Artykuł metodologiczny

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

30.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51058

⸱

20 stycznia 2014

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Metody izolowania i przygotowywania próbek jąder Drosophila (żywych i stałych) do obrazowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji są opisane tutaj.

Streszczenie

Drosophila melanogaster to potężny system modelowy, który był szeroko stosowany do wyjaśniania różnych procesów biologicznych. Na przykład badania zarówno żeńskich, jak i męskich linii rozrodczych Drosophila w znacznym stopniu przyczyniły się do obecnego zrozumienia mejozy, a także biologii komórek macierzystych. W literaturze dostępne są doskonałe protokoły izolacji i obrazowania jajników i jąder Drosophila 3-12. W niniejszym artykule opisano metody preparacji i przygotowania jąder Drosophila do analizy mikroskopowej wraz z dołączoną demonstracją wideo. Przedstawiono protokół izolacji jąder z brzucha dorosłych samców i przygotowania preparatów z żywymi tkankami do analizy za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, a także protokół utrwalania i barwienia immunologicznego jąder do analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Techniki te mogą być stosowane w charakterystyce mutantów Drosophila, które wykazują defekty w spermatogenezie, a także w wizualizacji subkomórkowych lokalizacji białek.

Wprowadzenie

Jądra Drosophila są idealnym modelowym systemem do badania wielu procesów biologicznych, w tym regulacji komórek macierzystych, mejozy i rozwoju plemników13-18. Spermatocyty i ich wrzeciona mejotyczne są duże, a zatem wygodne do analizy cytologicznej, a rozluźnione punkty kontrolne cyklu komórkowego podczas spermatogenezy ułatwiają badanie mutacji w genach cyklu komórkowego. Różne typy komórek można zaobserwować w uporządkowanej progresji na całej długości jąder, a każde zakłócenie spermatogenezy może prowadzić do zmian w tym ogólnym układzie. Cechy te, w połączeniu z narzędziami genetycznymi Drosophila, ułatwiły analizę mutacji spermatogenezy21-23.

Etapy spermatogenezy Drosophila zostały dobrze zdefiniowane. Komórki linii rozrodczej, które rozwijają się synchronicznie w torbielach, przechodzą sekwencyjnie przez etapy spermatogenezy wzdłuż jądra. Zarówno podczas podziałów mitotycznych, jak i mejotycznych męskich komórek rozrodczych, cytokineza zachodzi niekompletnie, tak że komórki potomne pozostają połączone mostkami cytoplazmatycznymi znanymi jako kanały pierścieniowe (ryc. 1). Wierzchołkowy wierzchołek jądra zawiera populację zarodkowych komórek macierzystych, która daje początek komórkom spermatogonialnym, które przechodzą cztery podziały mitotyczne z niepełną cytokinezą w celu wytworzenia 16-komórkowych torbieli pierwotnych spermatocytów. Po premejotycznej fazie S pierwotne spermatocyty wchodzą w G2, przedłużony okres wzrostu ~90 godzin, podczas którego objętość komórkowa wzrasta ~25-krotnie. Postęp przez mejozę I i mejozę II powoduje powstawanie odpowiednio 32-komórkowych torbieli wtórnych spermatocytów i 64-komórkowych torbieli haploidalnych spermatidów. Niedojrzałe, okrągłe plemniki przechodzą rozległą przebudowę komórkową w celu wytworzenia dojrzałych plemników. Komórki postmejotyczne, w szczególności wiązki wydłużających się i dojrzałych spermatydów, zajmują większość objętości jądra.

Pomyślny transport funkcjonalnego plemnika do samic muszki wymaga koordynacji między różnymi częściami męskiego układu rozrodczego, który składa się z kilku sparowanych struktur (jądra, pęcherzyki nasienne i gruczoły dodatkowe) oraz pojedynczego przewodu wytryskowego (Rysunek 2). Plemniki są wytwarzane w jądrach i przechowywane w pęcherzykach nasiennych aż do kopulacji24. Gruczoły dodatkowe zawierają komórki wydzielnicze, które wytwarzają płyn nasienny. Plemniki migrujące z pęcherzyków nasiennych są mieszane z płynem nasiennym w przewodzie wytryskowym, który jest połączony zarówno z pęcherzykami nasiennymi, jak i gruczołami dodatkowymi. Ta mieszanina nasienia i płynu nasiennego jest ostatecznie wypompowywana z samca do pochwy samicy przez opuszkę wytryskową znajdującą się na tylnym końcu męskiego brzucha25. Białka w płynie nasiennym są niezbędne do długotrwałego przechowywania plemników w wyspecjalizowanych narządach zwanych spermatekami w drogach rozrodczych samic Drosophila 26.

