze okno po niepigmentowanej (przyśrodkowej) stronie propoditu, pozostawiając jednak nienaruszone przyczepy kłykcia (stawu panewkowego lub zawiasu między segmentami).
Rysunek 2. Cięcie wzdłuż linii przerywanej na propodicie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Rysunek 3. Odsłonięcie nerwu w oknie (strzałki obrysowują pęczek nerwowy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz. - Przygotuj naczynie wyłożone Sylgardem, zawierające roztwór soli fizjologicznej dla kraba, aby unieruchomić preparat za pomocą szpilek. Uwaga: Przepisy na roztwory soli dla poszczególnych gatunków znajdują się w Tabeli 1.
- Zlokalizuj organ PD, ostrożnie sondując go wypalanymi szklanymi igłami. Elastyczna nić rozciągnięta nad stawem ma srebrzysty wygląd.
- Usuń włókna mięśniowe, które zasłaniają widok organu po obu stronach ścięgna. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić organu PD ani jego nerwu.
- Po wykonaniu tych czynności mocno przymocuj preparat do naczynia stroną pigmentowaną (boczną) do góry (Rysunek 4).
Rysunek 4. Odsłonięty organ PD i nerw. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz. - Śledź nerw organu PD w propodicie tak daleko proksymalnie, jak to możliwe, aby uwolnić długi odcinek nerwu (1,5 cm) na potrzeby rejestracji. Najlepiej zrobić to, gdy nerw PD jest jeszcze połączony z głównym nerwem nogi.
- Po oddzieleniu nerwu PD od głównego nerwu nogi przy pomocy szklanych igieł, przetnij nerw PD proksymalnie nożyczkami irydologicznymi. Uwaga: Nie rozciągaj ani nie ciągnij nerwu podczas dysekcji.
- Przesuń daktylopodit do pozycji wyprostowanej i całkowicie zgiętej. Zaznacz położenia maksymalnego zgięcia i wyprostu oraz punkt środkowy do późniejszego wykorzystania.
- Umieść przewód uziemiający w kąpieli z soli fizjologicznej.
- Włącz sprzęt i oprogramowanie do rejestracji elektrofizjologicznej. Uwaga: Nasza konfiguracja została opisana wcześniej23.
- Ustaw mikroskop tak, aby znajdował się nad stolikiem mikroskopowym. Po umieszczeniu naczynia z preparatem na stoliku, należy dostosować położenie wiązki oświetlacza o wysokiej intensywności, aby najlepiej zwizualizować preparat.
- Ustaw mikromanipulator tak, aby przymocowany zespół elektrody ssącej miał łatwy dostęp do kąpieli z soli fizjologicznej i preparatu. Elektroda ssąca została wykonana zgodnie z instrukcją w filmie online24.
- Aby wykryć aktywność neuronalną, wciągnij przecięty koniec nerwu PD do elektrody ssącej.
- Przesuwaj daktylopodit między pozycjami wyprostowaną i zgiętą przez kilka cykli za pomocą szklanej sondy lub drewnianego kołka.
- Następnie obserwuj aktywność, gdy daktylopodit jest unieruchomiony w pozycjach: wyprostowanej, zgiętej i środkowej.
2. Rejestracja aktywności elektrycznej nerwu napięciowego podczas monitorowania generowania siły
- Określ stronę boczną i przyśrodkową nogi. Strona przyśrodkowa ma miękką teksturę, którą można wyczuć, delikatnie uszczypując region meropoditu paznokciem.
- Umieść preparat w naczyniu miękką stroną kutykuli do góry. Nerw ruchowy pobudzający, który unerwia mięsień otwierający, unerwia również mięsień rozciągający w carpopodicie.
- Aby pobudzić mięsień otwierający, izoluje się nerw ruchowy mięśnia rozciągającego w regionie carpopoditu i stymuluje go elektrodą ssącą. Proksymalną część nogi usuwa się, przecinając meropodit nożyczkami.
- Usuń fragment kutykuli w regionie nadgarstka po stronie wewnętrznej (strona przyśrodkowa, Rysunek 5A).
- Przetnij apodema mięśnia zginającego i ostrożnie usuń mięsień, aby nie wyciągnąć głównego nerwu nogi z jamy nogi (Rysunki 5B, C; strzałki wskazują miejsce oddzielenia apodemy mięśnia zginającego). Można wtedy zaobserwować główny nerw nogi oraz odgałęzienie do mięśnia rozciągającego (Rysunek 5D).
- Znajdź nerw odchodzący od głównego pęczka nerwowego do mięśnia rozciągającego (Rysunek 5E, przy strzałce). Można go przeciąć blisko mięśnia i wciągnąć do elektrody ssącej w celu stymulacji (Rysunki 5F i G, strzałka wskazuje odgałęzienie).
- Oddziel fragment nerwu biegnący w kierunku mięśnia otwierającego, uważając, aby nie przygnieść nerwu. Przetnij nerw ruchowy mięśnia rozciągającego/otwierającego.
