Protokół odpowiedzi na wydłużenie trąby do badania plastyczności behawioralnej u owadów: zastosowanie do badań podstawowych, biomedycznych i rolniczych

Podsumowanie

Protokół warunkowania Proboscis Extension Response (PER), opracowany dla pszczół miodnych (Apis mellifera), dostarcza ekologicznie istotnych i łatwo mierzalnych środków do badania kilku różnych mechanizmów uczenia się u wielu gatunków owadów.

Streszczenie

Owady modyfikują swoje reakcje na bodźce poprzez doświadczenie kojarzenia tych bodźców z wydarzeniami ważnymi dla przetrwania (np. jedzenie, partnerzy, zagrożenia). Istnieje kilka mechanizmów behawioralnych, dzięki którym owad uczy się istotnych skojarzeń i wiąże je z tymi wydarzeniami. Ważne jest, aby zrozumieć tę plastyczność behawioralną dla programów mających na celu pomoc owadom, które są korzystne dla rolnictwa. Wiedza ta może być również wykorzystana do odkrywania rozwiązań problemów biomedycznych i rolniczych tworzonych przez owady, które działają jako wektory chorób i szkodniki. Protokół kondycjonowania Proboscis Extension Response (PER) został opracowany dla pszczół miodnych (Apis mellifera) ponad 50 lat temu w celu zbadania, w jaki sposób postrzegają i uczą się o zapachach kwiatowych, które sygnalizują zasoby nektaru i pyłku, których kolonia potrzebuje do przetrwania. Procedura PER zapewnia solidne i łatwe do zastosowania ramy do badania kilku różnych ekologicznie istotnych mechanizmów plastyczności behawioralnej. Można go łatwo przystosować do użytku z kilkoma innymi gatunkami owadów i innymi odruchami behawioralnymi. Protokoły te mogą być łatwo stosowane w połączeniu z różnymi środkami do monitorowania aktywności neuronalnej w OUN za pomocą elektrofizjologii lub bioobrazowania lub do manipulowania docelowymi szlakami neuromodulacyjnymi. Jest to solidny test do szybkiego wykrywania subletalnych skutków dla zachowania spowodowanych stresorami środowiskowymi, toksynami lub pestycydami.

Pokazujemy, jak prosty jest protokół PER do wdrożenia przy użyciu dwóch procedur. Jeden z nich nadaje się jako ćwiczenie laboratoryjne dla studentów lub do szybkich testów efektu eksperymentalnego leczenia. Drugi zapewnia dokładniejszą kontrolę zmiennych, co jest ważne dla badań nad warunkowaniem behawioralnym. Pokazujemy, w jaki sposób do testowania hipotez można wykorzystać kilka miar odpowiedzi behawioralnej, od binarnego tak/nie do bardziej ciągłych zmiennych, takich jak opóźnienie i czas trwania przedłużenia trąbki. Omawiamy też niektóre pułapki, na które często napotykają badacze, gdy korzystają z tej procedury po raz pierwszy.

Wprowadzenie

Wiele owadów dowiaduje się o bodźcach istotnych z ekologicznego punktu widzenia, a następnie zmieniają swoje reakcje behawioralne na te bodźce, aby dostosować się do nowych relacji predykcyjnych w swoim otoczeniu. U podstaw tej plastyczności behawioralnej może leżeć kilka różnych mechanizmów (np. nieasocjacyjny, asocjacyjny/Pawłowski i instrumentalny/instrumentalny¹). Te rodzaje plastyczności różnią się tym, jak bodźce lub zachowania są związane z ważnymi wydarzeniami, takimi jak pojawienie się jedzenia, partnera lub niebezpieczeństwa. Zrozumienie tych form plastyczności jest bardzo ważne dla podstawowych badań nad tym, jak zmienia się układ nerwowy, aby kodować^{nowe wspomnienia.} Jest to również ważne dla zrozumienia zachowań adaptacyjnych owadów, które są ważnymi wektorami chorób (np. tse-tse i komary) oraz owadów, które są ważne rolniczo, zarówno w produkcji roślinnej (pszczoły miodne), jak i jako szkodniki.

Badanie plastyczności behawioralnej u dowolnego zwierzęcia wymaga poziomu eksperymentalnej kontroli nad wieloma zmiennymi, który nie jest osiągalny w dziedzinie¹. Wymaga to opracowania solidnego protokołu warunkowania, który może być stosowany w bardziej kontrolowanych warunkach, ale który jest nadal istotny dla zachowania w warunkach naturalnych. Pszczoła miodna (Apis mellifera) jest doskonałym modelem do opracowania protokołu wykonywania kontrolowanych analiz plastyczności behawioralnej^3,4. Reakcja na wydłużenie trąbki (PER) u pszczół miodnych jest naturalnym odruchem behawioralnym, w którym pszczoła miodna rozciąga trąbkę w odpowiedzi na stymulację czułkową roztworem cukru. Podczas normalnych zachowań związanych z żerowaniem PER występuje, gdy pszczoła miodna znajdzie nektar w kwiatku. Na szczęście pszczoły miodne z łatwością wykażą to proste i łatwe do zmierzenia zachowanie w laboratorium. Umożliwia to badanie, w kontrolowanych warunkach, mechanizmów, które wpływają na to ekologicznie istotne zachowanie⁵. PER może być również stosowany w ramach protokołu warunkowania do badania percepcji bodźców oraz uczenia się i pamięci w różnych warunkach leczenia, które mają na celu ujawnienie mechanizmów behawioralnych i neuronalnych, które leżą u podstaw plastyczności⁶.

Od pierwszych badań Kuwabara⁷, warunkowanie PER jest szeroko stosowane do ujawniania mechanizmów nieasocjacyjnych, asocjacyjnych i instrumentalnych, które leżą u podstaw plastyczności behawioralnej u pszczół^{miodnych 8}. Mechanizmy te są identyczne do tych ujawnionych w badaniach swobodnie latających pszczół miodnych⁹. W przeciwieństwie do badań swobodnie latających pszczół miodnych, protokoły kondycjonowania PER można połączyć z elektrofizjologią^10,11 lub obrazowaniem fluorescencyjnym żywych komórek^12-14 mózgu. Ponadto protokoły PER pozwalają na eksperymentalną manipulację szlakami neuronalnymi za pomocą leczenia farmakologicznego lub genetyki molekularnej w celu przetestowania hipotez dotyczących ról określonych składników sieci, takich jak neuromodulatory^15,16. Protokoły PER dostarczyły również ważnego sposobu oceny subletalnego wpływu warunków środowiskowych, a także toksyn na zdrowie i efektywność żerowania pszczół miodnych¹⁷.

Ta procedura opisuje dwie metody dostarczania zapachu równolegle. Metoda 1 to wersja dostarczania zapachu i bezwarunkowego bodźca (sacharozy), która zapewnia niedrogą i technicznie prostą metodę prezentacji zapachu i nagrody w postaci sacharozy. Ta metoda jest dobra do szkolenia podstawowego i gdy automatyzacja nie jest możliwa. Jest to doskonały sposób na wprowadzenie tej techniki do klasy lub laboratorium dydaktycznego. Podczas kondycjonowania do eksperymentów obejmujących trudniejsze zadania i sprzężone fizjologiczne oceny percepcji zapachu, uczenia się lub pamięci, bardzo ważne jest dokładne i precyzyjne regulowanie początku, czasu dostarczania bodźców. Aby zapewnić najbardziej niezawodne dostarczanie bodźców, użyj środków automatyzacji dostarczania zapachów i precyzyjnej metody dostarczania nagrody. Metoda 2 wykorzystuje automatyczne dostarczanie zapachu i bardziej precyzyjne dostarczanie sacharozy. Jest technicznie bardziej wyrafinowana i wymaga więcej do początkowej konfiguracji niż metoda 1, ale znacznie zwiększa spójność czasu i ilości bodźców używanych do warunkowania i powinna być stosowana, gdy tylko jest to możliwe.