Doskonałe metody izolacji jąder Drosophila i wizualizacji komórek na różnych etapach spermatogenezy są dostępne w literaturze naukowej3-12. W niniejszym dokumencie uzupełniamy ten zasób wiedzy, prezentując przykłady tych protokołów wraz z towarzyszącą demonstracją wideo. Protokół przygotowania żywych próbek jąder do mikroskopii z kontrastem fazowym opiera się na wcześniej opisanej metodzie27. Protokół wiązania formaldehydu i barwienia immunologicznego jąder również opiera się na wcześniej opisanej metodzie28. Opisane w niniejszym dokumencie podejścia zostały wykorzystane w wielu badaniach spermatogenezy Drosophila (na przykład do oceny roli dyneiny, silnika mikrotubul skierowanego na koniec ujemny, podczas spermatogenezy Drosophila).

Oprócz podstawowych protokołów, znajdują się sugestie dotyczące różnicowania sekcji tak, aby wzbogacić o spermatogonię, spermatocyty lub dojrzałe plemniki. Opisano różne metody przetwarzania jąder, tak aby torbiele albo pozostały nienaruszone, albo zostały przerwane w razie potrzeby. Zaletą stosowania jąder Drosophila jako systemu modelowego jest to, że w porównaniu z oocytami i zarodkami Drosophila, przeciwciała i barwniki mogą łatwo przenikać do komórek po ich rozproszeniu z jąder i wymagana jest mniejsza liczba etapów mycia; Dzięki temu protokoły mogą być wykonywane w stosunkowo krótkim czasie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Sekcja jąder

  1. Znieczulić muchy w butelce lub fiolce za pomocą strumienia CO2 i przenieść do podkładki na muchy.
  2. Sortuj muchy pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą małego pędzla i zbierz odpowiednią liczbę (w zależności od eksperymentu) samców Drosophila o pożądanych genotypach. Młode samce (0-2 dni) są idealne do badania komórek we wcześniejszych stadiach spermatogenezy (np. spermatogonia, spermatocyty i wczesne plemniki postmejotyczne), natomiast nieco starsze samce (2-5 dni) są idealne do badania komórek w końcowych stadiach spermatogenezy (w szczególności dojrzałych plemników).
  3. Użyj kleszczy, aby usunąć skrzydła z każdej muchy (aby zapobiec unoszeniu się much w płynie podczas sekcji).
  4. Dodać ~500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4; PBS) w kropli do pokrytego silikonem naczynia preparacyjnego na czarnym tle. Inne roztwory wodne są z powodzeniem stosowane do rozwarstwiania jąder3.
  5. Skieruj kleszcze w stronę przedniej części muchy, chwyć ją za klatkę piersiową i zanurz w kropli PBS. Podczas oglądania przez mikroskop preparacyjny użyj innej pary kleszczy, aby chwycić i pociągnąć zewnętrzne narządy płciowe (ciemnobrązowa struktura znajdująca się na tylnym końcu brzusznego brzucha) do tyłu, aż odczepią się od brzucha. W większości przypadków jądra, pęcherzyki nasienne i gruczoł dodatkowy zostaną usunięte z jamy brzusznej wraz z zewnętrznymi narządami płciowymi; Jeśli nie, włóż pojedynczą parę kleszczy do brzucha i wydłub jądra.
  6. Oddziel jądra od gruczołu dodatkowego i zewnętrznych narządów płciowych za pomocą dwóch par kleszczy w kropli PBS (ryc. 2). Jądra typu dzikiego można łatwo odróżnić od sąsiednich białych tkanek po ich żółtym kolorze. Przejdź od razu do kroku 2.
  7. Aby wyizolować jądra od samców pharate (tj. zamkniętych w opakowaniu poczwarki), należy najpierw wykonać dodatkowy krok, który polega na usunięciu muchy z obudowy poczwarki; ten krok został wcześniej opisany w innym miejscu31. Kontynuuj sekcję jak w przypadku jąder dorosłych, zaczynając od kroku 1.2.
  8. Aby wyizolować jądra od samców larwalnych, należy przeprowadzić modyfikację protokołu izolacji jajników larw Drosophila 32. Krótko mówiąc, larwy męskie można odróżnić od larw żeńskich po obecności pary dużych, przezroczystych, owalnych struktur (jąder larw) osadzonych w tylnej jednej trzeciej ciała tłuszczowego. Aby wyizolować jądra larw, należy częściowo otworzyć larwę samca, aby odizolować jądra i otaczające je ciało tłuszczowe od brzucha, jak opisano w przypadku izolacji jajników larw. Przejdź natychmiast do kroku 2 opisanego w niniejszym dokumencie protokołu; Jądra mogą być później usunięte z ciała tłuszczowego tuż przed zamontowaniem (kroki 2.3 lub 3.14), jak opisano dla jajników32.