- Wciągnij nerw ruchowy do elektrody ssącej, a następnie go stymuluj.
- Aby odsłonić mięsień otwierający i nerw napięcia, usuń mięsień zamykający oraz region brzuszny propoditu. Odetnij mięsień zamykający w propodicie za pomocą skalpela z ostrzem nr 11 (Rysunek 6). Uwaga: Nie tnij głęboko w regionie proksymalnym, ponieważ może to uszkodzić nerw ruchowy mięśnia otwierającego.
Rysunek 5. Kroki dyssekcji w celu odsłonięcia neuronu ruchowego do stymulacji mięśnia otwierającego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rysunek 6. Przecięcie kutykuli na połowie brzusznej propoditu w celu odsłonięcia mięśnia zamykającego, aby mógł zostać usunięty. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz. - W trakcie procesu dyssekcji wymieniaj sól fizjologiczną na świeżą, schłodzoną sól fizjologiczną, aby utrzymać neurony przy życiu. Do dalszej dyssekcji umieść naczynie z preparatem pod mikroskopem stereoskopowym i użyj oświetlenia światłowodowego.
- Ostrożnie odetnij ścięgno mięśnia zamykającego od miejsca jego przyczepu do daktyla, używając ostrych, średniej wielkości nożyczek.
- Bądź bardzo ostrożny, aby nie uszkodzić odgałęzień do mięśnia otwierającego odchodzących od głównego nerwu nogi, które powinny być wyraźnie widoczne.
- Usuń i odrzuć mięsień zamykający oraz ścięgno.
- Zrób otwór w daktylu za pomocą szpilki sekcyjnej. Otwór ten będzie wykorzystywany później do zamocowania metalowego pinu przetwornika napięcia (siły), jednak konieczne jest wykonanie go na tym etapie procedury.
- Zlokalizuj odgałęzienie nerwu prowadzące do mięśnia otwierającego i apodemy w regionie dystalnym mięśnia otwierającego. Ostrożnie zbadaj nerw za pomocą narzędzia z wypalanego szkła.
- Zaobserwuj nerw napięcia, który wywodzi się z końca dystalnego apodemy i biegnie w stronę pęczka nerwu ruchowego.
- Aby wykryć aktywność neuronalną, napełnij elektrodę ssącą solą fizjologiczną dla kraba i wciągnij przecięty koniec nerwu napięcia mięśnia otwierającego do elektrody. Upewnij się, że elektroda ssąca ściśle przylega do nerwu.
- Zbadaj neuronalny korelat pasywnego napięcia apodemy mięśnia otwierającego. Podczas rejestracji aktywności elektrycznej z nerwu napięcia, szybko obróć daktyla do pozycji wyprostu stawu (t.j. rozciągając mięsień otwierający).
- Następnie sprawdź aktywny rozwój siły w zależności od częstotliwości stymulacji.
- Mocno zamocuj metalowy haczyk tak, aby końcówka haczyka przeszła przez mały otwór w daktylu.
- Przymocuj drugi koniec metalowego haczyka do przetwornika siły. Uwaga: Upewnij się, że przetwornik znajduje się pod kątem 90° za każdym razem, tak aby pin był prostopadły do przetwornika dla maksymalnego wykrycia generowanej siły.
- Pociągnij haczyk i daktyl tak, aby znajdowały się pod kątem około 45° względem stawu otwierającego.
- Teraz stymuluj nerw ruchowy z częstotliwością 100 Hz przez 250 msec i zmierz siłę oraz częstotliwość wyładowań nerwu napięcia.
- Ustaw staw w pozycji pełnego wyprostu, tak aby włókna mięśnia otwierającego były wiotkie.
- Stymuluj nerw ruchowy z częstotliwością 100 Hz przez 250 msec i zmierz siłę oraz częstotliwość wyładowań nerwu napięcia.
- Zgnij staw tak, aby był w pełnym zgięciu (~90°). W tej pozycji włókna mięśnia otwierającego są w pełni rozciągnięte. Przetwornik może zmierzyć pewną siłę wynikającą z tego pasywnego rozciągnięcia mięśnia.
- Stymuluj nerw ruchowy z częstotliwością 100 Hz przez 250 msec i zmierz siłę oraz częstotliwość wyładowań nerwu napięcia.
- Po pomiarze siły przeprowadź serię pomiarów przy różnych częstotliwościach: 20, 40, 60, 80 i 100 Hz przez 8-10 sec w każdej pozycji stawu.
- Zmierz odpowiedź przy szybkim zwolnieniu napięcia. Ustaw preparat tak, aby haczyk przetwornika siły można było łatwo wypchnąć z otworu w daktylu.
- Zgnij staw tak, aby był w pełnym zgięciu (~90°). Teraz stymuluj nerw ruchowy z częstotliwością 100 Hz przy ciągłej stymulacji przez 5 sec.