Protokół

1. Konfiguracja wkładu zapachowego (bodziec kondycjonowany)

1. Na początku eksperymentu ustaw wiele wkładów zapachowych dla wszystkich różnych zapachów potrzebnych do prób kondycjonowania.
   1. Użyj dygestorium do rozcieńczania zapachów i przygotowania wkładu zapachowego. Nigdy nie otwieraj butelek z zapachami poza tym dygestoriami, ponieważ zapachy będą szybko rozprzestrzeniać się po całym laboratorium i potencjalnie narażać pszczoły miodne na zapach przed kondycjonowaniem. Noś również rękawiczki podczas ustawiania wkładów zapachowych, a następnie dokładnie umyj je, aby uniknąć narażania pszczół miodnych na zapachy podczas obchodzenia się z nimi.
   2. Upewnij się, że każdy wkład zapachowy jest wyraźnie oznaczony kolorową etykietą zapachu, dla którego jest używany po raz pierwszy. Nigdy nie używaj wkładu zapachowego (cylindra strzykawki lub tłoka) do więcej niż jednego zapachu, ponieważ na wkładzie mogą znajdować się resztki zapachu.
2. Przygotowanie zapachów i mieszanin zapachowych
   1. Rozcieńczyć zapachy w heksanie lub oleju mineralnym do pożądanego stężenia.
      UWAGA: Zmiana stężenia zapachu lub przedstawienie mieszaniny dwóch lub więcej substancji zapachowych może pozwolić na zbadanie dodatkowych aspektów tego, jak pszczoły wyczuwają zapachy i uczą się uwarunkowanego skojarzenia. Mieszaniny zapachowe mogą być tak proste, jak mieszanina binarna 50:50 lub tak złożone, jak kilka zapachów, które naśladują naturalne bodźce węchowe. Zmniejszenie stężenia zapachu zwiększa również trudność zadania.
      1. Zapachy zostaną usunięte po ponownym użyciu wkładu (Rysunek 2). Aby uniknąć problemów z wyczerpaniem, należy wyprodukować wystarczającą ilość wkładów, aby można było zmienić na nowy wkład co 10-12 użyć.
3. Przygotowanie wkładów zapachowych
   1. Metoda 1
      1. Do tej metody należy użyć plastikowych strzykawek o pojemności 20 ml z kółkiem z bibuły filtracyjnej o średnicy 15 mm przypiętym do gumowego końca tłoka do wkładów zapachowych.
      2. Wyjąć tłok ze strzykawki i za pomocą pinezki przymocować kawałek bibuły filtracyjnej do końca tłoka.
      3. Za pomocą mikropipety umieść 10 μl zapachu na bibule filtracyjnej i ponownie włóż tłok do cylindra strzykawki. Wcisnąć tłok do oznaczenia 15 ml na cylindrze strzykawki.
   2. Metoda 2
      1. Do tej metody należy użyć szklanych lub plastikowych strzykawek tuberkulinowych o pojemności 1 cm3 (lub zmodyfikowanych pipet o podobnej objętości i kształcie) z paskiem bibuły filtracyjnej wewnątrz i gumowym lub silikonowym ogranicznikiem w szerokim końcu cylindra strzykawki na wkłady zapachowe.
      2. Wyjąć tłok z cylindra strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 cm³. Lufa strzykawki będzie korpusem wkładu zapachowego.
      3. Zdjąć czarną gumową końcówkę z tłoka strzykawki i odciąć zamknięty koniec gumowej końcówki.
         UWAGA: Ten gumowy pierścień będzie działał jako ogranicznik zmniejszający ssanie z przepływu powietrza na arenie, co przedwcześnie wyciągnie zapach z wkładu i przeleje się przez unieruchomioną pszczołę miodną. Alternatywnie jako ograniczniki działają rurki silikonowe (średnica zewnętrzna 4,8 mm) pocięte na odcinki 5 mm.
   3. Opłucz wnętrze cylindra strzykawki i gumowy/silikonowy ogranicznik 70% etanolem (aby usunąć większość pozostałości zapachu po poprzednim użyciu) i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
   4. Umieść pasek bibuły filtracyjnej o wymiarach 0,2 x 4 cm w szerokim otworze beczki tak, aby bibuła wystawała 1-2 cm poza otwór.
   5. Za pomocą mikropipety umieść 3-10 μl zapachu na bibule filtracyjnej, nie pozwalając, aby zapach dotknął końca cylindra strzykawki. Końcówka pipety może być ponownie użyta do uzyskania tego samego zapachu, ale upewnij się, że używasz nowej końcówki, aby ustawić następny zapach.
   6. Obrócić szeroki otwór cylindra strzykawki do góry, tak aby bibuła filtracyjna szybko wsunęła się do rurki. Włożyć ogranicznik do szerokiego otworu cylindra strzykawki.
      1. Upewnij się, że każdy wkład zapachowy jest wyraźnie oznaczony kolorową etykietą zapachu, do którego jest używany po raz pierwszy. Nigdy nie używaj wkładu zapachowego (cylindra strzykawki lub ogranicznika) do więcej niż jednego zapachu, ponieważ może być na nim resztkowy zapach.
   7. Zwiń koniec niestrzępiącej się chusteczki, nasącz ją 70% etanolem i użyj do dokładnego wytarcia zewnętrznej powierzchni wkładu, aby usunąć resztki zapachu na zewnątrz wkładu.

2. Zbieranie, krępowanie i karmienie pszczół

1. Przygotowanie uprzęży krępujących pszczoły
   1. Wykonaj proste uprzęże krępujące dla pszczół miodnych z plastikowych słomek sodowych, twardych plastikowych rurek lub obrabianych maszynowo metalowych rurek (wszystkie mają około 0,9 cm średnicy wewnętrznej i grubość ścianki 1-2 mm). Używaj mocniejszych uprzęży do zabiegów związanych z operacją.
   2. Wytnij 3 cm odcinki rurki. Następnie częściowo odetnij około połowy górnego 1 cm uprzęży, aby ułatwić utrzymanie pszczoły w miejscu podczas zapinania uprzęży.
   3. Wytnij pasek taśmy klejącej o wymiarach 0,2 x 6 cm i przymocuj jeden koniec do jednej strony uprzęży pszczół, pozostawiając drugi koniec wolny.
2. Zbieranie pszczół robotnic
   1. Zbieraj robotnice od wejścia do kolonii, gdy zatrzymują się przed opuszczeniem kolonii lub gdy wracają z żerowania.
      UWAGA: Umieszczenie kawałka drucianej siatki z otworami wystarczająco dużymi, aby pszczoły robotnice mogły się przez nie przeczołgać, nad wejściem spowalnia powracające robotnice i ułatwia ich złapanie, zanim wejdą do kolonii.
   2. Umieść fiolkę scyntylacyjną nad pszczołą, aż wleci do niej. Trzymaj fiolkę z otworem poziomo lub skierowanym w dół, podczas gdy wieczko jest zaciśnięte, aby pszczoła nie wyleciała z fiolki. Umieścić tylko jedną pszczołę w każdej fiolce. Upewnij się, że pokrywa ma otwór, aby umożliwić odpowiednią wymianę gazu.
   3. Zbieraj pszczoły szybko, aby zminimalizować czas, jaki spędzają w fiolkach. Przechowuj fiolki z pszczołami w małym pudełku w cieniu.
   4. Przenieś pudełko z fiolkami i pszczołami do laboratorium i umieść fiolki w zawiesinie lodowatej wody, aż pszczoły przestaną się poruszać. Gdy pszczoła jest nieruchoma, natychmiast wyjmij fiolkę z lodu, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji na zimno, i umieść pszczołę w uprzęży krępującej.
      UWAGA: Nie zalecamy umieszczania pszczół w lodówce lub zamrażarce, ponieważ trudno jest monitorować, kiedy pszczoły stają się nieruchome, co powoduje nadmierną ekspozycję na zimno. W przypadku zaprzęgania więcej niż 10 pszczół przenieś tylko kilka pszczół do gnojowicy lodowatej na raz.
3. Ograniczanie pszczół
   1. Umieść pszczołę w uprzęży tak, aby jej grzbietowa klatka piersiowa była skierowana w stronę odciętej części rurki, a jej głowa znajdowała się tuż nad górną częścią rurki. Delikatnie dociśnij pszczołę do rurki, tak aby jej aparat gębowy wystawał poza krawędź rurki. Wsuń pasek taśmy klejącej między głowę a klatkę piersiową po grzbietowej stronie pszczoły i mocno przymocuj wolny koniec do boku uprzęży.
      1. Upewnij się, że taśma na uprzęży jest gładka i napięta. Nie powinno być zauważalnych szczelin między przodem uprzęży pszczół a taśmą, a taśma powinna leżeć płasko na górze uprzęży. Jeśli są luki, pszczoła może nie być w stanie prawidłowo wysunąć trąbki lub może uciec. Upewnij się również, że przednie nogi pszczoły nie wystają między przód uprzęży a taśmę klejącą.
4. Karmienie pszczół i interwał karmienia do kondycjonowania
   1. Około 30 minut po uprzęży – po tym jak pszczoły dojdą do siebie po początkowym ustawieniu – nakarm pszczoły 3-4 μl 0,5 M sacharozy (w wodzie). Ta ilość będzie wystarczająca na przerwę między karmieniem a kondycjonowaniem wynoszącą 3-4 godziny.
      1. Ogólnie rzecz biorąc, podawaj 1 μl 0,5 M sacharozy na około godzinę czasu oczekiwania między karmieniem a kondycjonowaniem, aby upewnić się, że pszczoły przetrwają ten okres, ale są wystarczająco głodne na początku kondycjonowania, aby były zmotywowane do nauczenia się uwarunkowanego skojarzenia. W laboratorium utrzymywanym w ciepłej temperaturze lub w przypadku stosowania sacharozy o innym stężeniu, należy odpowiednio dostosować podawaną ilość lub odstęp czasu.
         UWAGA: Przy 24-godzinnym odstępie między karmieniem a kondycjonowaniem upewnij się, że wszystkie pszczoły są karmione do sytości 0,5 lub 1 M sacharozy co najmniej 24 godziny przed rozpoczęciem kondycjonowania. W temperaturze pokojowej pszczoły potrzebują około 24 godzin, zanim będą wystarczająco zmotywowane, aby dobrze zareagować w protokole kondycjonowania.
         UWAGA: Do karmienia pszczół należy używać roztworu sacharozy o niższym stężeniu niż stężenie stosowane jako nagroda podczas kondycjonowania, aby zapobiec mniejszej wrażliwości pszczół na stężenie sacharozy stosowane podczas kondycjonowania, co może zmniejszyć wydajność uczenia się.
      2. Nakarm pszczoły w miejscu oddalonym od obszaru treningowego. Narażenie na bodziec bezwarunkowy (sacharozę) w kontekście kondycjonowania przed kondycjonowaniem może wpływać na późniejsze warunkowanie zapachu.
   2. W przerwie między karmieniem a kondycjonowaniem umieść pszczoły na blacie w cichym miejscu laboratorium, aby uniknąć niepotrzebnych zakłóceń. Jeśli w laboratorium panuje niska wilgotność otoczenia, w tym czasie umieść pszczoły w plastikowym pojemniku z mokrymi ręcznikami papierowymi. Zapobiega to wysuszeniu, ponieważ pszczoły mogą umrzeć, jeśli są wystawione na działanie niskiej wilgotności przez dłuższy czas.
      UWAGA: Nie zmieniaj protokołu zaprzęgania i karmienia w eksperymencie! Używaj tylko jednego określonego przedziału czasu między ustawieniem i karmieniem pszczół a rozpoczęciem kondycjonowania dla każdego eksperymentu, aby wszystkie pszczoły były traktowane dokładnie w ten sam sposób.