2. Przygotowanie próbki i obrazowanie na żywo

  1. Użyj kleszczy, aby delikatnie umieścić 2-3 pary jąder w kropli 4-5 ml PBS na kwadratowym szklanym szkiełku nakrywkowym. Należy pamiętać, że stosunek liczby jąder do objętości PBS może wymagać dostosowania: zbyt dużo płynu uniemożliwi prawidłowe rozprzestrzenianie się komórek po zgnieceniu, podczas gdy zbyt mało płynu spowoduje pękanie komórek po zgnieceniu. Opcjonalnie: Użyj silikonowanych szkiełek nakrywkowych, aby zminimalizować przyleganie tkanki do szkiełka nakrywkowego w kroku 3.2.
  2. Użyj pary kleszczy, aby rozerwać każde jądro w odpowiedniej pozycji, tak aby zmaksymalizować obecność pożądanych typów komórek linii rozrodczej w preparacie (należy pamiętać, że zawartość jądra w większości wydostanie się z rozdartego obszaru na szkiełko podczas etapu zgniatania). Aby wzbogacić spermatogonię i spermatocyty, rozerwij jądro przylegające do jego wierzchołka (poziom 1, ryc. 2B). Aby wzbogacić spermatocyty i spermatydy, rozerwij jądro w pozycji lekko podstawowej do poziomu 1 (poziom 2, ryc. 2B). Aby wzbogacić o bardziej dojrzałe komórki linii rozrodczej, rozerwij jądro bliżej miejsca, w którym zaczyna się krzywizna (poziom 3, ryc. 2B).
  3. Delikatnie umieścić szkiełko mikroskopowe na szkiełku nakrywkowym, aby zmiażdżyć jądra; nie należy wywierać nacisku ręcznie, ponieważ ciężar samego szkiełka nakrywkowego jest wystarczający do uzyskania prawidłowo zgniecionej próbki. Staraj się unikać zatrzymywania pęcherzyków powietrza. Opcjonalnie: Użyj szkiełek mikroskopowych pokrytych poli-L-lizyną, aby zwiększyć przyleganie tkanki do szkiełka w kroku 3.2.
  4. Preparat należy natychmiast zużyć (najlepiej w ciągu 15 minut od przygotowania) w celu obserwacji żywych komórek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym; w przypadku muszek transgenicznych z ekspresją fluorescencyjnie znakowanych białek w jądrach, żywe komórki można na tym etapie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Alternatywnie można przystąpić do utrwalania i barwienia przeciwciałami (Protokół 3).
  5. Delikatnie odsączyć nadmiar płynu spod szkiełka nakrywkowego za pomocą chusteczki czyszczącej, aby umożliwić spłaszczenie preparatu, aż komórki rozrodcze będą wyraźnie ostre.