- Po pierwszej sekundzie lub krócej, gdy w mięśniu otwierającym zbuduje się napięcie, wypchnij pin z otworu w daktylu.
- Zanalizuj zapis z nerwu napięcia przed i po zwolnieniu pinu trzymającego daktyla.
- Efekty modulacyjne substancji neuroaktywnych, takich jak oktopamina, serotonina i proktolina, które zmieniają aktywność neuronów napięcia, można określić, dodając te cząsteczki do medium kąpieli nad odsłoniętym mięśniem otwierającym i powtarzając eksperymenty.
- Użyj pipety i nanieś 1-2 ml kropli na preparat.
3. Barwienie struktur obwodowego układu nerwowego w odnóżach chodnych skorupiaków
- Technika z użyciem błękitu metylenowego
- Rozcieńczyć jedną część roztworu zapasu chlorku błękitu metylenowego (0,25%) dwiema częściami wody destylowanej.
- Dodać tę mieszaninę do pięciu części soli fizjologicznej z buforem. Dokładnie przemyć interesowany obszar.
- Przeprowadzić sekcję odnóża zgodnie z protokołem w sekcji 1. Inkubować preparat w roztworze błękitu metylenowego w temperaturze 12-13 °C.
- Oglądać preparat co 10-15 min pod mikroskopem stereoskopowym, używając oświetlenia o niskim natężeniu, aby śledzić postęp barwienia. W niektórych przypadkach barwienie zakończy się w ciągu godziny, w innych może potrwać całą noc.
- Technika 4-di-2-ASP
- Do wstecznego wypełniania neuronów PD lub bezpośredniego barwienia preparatu z kąpieli można użyć barwników fluorescencyjnych. Wymagany jest jednak odpowiedni mikroskop z możliwością obrazowania barwienia fluorescencyjnego.
- Przeprowadzić sekcję odnóża zgodnie z protokołem w sekcji 1.
- Inkubować preparat w roztworze 4-Di-2-ASP o stężeniu 10 µM i pozostawić w lodówce na 15 min. Użyć tylko takiej ilości roztworu, która przykryje preparat.
- Szybko sfotografować preparaty, unikając nadmiernej ekspozycji na światło rtęciowe. Ten barwnik fluorescencyjny stosunkowo szybko blaknie.
- Technika z użyciem chlorku kobaltu
- Odsłonić nerw PD zgodnie z protokołem w sekcji 1 i utrzymać go w zimnej soli fizjologicznej.
- Utworzyć wgłębienie z wazeliny, aby utrzymać CoCl2. Jeśli jakakolwiek ilość CoCl2 przedostanie się do kąpieli z soli fizjologicznej, cały preparat zabarwi się na czarno i należy go odrzucić.
- Wsunąć mały wycinek arkusza polistyrenowego, aby stworzyć plastikową platformę, i przymocować go szpilkami w taki sposób, aby nie pływał i nie został zanurzony w kąpieli z soli fizjologicznej (Rycina 7).
Rycina 7. Arkusz polistyrenowy z szpilkami do mocowania w naczyniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony obraz. - Wytłoczyć wazelinę z cienkiej igły hipodermycznej przymocowanej do jednorazowej strzykawki, a następnie stworzyć barierę (dobrze sprawdzi się kształt koła) o wysokości około 1-1,5 mm, z wyjątkiem płytkiego wcięcia w kształcie litery „V” w punkcie środkowym, przez który zostanie przeprowadzony nerw, na powierzchni wycinka polistyrenowego.
- Utworzyć małą kałużę soli fizjologicznej po obu stronach bariery w pobliżu wcięcia „V”. Uważając, aby nie rozciągać ani nie przyciąć nerwu, ostrożnie podnieść go z naczynia i umieścić w kałuży soli fizjologicznej w wgłębieniu z wazeliny.
- Pracować szybko, aby odcinek nerwu nie wyschł, a następnie ostrożnie nanieść wazelinę, aby przykryć odsłonięty nerw. Następnie przetestować szczelność bariery za pomocą soli fizjologicznej.
- Odsączyć sól fizjologiczną z wnętrza bariery i sprawdzić, czy nie wypełnia się ona, gdy poziom soli fizjologicznej w kąpieli wokół ściany z wazeliny jest wysoki, aby upewnić się, że obie strony są odizolowane od siebie (Rycina 8).
Rycina 8. Wgłębienie z wazeliny z solą fizjologiczną i nerwem PD rozciągniętym przez wgłębienie. Nerw PD nie został jeszcze przecięty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony obraz. - Usunąć sól fizjologiczną z wgłębienia za pomocą kawałka ręcznika papierowego. Unikać owijania nerwu papierem.
- Utworzyć nową kałużę, używając kilku małych kropel wody destylowanej, a następnie przeciąć koniec nerwu. Należy bardzo uważać, aby podczas cięcia nie pociągnąć nerwu przez barierę. Szok osmotyczny wywołany wodą destylowaną spowoduje „zbalonowanie” aksonów.