3. Kondycjonowanie

1. Badanie wrażliwości na sacharozę
   1. Na kilka minut przed rozpoczęciem kondycjonowania przetestuj motywację pszczół do żerowania, dotykając ich czułków małą kropelką 0,5 M roztworu sacharozy (takie samo stężenie stosuje się podczas karmienia). Nie pozwalaj im jeść podczas tego testu. Jeśli zareagują poprzez wydłużenie trąby, prawdopodobnie są wystarczająco zmotywowani do nauki i mogą być wykorzystane w protokole.
2. Projekt eksperymentu
   UWAGA: Protokół ten może być modyfikowany tak, aby pasował do szerokiej gamy protokołów uczenia się w celu zbadania wielu aspektów zdolności uczenia się i zapamiętywania pszczół miodnych. Wśród wielu parametrów, które można dostosować, są: interwał między próbami, liczba pszczół wyszkolonych w danym czasie, interwał między bodźcami, rodzaj i stężenie oraz liczba zapachów, rodzaj i stężenie bodźca bezwarunkowego, liczba i sekwencja prób (ryc. 1; Tabela 1)^19-21. Podczas projektowania dokładnego protokołu dla każdej próby kondycjonowania, bardzo ważne jest, aby interwał między badaniami był spójny u wszystkich osób. Zbyt krótki, zbyt długi lub niespójny odstęp między próbami pogorszy wydajność pszczół. Zobacz dyskusję, aby uzyskać pełne omówienie tego tematu.
   UWAGA: Pszczoły szybciej nauczą się zadania, jeśli znajdą się w ciepłym otoczeniu. Dlatego utrzymuj stałą i wysoką temperaturę środowiska treningowego (29-30 °C, jeśli to możliwe).
3. Dostarczanie zapachu (bodziec warunkowy)
   1. Metoda 1
      1. Konfiguracja systemu dostarczania zapachów
         1. Zamontuj plastikową strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną bibułą filtracyjną nasączoną zapachem tak, aby była stabilna, a mały koniec skierowany bezpośrednio na czułki pszczoły. Ustawić tłok w miejscu, gdzie znajduje się oznaczenie 15 ml i ustawić strzykawkę w taki sposób, aby tłok był łatwo dostępny.
      2. Prezentacja bodźca zapachowego
         1. Na początku każdej próby umieść pszczołę w uprzęży na kołku na arenie kondycjonowania z czułkami skierowanymi bezpośrednio w stronę wkładu zapachowego. Pozwól pszczole zaaklimatyzować się na arenie przez 15–25 sekund przed rozpoczęciem bodźca zapachowego, aby zmniejszyć zakłócenia spowodowane nagłą zmianą otoczenia wizualnego podczas bodźca zapachowego.
            1. Jeśli pszczoła zacznie reagować na wkład zapachowy natychmiast po umieszczeniu go na arenie kondycjonowania, na końcówce wkładu może pojawić się nieprzyjemny zapach. Usuń zanieczyszczający zapach, zmywając wkład niestrzępiącą się chusteczką nasączoną 70% etanolem. Jeśli to nie rozwiąże problemu, wymień wkład.
         2. Naciskać tłok strzykawki ze stałą prędkością, tak aby tłok został całkowicie wciśnięty w ciągu 4 sekund. Monitoruj reakcję pszczoły na zapach przed przedstawieniem bezwarunkowego bodźca.
         3. Po każdej próbie pozwól pszczole odpocząć na arenie kondycjonowania przez kolejne 15-25 sekund. Zbyt wczesne przemieszczenie pszczoły po próbie znacznie zmniejszy skuteczność każdej próby kondycjonowania.
   2. Metoda 2
      1. Konfiguracja systemu dostarczania zapachów
         1. Źródło przepływu powietrza i natężenie przepływu
            1. Jako źródło przepływu powietrza do dostarczania zapachów należy użyć pompy napowietrzającej akwarium lub nawiewu powietrza pod ciśnieniem na stole laboratoryjnym, jeśli laboratorium jest w nią wyposażone.
               UWAGA: Typowa pompa napowietrzająca akwarium będzie miała natężenie przepływu powietrza w pobliżu 400 ml / min (7 ml / s); W ciągu 4 sekund bodźca zapachowego przez wkład o pojemności 1 ml przepłynie 28 ml powietrza.
            2. Użyj przepływomierza zgodnie z rurką aparatu doprowadzającego powietrze, aby wyregulować natężenie przepływu doprowadzanego powietrza. Wyreguluj przepływomierz, aż natężenie przepływu wyniesie 400 ml/min. Sprawdź natężenie przepływu przy otworze wkładu zapachowego za pomocą oddzielnego przepływomierza.
            3. Podłącz przepływ powietrza do wkładu zapachowego przez system plastikowych rurek i zaworów.
               UWAGA: Omówione poniżej urządzenie rozrządu otwiera zawory w odpowiednim momencie próby. Plastikowe łączniki mocują system przepływu powietrza do wkładu zapachowego poprzez nasadkę typu Luer do cylindra strzykawki wkładu.
            4. Niezależnie od źródła przepływu powietrza, okresowo sprawdzaj natężenie przepływu, aby upewnić się, że przewód jest nienaruszony, a natężenie przepływu jest utrzymywane na żądanym poziomie.
      2. Automatyczne dostarczanie zapachów
         1. Użyj programowalnego sterownika logicznego (PLC), aby zautomatyzować dostarczanie zapachu.
            UWAGA: Sterownik PLC jest zaprogramowany tak, aby otwierał zawory do przepływu powietrza dostarczającego zapach 6 sekund po zainicjowaniu programu (inicjowanego przez naciśnięcie przycisku), utrzymywał zawory otwarte przez 4 sekundy i emitował dźwiękowy sygnał zasilający przez mały głośnik, 3 sekundy po rozpoczęciu bodźca zapachowego, aby zasygnalizować eksperymentatorowi dostarczenie sacharozy.
         2. Użyj małej diody LED, aby wskazać czas bodźca zapachowego podczas każdej próby. Jeśli to możliwe, użyj czerwonej diody LED, ponieważ fotoreceptory pszczół są przesunięte z dłuższych [czerwonych] fal w kierunku krótszych [uv], więc nie mogą ich dobrze zobaczyć. Umieść diodę LED za i pod pszczołą, poza jej polem widzenia, aby światło nie stało się niezamierzonym bodźcem warunkowym.
            UWAGA: Lampka pomaga również sprawdzić, czy sterownik PLC działa prawidłowo i jest przydatna do analizowania nagrań wideo reakcji pszczół podczas prób testowych.
      3. Układ wydechowy
         1. Ustaw system wydechowy za pszczołą, aby pomóc przeciągnąć powietrze obok pszczoły i usunąć powietrze o nieprzyjemnym zapachu z areny kondycjonowania, aby utrzymać dyskretne ramy czasowe dla każdej prezentacji zapachu.
            UWAGA: Jeśli w laboratorium znajduje się system próżniowy, zmodyfikuj port próżniowy i podłącz przewód z rurkami osuszacza, aby zapewnić przepływ powietrza wymagany do ewakuacji z areny kondycjonowania. Jeśli nie ma systemu próżniowego, wystarczy mały wentylator elektryczny umieszczony w linii z rurką osuszacza prowadzoną do dygestorium lub przez okno.
      4. Na początku każdego dnia należy sprawdzić połączenia elektryczne i powietrzne układu dostarczania zapachów i układu wydechowego. Naciśnij przycisk start na systemie dostarczania zapachów i śledź czas od naciśnięcia przycisku do otwarcia zaworów (ciche kliknięcie i zapala się dioda LED) oraz kiedy rozlegnie się sygnał do przedstawienia bezwarunkowego bodźca (sygnał dźwiękowy). Sprawdź dopływ powietrza, umieszczając wilgotny opuszek palca przed złączem, które zostanie przymocowane do wkładu zapachowego. Silny strumień powietrza powinien być zapewniony tylko wtedy, gdy zawory są otwarte. Sprawdź układ wydechowy, przytrzymując niestrzępiącą się chusteczkę do otworu układu wydechowego, aby upewnić się, że przepływ powietrza jest wystarczająco silny, aby prawidłowo usunąć powietrze z areny klimatyzacyjnej.
   3. Montaż wkładu zapachowego
      1. Umieść trochę plasteliny na blacie lub na małym stojaku z pleksiglasu, aby ustawić wkład pszczół i zapachów bezpośrednio przed układem wydechowym. Umieść szklaną strzykawkę z zapachem w glinie i wyreguluj ją tak, aby otwór w szerokim końcu był skierowany na głowę pszczoły. Koniec strzykawki powinien znajdować się 1-2 cm od pszczoły. Wybierz odległość w tym zakresie i bądź stały.
      2. Bezpiecznie umieść złączkę łączącą wkład z systemem przewodów powietrznych i zaworów na wąskim szklanym końcu strzykawki.
   4. Prezentacja bodźca zapachowego
      1. Na początku każdej próby umieść zaprzężoną pszczołę na kołku na arenie kondycjonowania z czułkami skierowanymi bezpośrednio w stronę wkładu zapachowego. Pozwól pszczole odpocząć na arenie przez 15–25 sekund przed rozpoczęciem bodźca zapachowego, aby umożliwić jej przyzwyczajenie się do nowego otoczenia.
         UWAGA: Jeśli pszczoła zacznie reagować na wkład zapachowy natychmiast po umieszczeniu go na arenie kondycjonowania, na końcówce wkładu może pojawić się nieprzyjemny zapach. Usuń zanieczyszczający zapach, zmywając wkład niestrzępiącą się chusteczką nasączoną 70% etanolem. Jeśli to nie rozwiąże problemu, wymień wkład.
      2. Naciśnij przycisk start, aby uruchomić mechanizm czasowy dostarczania zapachu. Monitoruj reakcję pszczoły na zapach po nadejściu bodźca i przed wystąpieniem bodźca bezwarunkowego.
      3. Po każdej próbie pozwól pszczole odpocząć na arenie kondycjonowania przez kolejne 15-25 sekund, aby umożliwić początkowe utworzenie pamięci. Zbyt wczesne przemieszczenie pszczoły po próbie znacznie zmniejszy skuteczność każdej próby kondycjonowania.
4. Dostarczanie sacharozy (bodziec bezwarunkowy)
   1. Metoda 1
      1. W przypadku tej metody użyj wykałaczki, aby dostarczyć sacharozę.
         UWAGA: Najlepiej jest używać plastikowej wykałaczki, ponieważ drewniane wykałaczki mogą mieć zapach, który wpłynie na reakcje pszczół na bodziec warunkowy.
      2. Zanurz końcówkę wykałaczki w roztworze sacharozy, a kiedy nadejdzie czas, aby przedstawić bezwarunkowy bodziec, przytrzymaj wykałaczkę przed pszczołą i pozwól pszczole zlizać sacharozę z wykałaczki przez około 1 sekundę.
      3. Regularnie wymieniaj wykałaczkę, aby uniknąć gromadzenia się sacharozy.
   2. Metoda 2
      1. System dostarczania sacharozy
         UWAGA: Dokładniejszym sposobem dostarczania bezwarunkowego bodźca jest użycie strzykawek mikrometrycznych, które mogą dokładnie dostarczyć niewielkie ilości (dziesiąte części mikrolitra) nagrody sacharozy.
         1. Nawinąć mikrometr strzykawki tak daleko, jak to możliwe. Naładować cylinder strzykawki z mikrometrem roztworem sacharozy. Upewnij się, że w szklanej części nie ma pęcherzyków powietrza i zmontuj strzykawkę. Napełnić piastę igły roztworem sacharozy przed umieszczeniem jej na wąskim końcu cylindra strzykawki. Aby upewnić się, że płyn w igle to rzeczywiście sacharoza, a nie woda z mycia igły, przed rozpoczęciem eksperymentu nawiń mikrometr o 1–2 μl do przodu.
   3. Prezentacja sacharozy
      1. Trzymaj końcówkę igły w odległości około 2 cm od pszczoły, gdy pojawi się zapach. Użyj krawędzi areny treningowej, aby zapobiec potrząsaniu strzykawką, ponieważ ruch może rozpraszać pszczołę. Nie zbliżaj igły zbyt blisko w oczekiwaniu na sygnał karmienia, ponieważ to również przedwcześnie przeniesie uwagę pszczoły z zapachu na sacharozę.
      2. Gdy tylko rozlegnie się sygnał karmienia, delikatnie dotknij czułków, aż pszczoła wysunie trąbkę, a następnie nakarm pszczołę. Powinno to wymagać tylko bardzo lekkiego dotknięcia lub dwóch anten.
         1. Użyj kwoty nagrody od 0,2 do 0,8 μl. Pszczoła powinna z łatwością spożyć całą kropelkę w czasie przeznaczonym na bodziec bezwarunkowy (~1-2 sekundy). Nie należy stosować karmienia "ad libitum" z dużej kropelki, którą pszczoła żywi się przez kilka sekund, ale nie może jej całkowicie skonsumować.
         2. Uważaj, czy na antenie nie nagromadzi się sacharozy, która zmniejszy reakcję pszczoły na kolejne prezentacje nagrody. W takim przypadku zmodyfikuj procedurę karmienia.
         3. Aby zapewnić dokładne połączenie sygnału zapachowego i nagrody sacharozy, należy przedstawić pszczołie kroplę roztworu sacharozy tak szybko, jak to możliwe po sygnale.
            UWAGA: Czas między wystąpieniem CS (zapach) a US (sacharoza) ma kluczowe znaczenie. Idealnie byłoby, gdyby prezentacja zapachu i prezentacja sacharozy na krótko się pokrywały. Jeśli między zakończeniem CS a dostarczeniem do USA upłynie więcej niż kilka sekund, wydajność kondycjonowania zmniejszy się.