3. Utrwalanie formaldehydu i barwienie przeciwciał

  1. Zamroź zatrzaskowo każde szkiełko zawierające zgniecione jądra (z Protokołu 2) za pomocą pary metalowych szczypiec, aby zanurzyć je na krótko w ciekłym azocie (aż ciekły azot przestanie bulgotać).
  2. Natychmiast usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki.
  3. Użyj metalowych szczypiec, aby przenieść szkiełka do wstępnie schłodzonego szklanego stojaka na szkiełka wypełnionego lodowatym 95% etanolem (klasa spektrofotometryczna, bez metanolu). Przechowywać w temperaturze -20 °C przez 10 min.
  4. Użyj metalowych szczypiec, aby przenieść szkiełka do szklanego stojaka wypełnionego 4% formaldehydem w PBS plus 0,1% Triton X-100 (PBS-T). Przechowywać w temperaturze pokojowej przez 7 minut.
  5. Użyj metalowych szczypiec, aby przenieść szkiełka do szklanego stojaka na szkiełka wypełnionego PBS. Myć szkiełka w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz 1x. Wszystkie mycia należy wykonać, wylewając roztwór do szklanego stojaka na szkiełka (tj. wylewając go) i zastępując go świeżym roztworem.
  6. Wyrzuć PBS i zanurz szkiełka w PBS-T na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby przepuszczalność błon komórkowych.
  7. Myć szkiełka w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz 2 razy.
  8. Etap blokowania (opcjonalnie): Zanurz szkiełka w PBS plus 1% BSA na 45 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego narysuj okrąg na szkiełku wokół zgniecionej tkanki (łatwo widocznej gołym okiem) w celu ograniczenia roztworów przeciwciał (dodanych w krokach 3.9 i 3.11). Tkanka powinna być utrzymywana w wilgoci przez cały czas podczas wykonywania barwienia immunologicznego.
  10. Dodaj 30-40 ml przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczonego w PBS-T, 1:400 do 1:50, w zależności od przeciwciała) do tkanki w okręgu. Jeśli przeprowadzono blokowanie, rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w PBS-T plus 1% BSA. Przeciwciało anty-gamma-tubulinowe (do barwienia centrosomów na rycinie 4) rozcieńczono w stosunku 1:100. Inkubować w wilgotnej, ciemnej komorze (np. zamkniętym plastikowym pudełku z wilgotnymi ręcznikami papierowymi) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  11. Myć szkiełka w PBS przez 5 min w temperaturze pokojowej 3x. Jeśli wykonano blokowanie, umyć dwa razy w PBS-T i raz w PBS (po 5 minut w temperaturze pokojowej).
  12. Dodać 30-40 ml przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem (rozcieńczonego w stosunku 1:400 w PBS) do tkanki i inkubować w ciemności przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
  13. Myć szkiełka w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz 2 razy.
  14. Dodać 30-40 ml roztworu DAPI (0,2 mg/ml w PBS) do tkanki w okręgu.
  15. Delikatnie umieść szklaną osłonę na chusteczce, uważając, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, ostrożnie przesuwaj po szkiełku nakrywkowym, nie niszcząc dyni, aż pęcherzyki wydostaną się z boków szkiełka nakrywkowego.
  16. Użyj chusteczki czyszczącej, aby usunąć nadmiar DAPI z krawędzi szkiełka.
  17. Przymocuj szkiełko korekcyjne do szkiełka za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci.
  18. Użyj tego preparatu w ciągu najbliższych 3-4 godzin, aby wyświetlić komórki barwione immunologicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W przypadku długotrwałego przechowywania szkiełek (do co najmniej kilku tygodni) należy używać twardych nośników na bazie glicerolu z DAPI i przechowywać szkiełka w temperaturze -20 °C.
  19. Alternatywnie, utrwal próbki w metanolu zamiast w formaldehydzie (w zależności od antygenu). Po wykonaniu całego protokołu w kroku 3.2, zanurz szkiełka ze zgniecionymi jądrami w metanolu na 10 minut w temperaturze -20 °C i przejdź do kroku 3.5 i dalej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykład prawidłowo wypreparowanej pary narządów rozrodczych samca Drosophila przedstawiono na Rysunku 2A. Jądra usunięte z odwłoka dorosłego samca muchy są zazwyczaj połączone z przewodem wytryskowym (brązowy, Rysunek 2A') oraz parą gruczołów dodatkowych (zielone, Rysunek 2A') za pomocą pary pęcherzyków nasiennych (niebieskie, Rysunek 2A'). Aby oddzielić jądra od większości towarzyszącej tkanki somatycznej, należy odciąć i usunąć przewód wytrys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż jądra much typu dzikiego można łatwo zidentyfikować ze względu na ich żółty kolor (w przeciwieństwie do sąsiednich białych tkanek), jądra białych zmutowanych much są białe, a zatem czasami można je pomylić z jelitami. Większość szczepów transgenicznych, które zazwyczaj znajdują się na białym tle, ma również białe jądra, ponieważ gen mini-biały znajdujący się w elementach P nie sprzyja akumulacji pigmentu w jądrach. Kiedy jądra Drosophila nie mogą być rozróżniane po kol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Michaelowi Andersonowi za ustanowienie w laboratorium Lee tych akceptowanych metod badania spermatogenezy z fachową poradą Karen Hales. H. Oda i Y. Akiyama-Oda hojnie dostarczyli stado much γ-tubulina-GFP. Praca ta była wspierana przez grant NIH R01 dla L.A.L. (GM074044).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SylgardWorld Precision InstrumentsSYLG184Dwuczęściowy elastomer silikonowy do wytwarzania pokrytego silikonem naczynia preparacyjnego z szalki Petriego Kimax
