Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Odkrycie nowych patogenów wewnątrzkomórkowych za pomocą kokultury amebalnej i metod wzbogacania amebalu

14.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51055

⸱

27 października 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

W tym artykule

Podsumowanie

Kokultura amemalu to system hodowli komórkowej wykorzystujący przylegające ameby do selektywnego wzrostu wewnątrzkomórkowych patogenów, które są odporne na komórki fagocytarne, takie jak ameby i makrofagi. Stanowi zatem kluczowe narzędzie do odkrywania nowych czynników zakaźnych. Wzbogacenie amebalu pozwala na odkrycie nowych gatunków ameb i ich specyficznych bakterii wewnątrzkomórkowych.

Streszczenie

Patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak legionella, prątki i organizmy podobne do Chlamydii, są trudne do wyizolowania, ponieważ często rosną słabo lub wcale na selektywnych podłożach, które zwykle są używane do hodowli bakterii. Z tego powodu wiele z tych patogenów odkryto dopiero niedawno lub po ważnych epidemiach. Te patogeny są często związane z amebami, które służą jako komórka gospodarza i umożliwiają przetrwanie i wzrost bakterii. Zamierzamy tutaj przedstawić demonstrację dwóch technik, które umożliwiają izolację i charakterystykę wewnątrzkomórkowych patogenów obecnych w próbkach klinicznych lub środowiskowych: kokulturę amebalną i wzbogacanie ameb. Kokultura amebalu umożliwia odtworzenie bakterii wewnątrzkomórkowych poprzez zaszczepienie badanej próbki na trawniku amebalnym, który może zostać zakażony i poddany lizie przez bakterie wewnątrzkomórkowe obecne w próbce. Wzbogacenie amebalu umożliwia odzyskanie ameb obecnych w próbce klinicznej lub środowiskowej. Może to prowadzić do odkrycia nowych gatunków ameb, ale także nowych bakterii wewnątrzkomórkowych rosnących specyficznie w tych amebach. Razem te dwie techniki pomagają odkryć nowe bakterie wewnątrzkomórkowe zdolne do wzrostu w amebach. Ze względu na ich zdolność do infekowania ameb i opierania się fagocytozie, te wewnątrzkomórkowe bakterie mogą również unikać fagocytozy przez makrofagi, a tym samym być chorobotwórcze dla wyższych eukariontów.

Wprowadzenie

Przed nadejściem diagnostyki molekularnej, mikroorganizmy obecne w niszach środowiskowych lub w próbkach klinicznych były często wykrywane poprzez hodowlę ich na różnych selektywnych podłożach, głównie na agarze na szalkach Petriego. Fenotyp kolonii bakteryjnych i ich aktywność metaboliczna pozwoliły na klasyfikację bakterii na poziomie gatunku. Rosół może być również stosowany w celu zwiększenia czułości wykrywania. Jednak obie techniki nie pozwalają na odzyskanie bakterii, które rosną powoli lub wcale nie rosną na tych podłożach. To jest powód, dla którego podejścia molekularne są obecnie tak szeroko stosowane. Niemniej jednak wykrycie DNA nie daje żadnych wskazówek na temat żywotności bakterii. Co więcej, w przeciwieństwie do hodowli, podejścia molekularne nie prowadzą do powstania szczepu, który można by dokładniej scharakteryzować.

Badanie patogenów, które słabo rosną na stałych podłożach lub które potrzebują komórek do wzrostu, jest skomplikowane. Większość z tych "trudnych do wyhodowania" bakterii to wybredne bakterie wewnątrzkomórkowe, często odkrywane i charakteryzowane po dużych ogniskach choroby, jak to miało miejsce w przypadku Legionella pneumophila. Bakteria ta została scharakteryzowana po wybuchu epidemii, która miała miejsce podczas konwencji Legionu Amerykańskiego. Aż 182 osoby zostały zakażone, a 29 zmarło z powodu ciężkiego zapalenia płuc1,2. Później wykazano, że ameby były naturalnymi żywicielami tej bakterii i że ich obecność w hotelowym systemie klimatyzacji i sieciach wodnych była przyczyną wybuchu tak zwanej choroby legionistów3.