4. Testowanie

1. Po kondycjonowaniu należy przeprowadzić niewzmocnione próby testowe, aby ocenić, jak dobrze pszczoły nauczyły się i/lub zapamiętały uwarunkowane skojarzenie.
   UWAGA: Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać szczegółowe wyjaśnienie znaczenia analizy reakcji pszczół na niewzmocnione próby testowe, oprócz wyników pszczół w próbach kondycjonowania oraz wyjaśnienie celu liczby prób testowych i zapachów testowych.
2. Czas konsolidacji
   1. Po kondycjonowaniu należy przeprowadzić natychmiastową próbę testową lub pozwolić pszczołom odpocząć przez okres konsolidacji.
      UWAGA: Długość okresu konsolidacji, odstęp czasu między kondycjonowaniem a testowaniem, będzie zależał od celu eksperymentu. Jeśli celem jest zbadanie różnic w uczeniu się lub pamięci krótkotrwałej, wydajność pszczół w próbach testowych może być oceniana natychmiast po kondycjonowaniu lub kilka godzin po nim. Jeśli eksperyment obejmuje badanie pamięci długotrwałej, próby testowe powinny być przeprowadzone przez co najmniej 24 godziny po zakończeniu kondycjonowania.
   2. Jeśli próby testowe trwają dłużej niż 24 godziny po kondycjonowaniu, należy karmić pszczoły do sytości 0,5 M sacharozą po kondycjonowaniu i co najmniej raz dziennie po kondycjonowaniu do 12-24 godzin przed próbami testowymi.
      1. Aby upewnić się, że pszczoły osiągnęły sytość, nakarm każdą z nich kilka razy, aż przestaną wysuwać trąbkę w odpowiedzi na dotknięcie czułków sacharozą. Mogą spożywać nawet 40 μl, aby osiągnąć sytość.
   3. Przechowuj pszczoły w nawilżonym pojemniku, aby zapobiec ich wysuszeniu i śmierci w okresie konsolidacji.
3. Próby testowe
   1. Do testowania używaj tylko nowo przygotowanych wkładów zapachowych.
      UWAGA: Wkłady używane do akwizycji mogą być w różny sposób uszczuplone, więc bodziec testowy nie będzie spójny we wszystkich próbach, zapachach i poszczególnych pszczołach, a zatem może znacząco wpłynąć na spójność i solidność wyników.
   2. Podczas testowania należy zachować ten sam interwał między próbami i inne parametry, które są używane w fazie kondycjonowania eksperymentu.
   3. Nie należy prezentować bodźca bezwarunkowego podczas prób testowych, ponieważ obecność nagrody zmieni reakcję pszczół na bodziec warunkowy, potencjalnie maskując bardziej subtelne efekty protokołu warunkowania lub leczenia.
   4. Nagraj filmy ze wszystkich prób testowych, aby móc później zmierzyć wiele aspektów reakcji pszczół na zapach (zapachy).