długopis PAPFisher ScientificNC9888126Ted Pella #22309
Bezbarwny ochraniacz do paznokciWet n Wild7780235001
ProLong Gold Antifade z technologiami DAPILifeP36931
Mysie przeciwciało anty-gamma-tubulinowe (klon GTU-88)Sigma-AldrichT6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch115-165-003
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
EtanolFisher ScientificAC61511-0040
MetanolFisher ScientificA412-4
16% FormaldehydThermo Fisher Scientific28908
SigmacoteSigma-AldrichSL2Stosować zgodnie ze wskazówkami producenta do silikonowania szkiełek nakrywkowych
DAPISigma-AldrichD-95420,5 mg/ml w 75% etanolu; przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C
NaClResearch Products International Corp.S23020
Na2HPO4Sigma-AldrichS9763
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
Delikatne wycieraczki KimwipesFisher ScientificS47299
BSAResearch Products International Corp.A30075Szklany
słoik do barwienia z koplinyMikroskopia elektronowa Sciences70315
Pojedyncze matowe szkiełka mikroskopoweCorning2948-75X25
Szkiełka mikroskopowe pokryte poli-L-lizynąPolysciences, Inc.22247-1Opcjonalnie (w celu wymiany nieobrobionych szkiełek mikroskopowych)
Kwadratowa szklana osłonaCorning2865-22
ŻyletkiFisher Scientific12-640
Kimax szalka PetriegoFisher ScientificS31473Kimble #23060 10015
KleszczeDumont52100-51SWzór 5 Stereoskop
INOX Stemi 2000-CSObiektyw Carl Zeiss
Eclipse 80iNikon
Plan-Fluor 40XNikon
AxiophotCarl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X ObiektywCarl Zeiss
klasy biologii molekularnej, zakrętka EMD

Bibliografia

  1. McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
  3. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
  4. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
  5. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
  6. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
  7. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
  8. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
  9. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
  10. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
  11. Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
  12. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
  13. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  14. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  15. Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
  16. Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
  17. McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
  18. Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
  19. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
  20. Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
  21. Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
  22. Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
  23. Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
  24. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
  25. Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
  26. Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
  27. Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
  28. Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
  29. Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
  30. Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
  31. Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
  32. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
  33. Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
  34. Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
  35. Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
  36. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  37. White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
  38. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
  39. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
  40. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  41. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
  42. Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
  43. Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza spermatogenezysekcja j dermikroskopia fazokontrastowabarwienie immunofluorescencyjneprzygotowanie ywej tkankiprzygotowanie utrwalonej tkankitypy kom rek linii zarodkowejlokalizacja bia ektechniki mikroskopowe

Powiązane artykuły