- W ciągu 30 s dodać małą kroplę CoCl2 do wody, wchłonąć ten roztwór, a następnie dodać wystarczającą ilość CoCl2, aby utworzyć kałużę nad tym skróconym odcinkiem nerwu (Rycina 9). Preparaty najlepiej przechowywać w lodówce w temperaturze 13 °C przez 12-24 h.
Rycina 9. Przecięty nerw PD eksponowany na CoCl2. Przecięty nerw pęcznieje w obecności wody, co ułatwia i przyspiesza przemieszczanie się cząsteczek barwnika przez aksony do ciał komórek neuronów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony obraz. - Usunąć nawilżające kałuże. Odsączyć roztwór kobaltu za pomocą chusteczki i wypłukać pozostałości kobaltu kilkukrotną wymianą soli fizjologicznej.
- Przenieść wyizolowany preparat do małej szklanej szalki Petriego zawierającej około 10 ml soli fizjologicznej dla kraba. Neurony są płukane, a kolejne kroki wykonuje się in situ. Po tym etapie do manipulowania preparatem nie należy używać wysokiej jakości narzędzi metalowych (należy użyć dedykowanych narzędzi, których nie będzie się później wykorzystywać do badań fizjologicznych).
- Dodać 1-2 krople siarczku amonu (NH4)2S do soli fizjologicznej. Szczelnie zakręcić butelkę z (NH4)2S i odstawić ją z powrotem do dygestorium. Obserwować reakcję w preparacie pod mikroskopem stereoskopowym.
- W ciągu 1-2 min powinny zacząć pojawiać się wypełnione kobaltem neurony i ich wypustki, ponieważ zabarwią się one na czarno.
- Po 5-10 min zastąpić roztwór wywoływujący świeżą solą fizjologiczną.
- Upewnić się, że po wylaniu roztworu wywoływującego do odpływu zlewozmywaka spłukać go bieżącą wodą z kranu przez kilka minut lub zebrać go do butelki na odpady z pokrywką.
- Odlać sól fizjologiczną i utrwalić preparat nerwu przez około 15 min, stosując dwukrotną wymianę utrwalacza Bouina. W przypadku większych tkanek, takich jak mięsień otwierający (do barwienia neuronów napięciowych), zwiększyć czas utrwalania do 30 min.
- Odwodnić w serii roztworów etanolu o rosnącym stężeniu, zaczynając od 70% (t.j. 70%, 80%, 90%, 100%). W przypadku małych tkanek wystarczające jest około 10 min przy każdym stężeniu.
- Po około 10-15 min w dwóch wymianach 100% etanolu, przejaśnić tkankę, zastępując etanol 100% salicylanem metylu. Preparat pozostanie w tym roztworze na stałe do wielokrotnej obserwacji. Z czasem wypełnione komórki staną się bardziej widoczne, ponieważ otaczająca je tkanka stanie się bardziej przejrzysta. Można zastosować metody intensyfikacji, aby zapobiec blaknięciu z biegiem czasu25.
- Zastosować ten sam proces, aby wypełnić nerw napięciowy CoCl2. Należy jednak kilkukrotnie wymieniać roztwór etanolu w każdym etapie odwadniania i inkubować preparat w alkoholu przez około 20 min w każdym kroku, aby dokładnie odwodnić mięśnie i umożliwić ich dobre przejaśnienie.
Wyniki
Kiedy organ PD jest rozciągany poprzez pełne wyprostowanie stawu, aktywność w nerwie PD jest silna podczas ruchu, co pokazano dla pierwszej sekundy na Ryc. 10. Część aktywności utrzymuje się, gdy organ pozostaje w bezruchu w pozycji otwartej. Aktywność ta pochodzi z neuronów wrażliwych na pozycję statyczną (druga połowa zapisu pokazana na Ryc. 10). Ruch wywołuje odpowiedź podczas przemieszczenia, a wyładowania występują głównie podczas rozciągania pasma chordotonalnego (Ryc. 11).
Dalszą analizę impulsów (spikes) można łatwo przeprowadzić poprzez sortowanie ich amplitud względnych. Jest to podejście pozwalające wykazać rekrutację różnych populacji neuronów sensorycznych w zależności od pozycji lub rodzaju ruchów5. Typowe amplitudy mieszczą się w zakresie 0,25-1,5 mV, jednak wartości te zależą od oporu (i.e. szczelności) uszczelnienia elektrody ssącej. Do celów analitycznych można również przedstawić graficznie częstotliwość występowania impulsów w różnych zakresach wielkości.
Siły generowane przez mięsień rozwierający w zależności od częstotliwości stymulacji można porównać poprzez nałożenie na siebie odpowiednich przebiegów napięcia w czasie (Rycina 13A oraz B). Można to przeprowadzić również dla każdej pozycji stawu przy każdej danej częstotliwości stymulacji. Aktywność nerwu napięciowego można następnie skorelować z ilością siły względnej generowanej przy każdej częstotliwości stymulacji i dla każdej pozycji stawu. Podobnie jak w przypadku nerwu PD, w odpowiedzi na skurcz mięśnia rozwierającego obserwuje się różne amplitudy impulsów (Rycina 13C).