Ameby są obecne na całym świecie i zostały wyizolowane z gleby, powietrza, wody i błony śluzowej nosa ludzkich ochotników (sprawdzone w 4). Te "wolno żyjące" ameby na ogół dzielą się autonomicznie w środowisku, ale od czasu do czasu mogą atakować pobłażliwych gospodarzy5. Ameby żywią się różnymi mikroorganizmami poprzez fagocytozę, a następnie trawienie lizosomalne przez hydrolazy6. Wiele fakultatywnych lub obligatoryjnych bakterii wewnątrzkomórkowych jest w stanie oprzeć się trawieniu, a tym samym infekować i dzielić się w amebach, jak na przykład Legionella, bakterie związane z Chlamydią lub prątki (omówione w 7 i 8). Wolno żyjące ameby prawdopodobnie stanowią ważny potencjalny rezerwuar dla bakterii wewnątrzkomórkowych, które nie zostały jeszcze odkryte. To skłoniło naszą grupę do wdrożenia w Lozannie dwóch głównych technik, zwanych kokulturą amebalną i wzbogacaniem ameb, które pozwoliły różnym grupom wyizolować kilka nowych obligatoryjnych mikroorganizmów wewnątrzkomórkowych z różnych próbek środowiskowych9-15.

Ponieważ ameby są profesjonalnymi fagocytami żywiącymi się na bakteriach, bakteria zdolna do opierania się fagocytozie i wzrostu wewnątrz tych protistów może również kolonizować ludzkie fagocyty i być patogenna dla ludzi. Zostało to częściowo wykazane w przypadku niektórych bakterii związanych z Chlamydią, takich jak Waddlia chondrophila. W. chondrophila może rosnąć nie tylko w amebach, ale także w kilku typach komórek, takich jak komórki nabłonkowe ssaków, makrofagi i linie komórkowe ryb16-18. Kokultura amebów wydaje się również istotna dla wykrywania bakterii wewnątrzkomórkowych w próbkach klinicznych19,20, w tym w stolcu, który jest silnie zanieczyszczony różnymi gatunkami bakterii21.

Tutaj opisujemy główne etapy kokultury amebal i wzbogacania amebalu, w tym (a) obróbkę próbek środowiskowych lub klinicznych; b) wzrost ameb na podłożu aksenicznym i na trawniku bakteryjnym Escherichia coli oraz c) selekcja i charakterystyka bakterii wewnątrzkomórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Kokultura amebalna

1.1 Przygotowanie próbki

  1. Próbka środowiskowa
    1. Próbki wody
      Przefiltrować próbkę wody (od 500 ml do 1 l) przez membranę o wielkości porów 0,22 μm. Następnie wstrząśnij błoną w pożywce PAS z soli amebowej Page'a (120 mg NaCl, 4 mg MgSO4•7H2O, 4 mg CaCl2•2H2O, 142 mg Na2HPO4 i 136 mg KH2PO4 w 1 l wody destylowanej).
    2. Próbki stałe
      Próbki stałe, takie jak próbki gleby lub piasku oraz próbki półstałe, takie jak osad czynny, należy zawiesić w wodzie destylowanej lub PBS i przefiltrować je przez membranę o wielkości porów 0,22 μm. Następnie wstrząśnij membraną w PAS.
    3. Próbki silnie zanieczyszczone endogennymi amebami i pierwotniakami
      Najpierw należy osadzać próbki przez wirowanie z niską prędkością (180 x g) przez 10 minut lub przefiltrować je przez membranę o wielkości porów 5 μm. Dalsze przetwarzanie supernatantu (odpowiednio filtratu), jak w 1.1.1.
      Uwaga: W celu dalszej dekontaminacji próbek środowiskowych można zastosować inne techniki odkażania: Podgrzewać próbkę w temperaturze 50 °C przez 30 minut lub traktować roztworami kwaśnymi lub zasadowymi14.
  2. Próbka kliniczna
    Przetwarzaj próbki kliniczne w zależności od ich właściwości fizykochemicznych. Filtruj lub odwiruj ciecze, aby usunąć duże zanieczyszczenia. Zawiesić próbki stałe. Aby użyć tkanek, zmiel je, na przykład za pomocą homogenizatora lub szklanych kulek, i zliza komórek, aby uwolnić bakterie wewnątrzkomórkowe.