5. Rejestrowanie odpowiedzi pszczół

1. Punktacja binarna (obecność/nieobecność) PER
   1. Użyj binarnego systemu punktacji PER podczas prób kondycjonowania i podczas prób testowych. Oceniaj odpowiedzi jako pozytywne lub negatywne; Jest to zadowalające wyniki w przypadku wielu rodzajów analiz z próbą o wielkości 20-40 pszczół na grupę badaną. Dokładna topologia odpowiedzi może być złożona²². Ważne jest, aby ustalić łatwe do zauważenia i ocenione kryterium pozytywnej odpowiedzi.
      1. Oceń odpowiedź pszczoły jako pozytywną (+), gdy pszczoła wysunie trąbkę poza linię utworzoną przez połączenie końcówek otwartych żuchw. Pozytywną odpowiedź należy uzyskać tylko wtedy, gdy pszczoła rozciągnie trąbkę po pojawieniu się zapachu, ale przed kompensacją zapachu.
      2. Oceń odpowiedź pszczoły jako negatywną (−), gdy nie ma wysunięcia trąbki podczas próby lub jeśli trąbka jest wysunięta po przesunięciu środka zapachowego.
      3. Unikaj prób uzyskania częściowych odpowiedzi. Aby dokonać dokładniejszego rozróżnienia w zachowaniu pszczół, skorzystaj z techniki analizy wideo opisanej poniżej.
2. Analiza wideo dodatkowych pomiarów PER (film 1)
   1. Zbierz dodatkowe informacje z testów behawioralnych, analizując filmy z reakcjami pszczół na zapach.
      UWAGA: Pomiary te mogą również zapewnić wyższą rozdzielczość czasową do badania reakcji pszczół na zapachy, szczególnie gdy nie ma różnicy w ocenie obecności/braku PER między grupami poddanymi zabiegowi.
   2. Nagrywanie filmów
      1. Do nagrań wideo należy zawsze używać niewzmocnionych testów lub prób wygaszania. Obecność nagrody zmieni reakcję pszczół na zapach, modyfikując czas trwania przedłużenia trąbki.
      2. Ustaw kamerę wideo na statywie nad areną treningową i ustaw kamerę na przedniej części głowy pszczoły, tak aby czułki i trąbka były ostre.
      3. Umieść małą diodę LED, która wskazuje prezentację bodźca zapachowego, w obszarze za pszczołą, który jest widoczny na filmie, aby użyć jej do identyfikacji początku zapachu i przesunięcia podczas analizy.
      4. Rozpocznij nagrywanie 20 sekund przed pojawieniem się zapachu i kontynuuj nagrywanie przez co najmniej 20 sekund po przesunięciu zapachu, zanim zakłócisz działanie pszczoły.
   3. Analiza wideo
      1. Prześlij filmy do oprogramowania do edycji wideo, takiego jak iMovie lub Final Cut Pro, z możliwością pomiaru odstępów czasu między określonymi klatkami w filmie.
      2. Analizuj reakcję pszczół na zapach przez dyskretny okres czasu, rozpoczynający się w momencie wystąpienia bodźca zapachowego (np. 10 lub 20 sekund).
      3. Do oceny PER należy użyć następujących typowych pomiarów:
         1. Zmierz czas trwania wyprostu trąbki, czyli całkowity czas, w którym trąbka wykracza poza linię od żuchwy do żuchwy (opisaną powyżej).
            UWAGA: Pszczoła może wielokrotnie wysuwać i chować trąbkę w ciągu 10-20 sekund. Zmierz każde przedłużenie trąbki indywidualnie i oblicz całkowity czas trwania. Analiza liczby i czasu trwania każdego pojedynczego przedłużenia trąbki może również dostarczyć cennych informacji.
         2. Zmierz opóźnienie przedłużenia trąbki, czyli czas między pojawieniem się zapachu, kiedy zapala się dioda LED, a pierwszym przedłużeniem trąbki.
         3. Policz i zsynchronizuj wydłużenia języka językowego w stosunku do początku działania środka zapachowego, pierwszego rozszerzenia lub innych parametrów czasowych.
         4. Śledź ruchy anteny²³, które również wykazują charakterystyczne zmiany zorientowane na zapach.
            UWAGA: W filmie 1 ruchy anten były śledzone za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo, aby zilustrować zmianę ruchów anten w odpowiedzi na bodziec zapachowy.

Wyniki

Przedstawiamy dwa przykłady zastosowania opisanych powyżej protokołów PER. W pierwszym przykładzie wykorzystano Metodę 2 do zbadania, w jaki sposób pszczoły miodne postrzegają różne zapachy w zależności od podobieństwa molekularnego do zapachu użytego jako CS^5,24,25. Drugi przykład ilustruje zastosowanie Metody 1 oraz niektóre środki ostrożności, które należy podjąć przy rozpoczynaniu eksperymentów z warunkowaniem PER w laboratorium badawczym.

Badania tego typu były wykorzystywane do opisu węchowej „przestrzeni percepcyjnej” pszczół miodnych i ciem w połączeniu z obrazowaniem biologicznym¹³ lub analizami elektrofizjologicznymi²⁶. Pszczoły miodne (n = 20) poddano warunkowaniu w celu skojarzenia substancji zapachowej, jaką jest decanal, z wzmocnieniem w postaci sacharozy w ciągu 12 prób warunkowania z parowaniem w przód (Ryc. 3A). Około 10% pszczół miodnych zareagowało „spontanicznie” w pierwszej próbie, co jest zjawiskiem normalnym. Następnie odsetek osobników reagujących wzrastał w kolejnych próbach, aż do osiągnięcia 100% odpowiedzi w piątej próbie i w każdej kolejnej. Kilka badań wykazało, że ten wzrost odpowiedzi jest specyficzny dla warunku parowania w przód (Ryc. 1) w stosunku do kilku istotnych procedur kontrolnych³. Po fazie nabywania, każdą pszczołę miodną poddano serii niezwzmocnionych prób testowych (Ryc. 3B), które polegały na ekspozycji na zapach CS oraz na kilka innych substancji zapachowych, które systematycznie różniły się strukturą cząsteczkową od CS. Pszczoły miodne najsilniej reagowały na CS. Ich reakcje na inne substancje zapachowe malały w funkcji systematycznych zmian w strukturze, przy czym najniższe reakcje odnotowano w przypadku substancji zapachowych najmniej podobnych do CS.

Na Rysunku 4 przedstawiono wyniki niedawnych warsztatów, podczas których studenci po raz pierwszy uczyli się, jak warunkować pszczoły miodne przy użyciu Metody 1. Studenci w pierwszej kolejności warunkowali pszczoły miodne poprzez parowanie progresywne metyloheksanonu (MCH) lub oktanolu (OCT) z wzmocnieniem w postaci sacharozy (Rysunek 4A). Procent odpowiedzi był niższy w pierwszej próbie i wzrastał w kolejnych próbach, co wskazuje na to, że pszczoły nauczyły się związku między zapachem a sacharozą. Wystąpiły różnice w stopniu, w jakim pszczoły nauczyły się warunkowanego związku w różnych grupach studentów. W naszym doświadczeniu tego rodzaju różnice mogą wynikać z zapachu użytego jako CS, z nieprecyzyjnych elementów metody (Metoda 1) lub z poziomu przeszkolenia eksperymentatorów. W tym ostatnim przypadku wyniki szybko stają się bardziej spójne wraz ze wzrostem doświadczenia eksperymentatorów. Po warunkowaniu każda pszczoła miodna była testowana dwukrotnie z każdym z zapachów. W grupach pszczół miodnych, które zostały poddane warunkowaniu poprzez parowanie progresywne OCT lub MCH, reakcja była, zgodnie z oczekiwaniami, najsilniejsza w odpowiedzi na zapach warunkowany (Rysunek 4B).

Druga grupa pszczół miodnych, u której zastosowano parowanie w przód (forward pairing) z OCT, była warunkowana równolegle z inną grupą, w której zapach OCT był parowany w tył (backward pairing) z sacharozą. Parowanie w tył jest jednym z kilku rodzajów procedur kontrolnych służących do wykazania, że wzrost reakcji jest specyficzny dla parowania w przód, a nie wynika z innego procesu, takiego jak niespecyficzne pobudzenie wynikające z sensytyzacji. W przypadku parowania w tył bodziec bezwarunkowy (US) w postaci sacharozy oraz bodziec warunkowy (CS) w postaci zapachu są prezentowane w kolejności odwrotnej do tej, która została przedstawiona na Rysunku 1. Dane dotyczące nabywania odruchu w parowaniu w tył nie zostały przedstawione, ponieważ nie można ocenić reakcji warunkowej (CR), biorąc pod uwagę prezentację zapachu CS po prezentacji sacharozy. Zgodnie z przewidywaniami dla warunkowania asocjacyjnego, poziomy odpowiedzi na OCT były wyższe w grupie z parowaniem w przód w porównaniu z grupą z parowaniem w tył (Rysunek 4C).

Rysunek 1. Schematy projektu eksperymentalnego dla warunkowania z wykorzystaniem parowania w przód. Definicje terminów użytych na tym rysunku znajdują się w Tabeli 1. (A) CS (zapach) poprzedza i nakłada się na US (roztwór sacharozy/wody). Przedstawiona relacja między CS a US jest optymalna dla warunkowania pszczół miodnych i ciem. Jednak optymalny ISI może zależeć od protokołu warunkowania oraz gatunku zwierzęcia¹. (B) Podział i wzglósety czasowe CS, CR, US oraz UR. CR, która występuje przed prezentacją US lub podczas niezwierciadłowanych prób „testowych”, stanowi zmienną zależną w protokołach eksperymentalnych.