Układ anatomiczny neuronów w nodze krocznej jest wyraźnie widoczny po barwieniu błękitem metylenowym (Rysunek 14). Należy zwrócić uwagę na elastyczną nić chordotonalną oraz neuron napięciowy znajdujący się blisko apodemy. Na tym rysunku widoczne są również liczne somata o różnych średnicach i specyficznym rozmieszczeniu. Cały przebieg nerwu napięciowego oraz nerwu ruchowego rozciągacza pokazano na Rysunku 15. Pojedyncze neurony nerwu PD przedstawiono z wyższym kontrastem przy użyciu technik wypełniania wstecznego 4-Di-2-ASP (Rysunek 16) oraz CoCl2 (Rysunek 17). Przy dużym powiększeniu widoczne są zakończenia sensoryczne wewnątrz wspierających skoliopaliów (Rysunki 16B)21,22,26.
Rycina 10. Ruch i utrzymanie pod kątem 0°. Neurony dynamiczne wykazują intensywne wyładowania podczas ruchu, natomiast w stanie utrzymania otwartego stawu obecne są impulsy z neuronów wrażliwych na stan statyczny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rycina 11. Szybkie otwarcie i zamknięcie z pozycji w pełni zgiętej do wyprostowanej (90-0°). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Rycina 12. Zarejestrowane potencjały działaniowe zewnątrzkomórkowe z nerwu PD. Staw jest całkowicie wyprostowany, następnie szybko przemieszczany do pozycji zgięcia o ½, a potem utrzymywany w bezruchu. Zwróć uwagę na aktywność podczas ruchu oraz zmniejszoną aktywność w stanie statycznym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rycina 13. Siły względne generowane przy pełnym zgięciu stawu i stymulacji przy różnych częstotliwościach. (A) Przedstawiono zapisy napięcie-czas z przetwornika siły dla każdej częstotliwości stymulacji. (B) Zapisy z panelu A zostały nałożone na siebie w różnych kolorach dla ułatwienia porównania. (C) Zapisy napięcie-czas aktywności elektrycznej rejestrowanej z nerwu napięciowego podczas stymulacji nerwu ruchowego z częstotliwością 80 Hz. Zwróć uwagę na regularny wzorzec artefaktów stymulacyjnych w porównaniu z aktywnością neuronalną. Zwróć również uwagę na różne amplitudy odpowiedzi neuronalnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Rycina 14. Barwienie błękitem metylenowym preparatu nogi kroczącej. Przedstawiono poszczególne somaty z ich zakończeniami sensorycznymi wnikającymi do nici elastycznej. W pobliżu apodemy pokazano neuron napięcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rycina 15. Nerw napięciowy wychodzący z końca dystalnego (czerwone strzałki) i łączący się z nerwem ruchowym (zielona strzałka). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rycina 16. (A) Wsteczna transplantacja barwnika 4-Di-2-ASP do nerwu PD u Cancer magister. (B) Powiększenie zakończeń sensorycznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Rysunek 17. Neurony wypełnione CoCl2 i przetworzone (A). Obrys śladu przedstawionego barwionego preparatu (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
| Sól fizjologiczna | g/L |
| NaCl | 27.29 |
| KCl | 0.81 |
| MgSO₄4•7H2O | 4.81 |
| CaCl₂2•2h2O | 1.85 |
| Na2SO4•10 h2O | 0.97 |
| Dekstroza (D-glukoza) | 1.982 |
| kwas HEPES | 0.476 |
| sól HEPES | 2.08 |
| Dostosować pH do wartości 8,1 za pomocą NaOH lub HCl |
Tabela 1. Składy soli fizjologicznej dla krabów.
Dyskusja
Celem tego zestawu eksperymentów jest: 1) nauczenie i pokazanie podstawowych zasad zewnątrzkomórkowych zapisów z identyfikowalnego narządu proprioceptywnego i nerwu napięciowego oraz 2) podkreślenie znaczenia mapowania anatomicznego w odniesieniu do fizjologicznych funkcji poszczególnych układów sensorycznych. To eksperymentalne podejście i wykorzystane modele zwierzęce są niedrogie i stosunkowo łatwe do przeprowadzenia w laboratoriach dydaktycznych neurofizjologii.