1.2 Przygotowanie ameb

  1. Przygotowanie bulionu
    Przygotować następujące podłoża: bogate podłoże zawierające pepton, ekstrakt drożdżowy i glukozę (PYG; 100 g peptonu proteozy, 10 g ekstraktu drożdżowego, 4,9 g MgSO4•7H2O, 5 g cytrynianu sodu•2H2O, 0,1 g Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O, 1,7 g KH2PO4, 1,97 g Na2HPO4•7H2O, 45 g glukozy i 0,295 g CaCl2 w 5 l wody destylowanej) oraz pożywka nieodżywcza, taka jak PAS dla gatunków Acanthamoeba.
  2. Kultura amebala
    1. Hodować ameby (preferencyjnie Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 lub A. polyphaga Linc-Ap1) w temperaturze 25 °C w kolbach do hodowli komórkowych zawierających 30 ml pożywki PYG.
    2. Zebrać ameby przez energiczne potrząsanie kolby i odwirować zawiesinę komórek przez 10 minut przy 1 500 x g. Przemyć osad dwukrotnie pożywką PAS. Policz komórki na szkiełku Kova i dostosuj objętość, aby uzyskać zawiesinę 5 x 105 komórek na ml.
    3. Przenieść zawiesinę amebalną do mikropłytek. Stosować 1 ml na dołek w przypadku płytek 12- i 24-dołkowych, 500 μl w przypadku płytek 48-dołkowych i 300 μl w przypadku płytek 96-dołkowych. Inkubować mikropłytkę przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 25 °C. Pozwala to na sedymentację i przyczepienie ameb do dna każdej studzienki.

1.3 Kultura

  1. Zaszczepianie próbki
    1. Zaszczepić płytkę z 2.3.3 seryjnymi rozcieńczeniami próbki z 1.1 lub 1.2, zwykle serią 10-krotnych rozcieńczeń, zaczynając od 100 μl nierozcieńczonej próbki.
    2. Odwirować mikropłytkę o masie 1 800 x g przez 10 minut, aby na trawniku amebalnym osadzały się mikroorganizmy potencjalnie obecne w próbce. Zwiększa to kontakt i fagocytozę mikroorganizmów przez ameby.
    3. Inkubować płytki przez 45 minut w temperaturze 25 °C i przemyć trzykrotnie PAS poprzez zastąpienie pożywki świeżym PAS. Dodać 1 ml do studzienki PAS z dodatkiem lub bez dodatku antybiotyków (streptomycyny, penicyliny, gentamycyny i/lub wankomycyny), w zależności od poszukiwanych gatunków bakterii.
    4. Inkubować mikropłytkę w temperaturze 32 °C w wilgotnej atmosferze, aby uniknąć otorbienia się ameb. Obserwuj każdą studzienkę codziennie z 20-krotnym obiektywem, aby wykryć obecność bakterii atakujących i lizujących ameby.
    5. W przypadku lizy należy przeprowadzić subkulturę na świeżych amebach, zaszczepiając 100 μl kokultur do monowarstwy około 105 ameb/cm2. Aby specyficznie wyizolować dany gatunek bakterii, należy zaszczepić również specyficzne podłoża agarowe przeznaczone dla tych bakterii (np. agar BCYE dla Legionella spp.).
    6. W przypadku braku lizy należy pobrać 100 μl kokultur cztery do siedmiu dni po pierwszym zaszczepieniu i zaszczepić świeżą kulturę amebalną o objętości 900 μl na 24-dołkowej płytce. Jeśli obserwuje się szybką lizę ameb bez namnażania się bakterii, może to oznaczać, że wirus jest obecny. W takim przypadku przefiltrować supernatant na 0,22 μm i użyć przefiltrowanej zawiesiny do zakażenia świeżych ameb.