Rycina 2. Wyczerpywanie się zapachu przy wielokrotnym użyciu wkładów. Do uzyskania tych danych wkłady zapachowe przygotowano z heksanolem zgodnie z opisem w tekście. Heksanol jest powszechnie stosowany jako CS w badaniach PER; jednak rzeczywiste tempo wyczerpywania zależy od rodzaju zapachu i rozpuszczalnika. Wkłady były następnie używane jednokrotnie przez 4 sec w każdej minucie przez 8 prób (zakładając 5 pszczół miodnych/próbę w standardowym eksperymencie, co odpowiadałoby 40 użyciom). Rozcieńczenia w wskazanym rozpuszczalniku, które są stosunkowo standardowe dla eksperymentów PER, wynosiły 2.0 M (A) oraz 0.2 M (B). (A, B) Próbki zapachu pobrano po pierwszej i ósmej próbie poprzez adsorpcję na włóknie do mikroekstrakcji w fazie stałej (SPME), a następnie desorbowały je w chromatografie gazowym. Względne powierzchnie pod pikami były wyższe po pierwszej próbie w porównaniu do ósmej dla obu rozpuszczalników i obu stężeń (test znaków rang Wilcoxona p < 0.05 [*] lub więcej), co wskazuje, że z wkładu uwalniano mniej zapachu po wielokrotnym jego użyciu. (C, D) Te same dane przedstawiające wyłącznie ósmą próbę z powiększoną osią y. Wykazują one, że wyczerpywanie było nieco większe dla heksanu w porównaniu do oleju mineralnego, ale tylko przy niższym stężeniu.

Rycina 3. Przyswajanie i test z wykorzystaniem decanalu jako CS oraz metody 2 warunkowania. (A) Odpowiedź (CR) w kolejnych próbach podczas 12 prób parowania bezpośredniego (Rycina 1). Dane pochodzą od n = 20 pszczół miodnych warunkowanych w czterech grupach po 5 osobników w każdej. ISI wynosiło 3 sec, a ITI 6 min. (B) Testy bez wzmocnienia z użyciem zapachów różniących się od decanalu długością łańcucha węglowego i/lub pozycją węgla karbonylowego. Zapachy prezentowano w zrandomizowanej serii we wszystkich czterech grupach, przeplatając je próbami wzmocnionymi decanalem (co dwie do trzech prób), aby uniknąć wygaszenia CR.

Rycina 4. Dane z warsztatów, podczas których studenci studiów magisterskich i doktoranckich byli szkoleni w warunkowaniu pszczół miodnych z wykorzystaniem metody PER 1. (A) Dane z procesu nabywania odruchu w trzech grupach pszczół miodnych warunkowanych oktanolem (n = 23 i 15 odpowiednio dla Gp 1 i 2) oraz metylocykloheksanonem (n = 10). (B) Odruchy warunkowe (CR) podczas testów bez wzmocnienia z obydwoma zapachami; cztery próby przedstawione w losowych seriach w poszczególnych grupach. (C) Testy bez wzmocnienia z obydwoma zapachami w dwóch grupach pszczół miodnych, jednej z parowaniem w przód (Gp 1, n = 23) i jednej z parowaniem w tył (n = 25).

Termin (skrót)	Definicja	Istotny przykład
Bodziec warunkowy (CS)	Bodziec, który początkowo wywołuje niewielką lub żadną reakcję i sygnalizuje wystąpienie US	ZAPACH
Reakcja warunkowa (CR)a	Reakcja na CS po skojarzeniu go z US	WYCIĄGNIĘCIE TRĄBKOWATEGO
Bodziec bezwarunkowy (US)	Biologicznie istotny bodziec, który wywołuje reakcję	ROZTWÓR SAKROZY/WODY
Reakcja bezwarunkowa (UR)a	Reakcja na US	WYCIĄGNIĘCIE TRĄBKOWATEGO
Interwał międzybodźcowy (ISI)	Czas między wystąpieniem CS a wystąpieniem US	Interwał od ZAPACHU do SAKROZY
Interwał międzypróbny (ITI)	Czas między kolejnymi parami CS-US dla jednego zwierzęcia	Interwał od ZAPACHU (próba n) do ZAPACHU (próba n+1)

Tabela 1. Ważna terminologia. Ilustrację tych terminów przedstawiono na Rysunku 1. ^aW przypadku warunkowania PER reakcja warunkowa (CR) i reakcja bezwarunkowa (UR) są takie same, choć w przypadku innych rodzajów skojarzeń i odruchów CR i UR mogą się od siebie różnić.

Film 1. Nagranie wideo przedstawiające pszczołę miodną wykazującą PER po uwarunkowaniu odpowiedzią na zapach. Należy zwrócić uwagę na reakcję PER pszczoły około 1,5 sec po pojawieniu się zapachu. Oprogramowanie do śledzenia zmapowało ruchy czułków w odpowiedzi na prezentację zapachu. Linie wykreślone w prawym górnym rogu wideo przedstawiają rzeczywiste ruchy czułków. Dwa wykresy na dole ekranu pokazują ruchy czułków w osiach X (lewa) i Y (prawa). Linie pionowe na wykresie pokazanym w wideo wskazują, od lewej do prawej: włączenie światła (light ON), PER, wyłączenie światła (light off) oraz cofnięcie trąbki.

Dyskusja

W protokole tym przedstawiono dwie wiarygodne metody kondycjonowania przy użyciu procedury PER. Są to dwie z kilku metod, które zostały z powodzeniem zastosowane^27,21. Stosujemy Metodę 2 we wszystkich badaniach eksperymentalnych z użyciem PER, ponieważ jest ona niezmiennie wiarygodna, nawet w przypadku różnych eksperymentatorów.

Ta sama podstawowa procedura została zaadaptowana do wielu różnych rodzajów badań z udziałem pszczół miodnych, w tym do wykorzystania różnych bodźców warunkowych i różnych odruchów behawioralnych. Powiązano to również z badaniami genetycznych podstaw różnic w uczeniu się^28,29, fizjologicznych korelatów percepcji węchowej i pamięci w mózgu^13,14,30 oraz modulacyjnych i molekularnych genetycznych podstaw zachowania^15,16,31. Ze względu na zaawansowaną wiedzę na temat ekologicznego znaczenia uczenia się węchu dla pszczół miodnych, która rozpoczęła się wraz z pierwszymi badaniami Karla von Frischa ponad 100 lat temu³¹ , wyniki PER można łatwo powiązać z potrzebami przetrwania kolonii. Ostatnio został zaadaptowany do badań rolniczych w celu zbadania subletalnych skutków behawioralnych pestycydów i toksyn środowiskowych¹⁷.

Podstawowa procedura jest potężna, ponieważ może być stosowana do badania problemów również u innych gatunków. Dwa gatunki ciem, Manduca sexta i Spodoptera littoralis, zostały wykorzystane w badaniach PER w celu zbadania neuronalnych podstaw identyfikacji zapachów i zdolności uczenia się węchu każdego gatunku^32,33. Eksperymenty PER z muszkami owocowymi dostarczyły wielu informacji na temat molekularnych kaskad sygnalizacyjnych zaangażowanych w chemosensację i uczenie się³⁴. A PER został ostatnio wykorzystany do badania habituacji u pchły (Rhodnius prolixus)³⁵, ważnego wektora choroby.

Ogólnie rzecz biorąc, procedura jest odporna na zmiany metody; Stosowanie różnych metod prawdopodobnie spowoduje taką samą względną różnicę między grupami leczenia. Pomimo stosunkowo prostej procedury, kilka problemów może czasami uniemożliwić pszczołom miodnym nauczenie się związku zapachu i sacharozy. Poniższe tematy zawierają możliwe zmiany w protokole i niektóre z najczęstszych problemów, które mogą wystąpić podczas kondycjonowania PER.

Rozważania dotyczące liczby i rodzaju prób w protokole kondycjonowania

Każdy protokół uczenia się będzie wymagał wystawienia pszczół na szereg prób w fazie pozyskiwania. Liczba ta zależy w dużej mierze od trudności zadania. Pszczoły miodne mogą nauczyć się prostego zadania po jednej próbie, ale potrzebują co najmniej trzech prób, aby wywołać tworzenie pamięci długotrwałej. Zgodnie z przewidywaniami, pszczoły miodne będą potrzebowały znacznie więcej prób, aby odpowiednio nauczyć się trudnego zadania. Ogólnie rzecz biorąc, istnieje maksymalna liczba prób, po przekroczeniu których pszczoły nie poprawiają już znacząco swojej wydajności. To maksimum zależy od konkretnego zadania, rodzajów i stężeń zapachu oraz stężenia sacharozy.