Neurony narządów strunowcowych należą do dwóch specyficznych typów funkcjonalnych, tych, które reagują na ruch i tych, które reagują na pozycje statyczne. Nagrania pojedynczych komórek z różnych narządów strunowcowych, bez względu na to, który staw jest badany, wykazały, że tak jest w przypadku3,5. Rzeczywiście, narządy strunowce związane ze stawami czułkowymi homarów ujawniają te same dwa typy czuciowe i podstawową anatomię27. Oprócz tego, że istnieją dwa typy neuronów (ruch i pozycja), neurony mają ten sam układ anatomiczny na odpowiednich pasmach elastycznych. Duże somaty znajdujące się proksymalnie na nici zwykle należą do neuronów wrażliwych na ruch dynamiczny. Neurony, które sygnalizują pozycje statyczne, mają małe somaty i są rozmieszczone dystalnie. Komórki te są aktywne tonicznie. Staw PD zawiera tylko jeden narząd strumykowy, podczas gdy w stawach nadgarstka-podudnia (CP) i merus-nadgarstka (MC) znajdują się dwa narządy naczyniówkowe.
Sekcja mająca na celu odsłonięcie struktur proprioceptywnych u niebieskich krabów (C. sapidus) w celu zapisu elektrofizjologicznego wymaga strategii, która umożliwia ruchy stawów w naturalnych pozycjach podczas rejestracji z neuronów czuciowych. Nerw napięciowy mięśnia otwierającego w nodze chodzącej jest bardzo cienkim nerwem zbudowanym z kilku neuronów. Jeśli nie zostanie zachowana ostrożność, nerw napięciowy, a także nerw ruchowy unerwiający mięsień, który ma być stymulowany, mogą zostać uszkodzone podczas tego rozwarstwienia. Aby uzyskać optymalne zapisy, elektrody ssące muszą być dostosowane do wielkości nerwu. Nagrania są łatwo dostępne w laboratorium studenckim przy użyciu mikroskopu preparacyjnego o powiększeniu 30-40X i niskiej klasy mikromanipulatorów.
Przyszłe eksperymenty, które byłyby interesujące do przeprowadzenia ze stawowymi narządami strunawkowymi, polegałyby na zbadaniu profili strukturalnych i fizjologicznych podczas regeneracji nóg u różnych gatunków na różnych etapach cyklu życia jako kontynuacja wstępnego badania, w którym wykorzystano magister Cancer19,26. Pytania, na które należy odpowiedzieć, to: 1) czy rozmieszczenie i organizacja zregenerowanych neuronów zależy od wieku zwierzęcia podczas regeneracji kończyny, 2) czy wypustki aksonalne do OUN (brzusznego rdzenia nerwowego) w regenerującej się kończynie są funkcjonalne, czy też potrzeba czasu i wspólnego użytkowania, aby ustanowić funkcjonalne połączenia, oraz 3) co dzieje się z odciętymi aksonami proksymalnie płaszczyzny autotomii, gdy kończyna jest autotomizowana? 28
Skorupiaki dostosowują się do warunków środowiskowych i temperatury otoczenia, ale nie jest jasne, w jaki sposób utrzymują koordynację w obwodzie neuronalnym, ponieważ neurony zmieniają swoją aktywność w odpowiedzi na zmiany temperatury. Powolne tempo zmian może dać zwierzęciu trochę czasu na aklimatyzację, podczas gdy szybka zmiana może nie29,30. Fizjologiczne zmiany pH lub osmolarności spowodowane metabolizmem, zachowaniem lub wpływem środowiska mogą stanowić podobne wyzwanie dla obwodów nerwowych zaangażowanych w propriocepcję. Te preparaty ze skorupiaków są idealne do rozwiązywania tego typu problemów, ponieważ ich funkcja jest dobrze scharakteryzowana na poziomie pojedynczej komórki.
W tym protokole wykazaliśmy fizjologiczne znaczenie neuronów napięciowych w monitorowaniu siły generowanej przez mięsień otwierający. Te receptory napięcia można prześledzić do ich lokalizacji w apodemie za pomocą procedur barwienia. Neurony te, podobnie jak u ssaków, wykrywają siłę na różnych poziomach i rekrutują dodatkowe neurony wraz ze wzrostem siły. Częstotliwość aktywności jest związana z częstotliwością stymulacji neuronu ruchowego aż do osiągnięcia nasycenia w odbiorze. Stosując protokół szybkiego uwalniania ze zgiętym stawem daktylowym, aktywność napięciowa szybko znika, ale następnie powraca po odzyskaniu napięcia w całkowicie rozciągniętym stawie. Jest to klasyczna procedura eksperymentalna mająca na celu zilustrowanie siły mierzonej przez receptory napięcia. Do preparatu można zastosować różne neuromodulatory, aby zobaczyć, jak wpływa on na rozwój siły i odpowiedź neuronalną. Jednym z ważnych aspektów jest to, w jaki sposób odpowiedzi neuronalne są przetwarzane i integrowane w ośrodkowym układzie nerwowym oraz ich wpływ na aktywność neuronów ruchowych. Techniki, które pokazaliśmy, pozwalają zacząć zajmować się większą ilością informacji na temat funkcji obwodu nerwowo-ruchowego napięcia (czuciowego), tj. sygnału w nienaruszonej nodze do zwoju i z powrotem do mięśnia.