1.4 Izolacja i charakterystyka bakterii

  1. Barwienie bakteryjne
    Przeprowadzaj kohodowle bezpośrednio na szklanych szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowych mikropłytkach. Usuń pożywkę i wykonaj barwienie lub immunofluorescencję.
    1. Zmodyfikowane barwienie Romanowsky'ego
      1. Pozostaw szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia. Zanurzyć szkiełko nakrywkowe pięć razy w roztworze utrwalającym (2 mg/l Fast Green w metanolu).
      2. Zanurzyć szkiełko nakrywkowe pięć razy w roztworze barwiącym I (1,22 g/l eozyny G w buforze fosforanowym o pH 6,6)
      3. Na koniec zanurzyć szkiełko nakrywkowe 5 razy w roztworze barwiącym II (1,1 g/l tiazyny w buforze fosforanowym o pH 6,6).
      4. Przepłukać próbkę wodą destylowaną. Pozostawić do wyschnięcia i obserwować pod mikroskopem.
    2. Barwienie Ziehl-Neelsen
      1. Pozostaw szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia. Przykryj próbkę fuksyną Ziehl. Podgrzej barwnik płomieniem, aż pojawią się opary.
      2. Schłodzić w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 minut i spłukać wodą destylowaną. Przykryj próbkę 3% roztworem kwasu solnego w izopropanolu na 2 minuty i spłucz wodą destylowaną.
      3. Przykryj na 30 sekund błękitem metylenowym i spłucz wodą destylowaną. Pozostawić do wyschnięcia i obserwować pod mikroskopem22.
    3. Barwienie Gimeneza
      1. Przygotować zasadowy roztwór podstawowy fuksyny, mieszając 100 ml 10% zasadowej fuksyny (10 g zasadowej fuksyny w 100 ml 95% etanolu), 250 ml 4% wodnego fenolu i 650 ml wody destylowanej. Przed użyciem inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
      2. Pozostaw szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia i utrwal, przepuszczając je przez płomień. Przykryć próbkę świeżo przefiltrowaną zasadową fuksyną (4 ml zasadowego roztworu podstawowego fuksyny w 10 ml 0,1 M buforu fosforanu sodu o pH 7,45) przez 2 minuty.
      3. Przepłukać próbkę wodą i inkubować w zieleni malachitowej (0,8% w wodzie destylowanej) przez 10 sekund. Ponownie spłukać wodą i powtórzyć barwienie zielenią malachitową. Ponownie spłucz wodą. Pozostaw szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia, zamontuj je i obserwuj pod mikroskopem23.
    4. Immunofluorescencji
      1. Utrwalić szkiełko nakrywkowe, inkubując w metanolu przez 5 minut lub z paraformaldehydem 4% przez 10 minut.
      2. Przemyć trzykrotnie PBS i inkubować przez 2 godziny w roztworze blokującym (5% BSA, 0,1% saponina w PBS) w temperaturze pokojowej.
      3. Szkiełko nakrywkowe inkubować przez 1 godzinę w roztworze blokującym zawierającym przeciwciała wywołane przeciwko badanemu mikroorganizmowi.
      4. Przemyć ponownie trzy razy w PBS i inkubować przez 1 godzinę z przeciwciałem drugorzędowym skierowanym przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu i połączonym z fluoroforem. Przemyć trzykrotnie PBS, założyć szkiełko nakrywkowe i obserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  2. Wykrywanie DNA metodą PCR
    Ekstrakcja DNA ze 100 do 200 μl kokultury amuli. Wykrywanie mikroorganizmów za pomocą uniwersalnych starterów ukierunkowanych na gen 16S rRNA lub specyficznych starterów dla gatunków będących przedmiotem zainteresowania, takich jak prątki 24, legionella25 lub członkowie Chlamydiales26.

2. Wzbogacenie amebalu

2.1. Przygotowanie próbki

Ponownie zawiesić próbki stałe i półstałe w PAS poprzez wirowanie. Odwirować zawiesinę przy niskiej prędkości (180 x g) przez 10 min. Pozwala to na wzbogacenie wolno żyjących ameb w wypluwce. Supernatant może być stosowany do kokultury amebalu, a osad do wzbogacania amebalu21.

2.2. Przygotowanie podłoża

  1. Dodać 1,5 g agaru do 100 ml PAS i sterylizować pożywkę w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C. Wlać ciepłą pożywkę na szalki Petriego i pozostawić do zestalenia w temperaturze pokojowej.
  2. Hodować Escherichia coli (ATCC 25922) w bulionie LB lub tioglikolanowym przez noc w temperaturze 37 °C. Bakterie należy dwukrotnie przemyć PBS i ponownie zawiesić w pożywce PAS. Rozcieńczyć 10x w PAS i rozprowadzić 2-3 ml tego rozcieńczenia na płytce agarowej PAS i pozostawić do wyschnięcia.

2.3. Inokulacja próbki

Dodaj kroplę próbki (lub kawałek filtra) po jednej stronie płytki i pozwól jej przepłynąć przez szalkę Petriego, tworząc linię w środku szalki.