W przypadku korzystania z więcej niż jednego rodzaju próby z różnymi zapachami, przedstaw różne typy prób w sekwencji pseudolosowej, aby pszczoły nie zapamiętały prostej sekwencji prezentacji zapachów zamiast uczenia się różnic między zapachami³⁶. W tych pseudolosowych sekwencjach musi być równa liczba prób dla każdego z typów zapachu. Ponadto prawdopodobieństwo, że próba jednego rodzaju zapachu jest poprzedzona i następuje po tym samym zapachu lub którymkolwiek z pozostałych zapachów, musi być równe dla wszystkich zapachów. Dla dwóch zapachów – A i B – użyj następującej sekwencji: ABBABAAB. W ośmiu próbach każdy zapach jest prezentowany czterokrotnie. Połącz identyczne sekwencje, aby osiągnąć pożądaną liczbę prób dla każdego zapachu.

Niezależnie od projektu eksperymentu, istnieje kilka parametrów, które muszą pozostać stałe, aby zoptymalizować uczenie się. Nakładanie się na siebie CS i USA ma kluczowe znaczenie dla skutecznego kondycjonowania. Interwał między próbami (Rysunek 1, Tabela 1) musi być stały i zoptymalizowany, ponieważ nieregularność lub zbyt krótki lub zbyt długi odstęp między próbami może znacząco wpłynąć na skuteczność protokołu kondycjonowania¹.

Rozważania na temat znaczenia i projektowania prób testów behawioralnych

Użyteczne mogą być odpowiedzi zarejestrowane podczas "fazy akwizycji" eksperymentu, kiedy CS i US są prezentowane razem. Należy jednak pamiętać, że warunki prezentacji zapachu mogą się różnić w zależności od rodzaju próby. Podczas wzmocnionych prób zapach, po którym następuje sacharoza, jest prezentowany w połączeniu z bodźcem wizualnym (ruchem urządzenia do dostarczania kropelki sacharozy), który może wpływać na reakcję pszczoły. A pszczoły mają tylko trzy sekundy na pokazanie odpowiedzi (cztery sekundy stymulacji zapachem minus jedna sekunda nakładania się na prezentację sacharozy; Rysunek 1). Jeśli eksperyment polega na tym, że pszczoły uczą się rozróżniać dwa zapachy (np. wzmocniony i niewzmocniony), niewzmocniony zapach prezentowany w alternatywnych próbach występuje bez bodźca wizualnego w postaci prezentacji nagrody, a pszczoły mają pełne cztery sekundy na odpowiedź. W związku z tym reakcje na te dwa zapachy nie są w pełni porównywalne podczas akwizycji. W przypadku dowolnego protokołu kondycjonowania nie należy polegać wyłącznie na krzywych akwizycji¹. Aby lepiej ustalić, czego nauczyły się pszczoły, wprowadź serię niewzmocnionych prób testowych, podczas których żaden zapach nie jest wzmacniany, co zapewnia, że testowanie wszystkich bodźców odbywa się w identycznych warunkach.

W zależności od konkretnego celu eksperymentu, testowanie może składać się z pojedynczych prób testowych kondycjonowanego zapachu lub serii prób z kondycjonowanym zapachem lub kombinacją kondycjonowanych i nowych zapachów. Pojedyncza próba testowa kondycjonowanego zapachu zapewnia prosty test, czy pszczoły pamiętają uwarunkowany zapach. Jednak odpowiedź na pierwszą próbę testową może odzwierciedlać poziom motywacji pszczół, a także ich przypomnienie sobie uwarunkowanego zapachu. Do oceny pamięci można również wykorzystać serię prób testowych, albo serię prób wygaszania uwarunkowanego zapachu, albo serię pojedynczych testów kondycjonowanego i jednego lub więcej nowych zapachów. Seria prób wymierania może ocenić, jak silnie pszczoły pamiętają uwarunkowane skojarzenie. Im silniejsze przypomnienie, tym większa liczba prób potrzebnych do wygaszenia uwarunkowanej reakcji. Seria pojedynczych testów kondycjonowanych i nowych zapachów może również ocenić specyficzność pamięci pszczół na temat uwarunkowanego zapachu.

Konieczne jest również kondycjonowanie i testowanie zarówno grupy kontrolnej, jak i leczonej w tych samych punktach czasowych. Porównywanie wydajności pszczół wkrótce po kondycjonowaniu z pszczołami trzymanymi przez dłuższy czas jest problematyczne ze względu na ekspozycję na sacharozę US poprzez karmienie pszczół do sytości. Na przykład spadek wydajności po długich przerwach może być spowodowany zanikiem pamięci lub może być spowodowany zmianami w stanie motywacji i/lub uczeniu się wywołanymi przez niewzmocnioną ekspozycję na USA, co sprawia, że wyniki są niejednoznaczne. W związku z tym wyniki grupy leczonej powinny być zawsze oceniane w stosunku do grupy kontrolnej kondycjonowanej i testowanej w tych samych punktach czasowych.

Stężenie i integralność zapachu

Istnieje kilka sposobów, w jakie stężenie i integralność zapachu (CS) mogą być zagrożone. Najczęstszym problemem związanym z dostarczaniem zapachów jest wyczerpanie wkładów zapachowych w wyniku nadmiernego zużycia (rysunek 2). Wymieniaj wkłady 10-12 razy (co 2 lub 3 próby z grupami 5 pszczół miodnych), aby uniknąć tej pułapki. Bardzo ważne jest również stosowanie świeżych wkładów do prób testowych, ponieważ zużyte wkłady mogą być różnie wyczerpane, a tym samym wykazywać nierównomierne bodźce zapachowe. Innym częstym problemem jest zanieczyszczenie wkładu zapachowego spowodowane używaniem wkładu do więcej niż jednego zapachu bez jego całkowitego oczyszczenia. Brudny lub zanieczyszczony przepływ powietrza może również nieumyślnie wprowadzić dodatkowy bodziec węchowy (filtry z węglem aktywnym mogą zapobiegać zanieczyszczeniu tła). Jest to szczególnie problematyczne w przypadku sprzężenia kondycjonowania PER z pomiarami fizjologicznych reakcji na zapach. Nieszczelne wkłady zapachowe stanowią problem, ponieważ pszczoły miodne są narażone na zapach przed rozpoczęciem próby, co zmniejsza znaczenie bodźca zapachowego. Luźne mocowanie na dopływie powietrza do dostarczania zapachu może skutkować niewielkim lub zerowym dostarczaniem zapachu po otwarciu zaworu, sztucznie zmniejszając reakcję pszczół na zamierzony zapach.

Roztwór sacharozy i bezwarunkowy bodziec (nagroda)

Ilość, stężenie i integralność roztworu sacharozy użytego w USA mają kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Kondycjonowanie jest funkcją ilości i stężenia roztworu sacharozy i wody użytego jako US³⁷. Strzykawki mikrometryczne stosowane w Metodzie 2 pozwalają na bardzo precyzyjną (do 0,2 μl) kontrolę podawania w USA i zalecamy ich stosowanie w obu opisanych metodach. Użycie wykałaczek (metoda 1) jest odpowiednie w okolicznościach, w których drogie strzykawki nie mogą być użyte, takich jak szkolenie dużych grup studentów, praca w terenie lub przy niższych budżetach. Staranne wdrożenie Metody 1 jest w porządku, o ile dotrzymany jest czas z regularną wymianą wykałaczek, aby uniknąć gromadzenia się sacharozy (i dostarczonego stężenia). Jednak przy użyciu wykałaczek trudniej jest dokładnie kontrolować i oszacować ilość i wielkość dostarczonego roztworu amerykańskiego, co jest ważne dla badań kondycjonujących¹. Stężenie sacharozy potrzebne do zapewnienia wystarczającej nagrody, aby utrzymać motywację pszczół do nauki uwarunkowanego skojarzenia, może zależeć od trudności zadania i wewnętrznego stanu pszczół lub pory roku. Trudniejsze zadania wymagają wyższego roztworu sacharozy, aby pszczoły mogły skutecznie nauczyć się tego zadania. Pleśń może gromadzić się w roztworach sacharozy nawet w temperaturze 5 °C, co zagrozi integralności roztworu, wpływając na zdrowie pszczół i postrzeganie nagrody podczas eksperymentu. Najlepiej wymieniać roztwór co kilka dni.

Precyzja, czas i spójność dostaw CS i USA

Najbardziej krytyczną kwestią dotyczącą prawidłowego wdrożenia procedury PER lub jakiejkolwiek procedury kondycjonowania jest precyzja, czas i spójność dostarczania CS i US (rysunek 1). Badacze, którzy są nowicjuszami w procedurze, często nie są precyzyjni w dostarczaniu jednego lub obu bodźców. ISI, które nie pozwalają na nakładanie się CS i USA, skutkują słabą wydajnością kondycjonowania. Sterownik PLC automatyzuje sygnał dźwiękowy dla eksperymentatora, aby dostarczyć sacharozę 3 sekundy po rozpoczęciu dostarczania zapachu. Badacze powinni trzymać kropelkę sacharozy/wody blisko pszczoły w celu szybkiego dostarczenia po sygnale. Procedury te pomagają w uzyskaniu spójnego ISI. Umieszczenie stopera przy arenie kondycyjnej pozwala na wygodne umiejscowienie próby w czasie, a także monitorowanie czasu przebywania pszczół na arenie zarówno przed, jak i po dostarczeniu bodźców. W ten sposób ZIT mogą być względnie spójne, a cała procedura może być prowadzona w kontrolowanym tempie. Zbyt krótkie lub zbyt długie ITI, na przykład krótsze niż 1 minuta, lub zbyt długie, mogą prowadzić do słabej wydajności kondycjonowania¹.