Zademonstrowane procedury barwienia są kluczem do zrozumienia fizjologii neuronów czuciowych, które unerwiają narządy proprioceptywne. Anatomiczny układ neuronów oparty na funkcji i wielkości somy jest podobny w różnych narządach strunowych w nogach kraba. Nie wiadomo, czy podobne układy neuronalne występują również u innych gatunków skorupiaków lub owadów. Łączenie zapisów fizjologicznych z pojedynczych komórek i mapowanie lokalizacji pozwala na bezpośrednie relacje między funkcjami struktury. Długotrwałe zachowanie układu anatomicznego dzięki barwieniu i utrwalaniu CoCl2 pozwala na powtarzalne wykonywanie pomiarów i ocenę układu strukturalnego.
Propriocepcja i odbiór napięcia mięśni szkieletowych to modalności sensoryczne, które umożliwiają skoordynowane zachowania i reakcje na środowisko zewnętrzne i wewnętrzne dla zwierząt przegubowych w różnych konfiguracjach mięśni szkieletowych. Narząd receptora mięśniowego w jamie brzusznej raka jest kolejnym dobrze udokumentowanym preparatem (patrz Projekt Crawdad; http://www.crawdad.cornell.edu/) Do celów dydaktycznych propriocepcji z tylko dwoma neuronami na półsegment brzuszny23. Możliwość nagrywania od pojedynczych neuronów do wiązek nerwów czuciowych dostarcza dalszych szczegółów, które pomagają w zrozumieniu podstawowych zasad odbioru sensorycznego. Te stosunkowo proste preparaty ze skorupiaków pozwalają zająć się podstawowymi aspektami propriocepcji i monitorowania napięcia, z potencjałem do określenia obwodów neuronalnych, które umożliwiają centralną integrację proprioceptywnych i innych bodźców sensorycznych9-12, 32, 33.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni za artystyczny wkład Hyewona Coopera.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sylgard | Dow Corning | 182 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| HEPES acid | Sigma | 3375 | Wolny kwas, krystaliczna |
| zasada HEPES | Sigma | ||
| D-Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4• 7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4• 10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin' s utrwalacz roztworu | Sigma | HT10-1-32 | Uwaga: Materiał niebezpieczny (wymagany specjalny koszt wysyłki) |
| CoCl2 | Sigma | Uwaga: Materiał niebezpieczny. Prosimy o przestrzeganie prawidłowej utylizacji zgodnie z lokalnymi i federalnymi przepisami. | |
| Chlorek błękitu metylenowego | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, CI 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Sondy molekularne | Jodek 4-(4-dietyloaminostyryl)-N-metylopirydyniowy | |
| Wybielacz | Sigma-Aldrich | Do chlorku srebra | |
| drut NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | Do regulacji pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | Do regulacji pH |
| Materiały | |||
| Narzędzia preparacyjne | Świat Asortyment instrumentów | precyzyjnych | |
| Wewnątrzkomórkowa sonda elektrodowa | |||
| Klatka | |||
| Szpilki do owadów | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Mikroskop preparacyjny (100X) | |||
| Lampa | |||
| Małe regulowane lustro | Do kierowania wiązki światła w kierunku preparatu. | ||
| Elektrody szklane | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Pudełko 200 sztuk, elektrody ssące |
| Mikromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Może przymocować do podstawy lub na metalowym pręcie |
| Podniesiony stojak | |||
| Srebrny drut (10/1,000 cala) | A-M Systems | 782500 | |
| Komputer | Dowolna firma | ||
| Wzmacniacz różnicowy AC/DC | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Przetwornik siły | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Stopień główny | AD Instruments | W zestawie wzmacniacz AC/DC | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Przewody elektryczne | Dowolna firma | ||
| Narzędzia szklane | Zrób siebie | Do manipulowania nerwami | |
| i złącza | Dowolna firma | ||
| Pipety z żarówkami | Fisher Scientific | 13-711-7 | Pudełko 500 |
| zlewek | Dowolna firma | ||
| Wosk lub plastelina | Dowolna firma lub lokalne sklepy | ||
| Stymulator | Grass Instruments | SD9 lub S88 | |
| Plastikowa końcówka do elektrody ssącej | Lokalny sklep z narzędziami (Watt' s marka) | i frac14; cal OD x 0,170 cala ID | Pokrój na małe kawałki. Wyciągnij nad płomieniem i przytnij końcówkę do odpowiedniego rozmiaru |
Bibliografia
- Whitear, M. Chordotonal organs in Crustacea. Nature. 187, 522-523 (1038).
- Alexandrowicz, J. S. The comparative anatomy of leg propriocetors in some decapod Crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 52 (3), 605-634 (1972).
- Hartman, H. B., Boettiger, E. G. The functional organization of the propys-dactylus organ in Cancer irroratus Say. Comp. Biochem. Physiol. 22, 651-663 (1967).