2.4. Wzrost amebów i subkultura amebów

  1. Obserwuj szalkę Petriego codziennie. Jeśli zostanie wykryty front migracji amebalu, wytnij mały kawałek agaru na froncie migracji i zaszczep świeżą szalkę Petriego NNA pokrytą trawnikiem E. coli.
  2. Powtórzyć reinokulację kilka razy w zależności od czystości próbki, w celu uzyskania czystej kultury danego szczepu amebalu.

2.5. Charakterystyka ameb i bakterii

  1. Zeskrob ogniwa i ponownie je zawieś w PAS.
  2. Wyodrębnij DNA i określ tożsamość ameb i/lub endosymbiontów bakteryjnych za pomocą PCR i sekwencjonowania (na przykład amplifikacja 16S rRNA dla bakterii, lub 18S rRNA dla ameb i sekwencjonowanie).
  3. Użyj tych zeskrobanych komórek w PAS do zaszczepienia świeżych ameb i przeprowadź kokulturę amebalną w celu wykrycia bakterii, które mogą być obecne w próbce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dzięki zastosowaniu kokultury z amebami oraz wzbogacania metodą amebową odkryto szeroki zakres bakterii środowiskowych i/lub patogennych (Tabela 1).

Kultury współżyjące z amebami były wykorzystywane przez naszą grupę oraz inne zespoły do analizy próbek środowiskowych, oczyszczalni ścieków i systemów dystrybucji wody. Za pomocą tej techniki można wyizolować szerokie spektrum mikroorganizmów. Najczęstszymi bakteriami izolowanymi w kulturach współżyjących z amebami są przedstawic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kokultura amebala i wzbogacanie amebali to skuteczne metody, które pozwoliły na wyizolowanie wielu nowych gatunków bakterii i amebali. Wyniki uzyskane tymi metodami potwierdzają wszechobecną obecność zarówno ameb, jak i bakterii opornych na ameby w środowisku, a co najciekawsze, w sztucznych sieciach wodnych, które uważa się za kontrolowane przez zabiegi chemiczne, takie jak chlorowanie i ozonowanie. Kokultura amebala i wzbogacanie amebali są niezbędnymi narzędziami do izolowania i hodowli tych potencjalnie chorobotwórcz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Pr. Bernardowi La Scola za pomocne porady techniczne i interesującą dyskusję na temat kokultury amebal i wzbogacania ameb. Dziękujemy również dr Vincentowi Thomasowi za pomoc we wdrożeniu tej techniki w naszym laboratorium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Glukoza jednowodnaMerck, Darmstadt, Niemcy108342
0,22 μ m membrana wielkości porówMerck Millipore, Darmstadt, NiemcySCVPU11RE
pepton proteozyBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ211693
ekstrakt drożdżowyBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ212750
Kolby do hodowli komórkowychBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ353135
Zjeżdżalnia KovaHycor, Indianapolis, IN87144
mikropłytki do hodowli komórkowychCorning Inc, Corning, NY3524
Zestaw do barwienia Diff-QuikSiemens Healthcare diagn., Monachium, Niemcy130832
Ziehl fuchsinFluka, St-Louis, MI21820
basic fuchsinSigma, St-Louis, MI857843
PhenolSigma, St-Louis, MIP1037i mutagenny
zielony szczawian malachituFluka, St-Louis, MI63160
Paraformaldehyd 16% roztwórMikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA15710
SaponinSigma, St-Louis, MI84510

Bibliografia

  1. Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  2. McDade, J. E., et al. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
  3. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  4. Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
  5. Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
  6. Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
  7. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
  8. Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
  9. Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
  10. Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
  11. Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
  12. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
  13. Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
  14. Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
  15. Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
  16. Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
  17. Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
  18. Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
  19. Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
  20. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
  21. Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
  22. Isenberg, H. D. Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
  23. Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
  24. Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
  25. Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
  26. Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
  27. Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
  28. Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
  29. La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
  30. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
  31. La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
  32. Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
  33. Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
  34. La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033(2003).
  35. Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
  36. Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
  37. Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
  38. Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
  39. Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
  40. Lienard, J. G. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. Ashbolt, K., Sen, N. J. , Caister Academic Press. 143-162 (2011).
  41. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
  42. Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

dywan amebrozcieńczanie seryjnemikroskopia fluorescencyjnasekwencjonowanie genomumikroskopia elektronowabarwienie immunofluorescencyjneagar beznutrycyjny
Odkrycie nowych patogenów wewnątrzkomórkowych za pomocą kokultury amebalnej i metod wzbogacania amebalu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.