Sezonowy, środowiskowy i kontekstowy wpływ na wydajność pszczół miodnych

Na wydajność pszczół miodnych może mieć znaczący wpływ otoczenie zarówno przed, jak i w trakcie kondycjonowania. Często wahania temperatury i dostępności pożywienia, które pojawiają się wraz ze zmieniającymi się porami roku, zmieniają motywację pszczół do nauki. Kiedy kwitną kwiaty, motywacja pszczół do uczenia się uwarunkowanych skojarzeń w laboratorium spada³⁸. Kiedy kolonia jest zestresowana – z powodu ekstremalnych temperatur, niedoborów pożywienia lub stresu związanego z chorobą – pszczoły wykazują zmniejszenie zdolności uczenia się w środku. Pszczoły miodne trzymane w pomieszczeniu do lotów mogą dobrze się uczyć przez jakiś czas, ale również tam stres związany z chorobami i starzeniem się pogarsza ich zdolność uczenia się z czasem. Kontekst podczas kondycjonowania może również zmniejszyć wydajność pszczół. Wszelkie obce zapachy, ruch i inne bodźce mogą odciągnąć pszczołę od bodźców eksperymentalnych. Aby uniknąć tego problemu, utrzymuj w miarę spójny, uproszczony kontekst wizualny.

Genotyp i doświadczenie wpływają na wydajność PER

Robotnice pszczół miodnych mogą znacznie różnić się wydajnością w dowolnej procedurze kondycjonowania ze względu na specjalizację zadania, genotyp lub inne czynniki środowiskowe²⁰. Dlatego ważne jest, aby w jak największym stopniu ujednolicić rodzaje zwierząt wykorzystywanych w eksperymencie w celu zmniejszenia zmienności międzyosobniczej. W kolonii prowadzonej przez królową krytą w otwartym stanie, co oznacza, że kojarzyła się z wieloma różnymi trutniami, robotnice będą się różnić genotypem ojcowskim. Podłoże genetyczne może prowadzić do dramatycznych różnic w reagowaniu sensorycznym³⁹ i zdolnościach uczenia się²⁹. Wykorzystanie kolonii prowadzonych przez królowe instrumentalnie zapłodnione plemnikami pojedynczych trutni²⁸ zmniejsza tę zmienność międzyosobniczą.

Opisane powyżej protokoły obejmują metodę zbierania robotnic pszczół miodnych z wejścia do gniazda. Jednak te pszczoły miodne różnią się od siebie wiekiem lub zadaniem behawioralnym. Mogą to być młodzi (niedoświadczeni) lub starsi (bardziej doświadczeni) zbieracze. Mogą to być młode pszczoły miodne wykonujące swoje pierwsze loty orientacyjne. Mogą też być pszczołami stróżującymi. Aby zmniejszyć zmienność, oznacz pszczoły szybkoschnącą farbą emaliowaną lub znacznikami, gdy wyłaniają się jako dorosłe osobniki (w celu kontroli wieku) i/lub gdy zaczynają żerować (w celu kontroli doświadczenia). Następnie, kilka dni później, zbierz oznaczone pszczoły w celu kondycjonowania. Robotnice, które są zaangażowane w zachowania pielęgnacyjne, można zebrać z ramek w ulu. Pielęgniarki można pozytywnie zidentyfikować, gdy wkładają głowy do komórki czerwiowej, aby karmić i opiekować się larwą w środku.

Używanie Virgin Queens lub dronów do kondycjonowania PER

Oprócz robotnic pszczół miodnych, dziewicze królowe pszczół miodnych i trutnie mogą być łatwo kondycjonowane w procedurze PER do badań mających na celu opracowanie linii genetycznych pszczół miodnych, które różnią się wydajnością uczenia się²⁸. Dziewicze królowe powinny być zbierane wkrótce po wyjściu z przepoczwarzenia i umieszczane bezpośrednio w uprzęży krępujących bez znieczulenia. Młode, niedojrzałe trutnie zebrane z grzebienia czerwiu wewnątrz kolonii na ogół nie są zmotywowane do nauki. Po rozpoczęciu lotów godowych drony łatwo uczą się zadań PER²⁸. Powinny być zbierane po powrocie z lotu godowego i trzymane przez noc w małej klatce w kolonii używanej do odchowu królowych. Nie próbuj ich zaparzyć dzień przed kondycjonowaniem; Nie przetrwają dobrze w uprzężach z dnia na dzień. Na kilka godzin przed kondycjonowaniem drony można wyjąć z klatek i umieścić w uprzężach krępujących bez znieczulenia.

Wnioski

Ta procedura PER, pod względem metod, stanowi punkt wyjścia do projektowania eksperymentów PER. Większość protokołów PER będzie wymagała, aby opisana procedura została w jakiś sposób zmieniona, aby wdrożyć konkretne cele eksperymentu i uwzględnić wiele grup leczenia. Jest łatwy do wdrożenia. Prawidłowa implementacja wymaga jednak dbałości o szczegóły i praktyki. Po opanowaniu może to być potężna procedura, którą można dodać jako narzędzie badawcze dla kilku podstawowych i stosowanych programów badawczych z różnymi gatunkami owadów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S9378-1KG
Związki zapachowe (na przykład)
1-heksanol	Sigma-Aldrich	471402-100ML	W celu uzyskania dodatkowych przykładów
2-oktanon	Sigma-Aldrich	W280208-800G-K	odpachów, zobacz dowolny z
heptanol	Sigma-Aldrich	51778-5ML	prace dotyczące węchu
geraniol	Sigma-Aldrich	163333-25G	przetwarzanie z
nonanal	Sigma-Aldrich	131210-100ML	Laboratorium Smitha.
Heksan	Sigma-Aldrich	296090-1L
Ciężki olej mineralny	Sigma-Aldrich	330760-1L	Upewnij się, że’bezwonny.
Etanol	Sigma-Aldrich	459836-1L
Fiolki scyntylacyjne	Sigma-Aldrich	Z190535-1PAK	Za pomocą małego wiertła należy wywiercić niewielki otwór w zakrętce probówek.
Uprząż dla pszczół			Wykonane na zamówienie z plastikowych słomek do napojów o średnicy 0,9 cm lub z twardych rurek plastikowych/metalowych.
Taśma naprawcza (duct tape)
Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956-1PAK
Butelki zmywaki	Sigma-Aldrich	Z560847-3EA	Dla 70% etanolu.
Przewody suszarki
WYŁĄCZNIE DLA METODY 1
jednorazowe plastikowe strzykawki o pojemności 20 ml	Cole-Parmer	WU-07945-18
wycinki papieru filtracyjnego o średnicy 15 mm	Sigma-Aldrich	Z274844-1PAK
Szpinki pushpin
Wykałaczki
WYŁĄCZNIE DLA METODY 2
Strzykawka mikrometryczna Gilmont, 0,2 ml	Cole-Parmer	EW-07840-00
końcówka mikrometrycznej strzykawki Gilmont	Cole-Parmer	EW-07841-00
26 G 3/8” igły hipodermiczne z złączem Luer	Fisher Scientific	14-826-10
strzykawki tuberkulinowe 1 ml (plastikowe/szklane)	Sigma-Aldrich	Z181641-1EA LUB Z192090-200EA	Dostępne są szklane strzykawki tuberkulinowe, jednak strzykawki plastikowe są znacznie tańsze i sprawdzą się przy ograniczonej liczbie zastosowań.
Małe ograniczniki gumowe/silikonowe	Cole-Parmer	EW-95702-02	Wykonane z rurek silikonowych o średnicy zewnętrznej 4,8 mm lub z gumowych końcówek tłoków strzykawki o pojemności 1 cc.
[nagłówek]
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
papier filtracyjny 75 x 100 mm	Sigma-Aldrich	Z695106-500EA
Programowalny Sterownik Logiczny Direct Logic 05	Koyo Electronics Industries Co, Ltd
1 mm, 4 mm, & przewód z PVC lub silikonu o średnicy wewnętrznej 6 mm	Cole-Parmer	Różnorodne	Firma Cole-Parmer oferuje szeroki wybór odpowiednich przewodów.
Złączki polipropylenowe & złączki Luer	Cole-Parmer	Różne	Firma Cole-Parmer oferuje szeroki wybór złączy i kształtek do wielu rozmiarów rurek.
Korelowany przepływomierz 65 mm	Cole-Parmer	EW-03216-08	Aluminium z szklanym pływakiem; do cieczy i gazów, z zaworem.
lub
Pompa napowietrzająca do akwarium Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2)	Aquacave	AE-TETRA-300
Elektrozawory z serii LIF do rurek o średnicy wewnętrznej 0,042", konfiguracja „E”	The Lee Company	LFAA1200118H	neopren, stal nierdzewna 430, stal nierdzewna 302, 280 mW
Buzzer piezoelektryczny 12 V DC 70 dB na płytkę PCB	RadioShack	273-074