- Cooper, R. L., Hartman, H. B. Responses of the bender apodeme tension receptors in the Dungeness crab, Cancer magister. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 109 (2), 479-486 (1994).
- Cooper, R. L. Mapping proprioceptive neurons on chordotonal organs in the crab, Cancer magister. Crustaceana. 81 (4), 447-475 (2008).
- Burke, W. An organ for proprioception and vibration sense in Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 31, 127-138 (1953).
- Hill, A. V. First and Last Experiments in Muscle Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, U.K. (1970).
- Stuart, D. G., Mosher, C. C., Gerlach, R. L., Reinking, R. M. Mechanical arrangement and transducing properties of Golgi tendon organs. Exp. Brain Res. 14 (3), 274-292 (1972).
- Macmillan, D. L., Dando, M. R. Tension receptors on the apodemes of muscles in the walking legs of the crab, Cancer magister. Mar. Behav. Physiol. 1 (1-4), 185-208 (1972).
- Bévengut, M., Simmers, A. J., Clarac, F. Central neuronal projections and neuromuscular organization of the basal region of the shore crab leg. J. Comp. Neurol. 221 (2), 185-198 (1983).
- El Manira, A., Cattaert, D., Clarac, F. Monosynaptic connections mediate resistance reflex in crayfish (Procambarus clarkii) legs. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 337-349 (1991).
- Le Bon-Jego, M., Cattaert, D. Inhibitory component of the resistance reflex in the locomotor network of the crayfish. J. Neurophysiol. 88 (5), 2575-2588 (2002).
- Ray, D. L., Clarac, F., Cattaert, D. Functional analysis of the sensory motor pathway of resistance reflex in crayfish. I. Multisensory coding and motor neuron monosynaptic responses. J. Neurophysiol. 78 (6), 3133-3143 (1997).
- Wiersma, C. A. G. Vergleichende Untersuchungenüber das periphere Nerve-muskelsystem von Crustaceen (Comparative studies on the peripheral nerve-muscle system of crustaceans). J. Comp. Physiol. 19, 349-385 (1933).
- Wiersma, C. A. G. Movement receptors in decapod crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 38 (01), 01-143 (1959).
- Hartman, H. B. Tension receptors on the closer muscle apodeme in the walking legs of the blue crab Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 157 (3), 355-362 (1985).
- Holsinger, R. The effect of regional phenotypic differences of Procambarus clarkii opener muscle on sarcomere length, fiber diameter, and force development MSc thesis [dissertation]. , University of Kentucky. (2013).
- Parsons, D. W. The morphology and ultrastructure of tension receptors in the walking legs of the crab, Carcinus maenas. Cell Tissue Res. 211 (1), 139-149 (1980).
- Parsons, D. W. Responses and central interactions of tension receptors in the leg muscle of Carcinus. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 72 (2), 391-399 (1982).
- Tryba, A. K., Hartman, H. B. Dynamic responses of series force receptors innervating the opener muscle apodeme in the blue crab, Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 180 (3), 215-221 (1997).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. I. The chordotonal organs in the legs of the shore crab, Carcinus meanas. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 245 (725), 291-325 (1962).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. II. The thoracico-coxal organs in Carcinus, Pagurus and Astacus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 248 (752), 437-456 (1965).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323(2010).
- Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322(2011).
- Delaney, K., Gelperin, A. Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limaxmaximus; I. Anatomy and criteria for re-identification. J. Comp. Physiol. A. 166, 297-310 (1990).
- Hartman, H. B., Cooper, R. L. Regeneration and molting effects on a proprioceptor organ in the Dungeness crab, Cancer magister. J. Neurobiol. 25 (5), 461-471 (1994).
- Hartman, H. B., Austin, W. D. Proprioceptor organs in the antennae of Decapoda Crustacea. J. Comp. Physiol. 81 (2), 187-202 (1972).
- Cooper, R. L. Development of sensory processes during limb regeneration in adult crayfish. J. Exp. Biol. 201 (Pt 11), 1745-1752 (1998).
- Chung, Y. -S., Cooper, R. M., Graff, J., Cooper, R. L. The acute and chronic effect of low temperature on survival, heart rate and neural function in crayfish (Procambarus clarkii) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) species. Open J. Mol. Int. Physiol. 2 (3), 75-86 (2012).
- Blundon, J. A. Effects of temperature and thermal history on neuromuscular properties of two crustacean species. J. Comp. Physiol. B. 158 (6), 689-696 (1989).
- Cooper, R. M., Schapker, H., Adami, H., Cooper, R. L. Heart and ventilatory measures in crayfish during copulation. Open J. Mol. Int. Physiol. 1 (3), 36-42 (2011).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The mechanistic action of carbon dioxide on a neural circuit and NMJ communication. Journal of Experimental Zoology. , (2013).
- Bierbower, S. M., Shuranova, Z. P., Viele, K., Cooper, R. L. Sensory systems and environmental change on behavior during social interactions. Brain Behav. 3 (1), 4-13 (2013).
Przedruki i uprawnienia
