Analiza apoptozy w zarodkach danio pręgowanego za pomocą immunofluorescencji całego wierzchowca w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3

Podsumowanie

Pewne zaburzenia genetyczne lub narażenie na toksyny mogą zakłócić normalne procesy rozwojowe, prowadząc do śmierci określonych typów komórek. Analiza aktywowanej kaspazy 3 metodą immunofluorescencji całej góry w zarodkach danio pręgowanego ujawnia specyficzną dla etapu i tkanki lokalizację komórek specyficznie ulegających apoptozie.

Streszczenie

Immunofluorescencja w całości do wykrywania aktywowanej kaspazy 3 (test Casp3) jest przydatna do identyfikacji komórek ulegających wewnętrznej lub zewnętrznej apoptozie w zarodkach danio pręgowanego. Analiza całościowa dostarcza informacji przestrzennych w odniesieniu do specyficzności tkankowej komórek poddanych apoptozie, chociaż ostatecznie wymagane jest cięcie i/lub koznakowanie, aby wskazać dokładne typy komórek ulegających apoptozie. Test Casp3 z całą mocowaniem jest zoptymalizowany pod kątem analizy utrwalonych zarodków między etapem 4-komórkowym a 32 godzinami po zapłodnieniu i jest przydatny w wielu zastosowaniach, w tym do analizy mutantów i morfantów danio pręgowanego, nadekspresji zmutowanych i dzikich mRNA oraz narażenia na chemikalia. W porównaniu z barwieniem pomarańczą akrydynową, które może zidentyfikować komórki apoptotyczne w żywych zarodkach w ciągu kilku godzin, testy Casp3 i TUNEL trwają znacznie dłużej (2-4 dni). Jednak ze względu na dynamiczną naturę tworzenia i klirensu komórek apoptotycznych, analiza utrwalonych zarodków zapewnia dokładne porównanie komórek apoptotycznych w wielu próbkach w określonych punktach czasowych. Stwierdziliśmy również, że test Casp3 jest lepszy od analizy komórek apoptotycznych za pomocą testu TUNEL z całą mocą pod względem kosztów i wiarygodności. Ogólnie rzecz biorąc, test Casp3 stanowi solidny, wysoce powtarzalny test, w którym można analizować komórki apoptotyczne we wczesnych zarodkach danio pręgowanego.

Wprowadzenie

Tutaj opisujemy, jak przeprowadzić immunofluorescencję całej góry we wczesnych zarodkach danio pręgowanego w celu wykrycia komórek z aktywowaną kaspazą 3 (zwaną dalej testem Casp3). Ogólnym celem tej metody jest określenie względnej obfitości i lokalizacji komórek apoptotycznych u danio pręgowanego od etapu 4-komórkowego do 32 godzin po zapłodnieniu (hpf).

Zarówno wewnętrzne (za pośrednictwem mitochondriów), jak i zewnętrzne (za pośrednictwem receptora śmierci) szlaki apoptotyczne pośredniczą w śmierci komórki poprzez aktywację kaskady^{kaspazy 1-2}. Kaspazy inicjujące zwykle istnieją jako monomery w komórce, a po zrekrutowaniu do platform specyficznych dla szlaku w odpowiedzi na sygnał proapoptotyczny stają się aktywowanymi dimerami. Aktywowane kaspazy inicjujące (kaspaza 9; szlak wewnętrzny i kaspaza 8; szlak zewnętrzny) następnie celują w predimeryzowane, nieaktywne kaspazy efektorowe (kaspaza 3, 6, 7) w celu rozszczepienia w celu utworzenia aktywnych heterotetramerów. Aktywne kaspazy efektorowe następnie rozszczepiają cele komórkowe specyficznymi resztami tetrapeptydowymi, aby zainicjować specyficzne zniszczenie proteolityczne, którego kulminacją są ultrastrukturalne cechy apoptozy, takie jak kondensacja chromatyny i pęcherzenie błony, oraz sygnały powierzchniowe komórki, które pośredniczą w pakowaniu komórki w celu pochłonięcia przez fagocyty w sposób immunologiczny. Uważa się, że w komórkach ssaków aktywne kaspazy efektorowe wykonują większość zdarzeń rozszczepienia komórek, które pośredniczą w apoptozie zarówno poprzez wewnętrzne, jak i zewnętrzne szlaki^1-2. Opisany tutaj protokół wykorzystuje przeciwciało, które specyficznie wiąże rozszczepioną, heterotetrameryczną formę kaspazy 3, ale nie nieaktywny dimer kaspazy 3.

Jedną z zalet testu Casp3 jest możliwość wizualizacji przestrzennego rozmieszczenia komórek apoptotycznych w kontekście całego zarodka. W związku z tym interesujące tkanki mogą być badane pod kątem obecności komórek apoptotycznych, a jeśli istnieją przeciwciała lub fluorescencyjne szczepy transgeniczne, które znakują określone typy komórek, możliwe jest określenie dokładnej tożsamości komórek poddawanych apoptozie poprzez eksperymenty ze wspólnym znakowaniem. Kilka grup z powodzeniem wykorzystało aktywowaną kaspazę 3 jako marker apoptozy w zarodkach danio pręgowanego (np. ^3-7). Dodatkowe techniki całego montażu do identyfikacji komórek apoptotycznych w zarodkach danio pręgowanego obejmują test TUNEL⁸ i barwienie pomarańczą akrydynową (AO)⁹. Zastosowaliśmy wszystkie trzy metody do identyfikacji komórek apoptotycznych w zarodkach danio pręgowanego^4,6,10.

TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) barwienie wykorzystuje enzym Terminal deoxynucleotydylotransferazy (TdT), który jest używany do dodawania nukleotydów do 3' hydroksylowych końców DNA podczas rekombinacji VDJ w limfocytach¹¹. TdT dodaje biotynę dUTP do wolnych grup hydroksylowych 3' w DNA, które występują obficie przede wszystkim w komórkach apoptotycznych. Tkanki są następnie wystawiane na działanie peroksydazy awidyny, a komórki apoptotyczne są barwione po dodaniu substratu 3-amino-9-etylokarbazolu. Test TUNEL wykorzystano do przeprowadzenia obszernej analizy komórek apoptotycznych podczas rozwoju embrionalnego w tkankach danio pręgowanego typu dzikiego¹². Podobnie jak w przypadku testu Casp3, test TUNEL przeprowadza się tylko na utrwalonych zarodkach. Odkryliśmy, że test Casp3 jest bardziej spójny i tańszy niż test TUNEL.

Barwienie AO zostało po raz pierwszy opisane jako mechanizm specyficznej identyfikacji komórek apoptotycznych u Drosophila¹³. AO barwi zarówno cytoplazmę, jak i jądro komórek apoptotycznych, ale nie nekrotycznych. AO jest dobrze znany z wiązania kwasów nukleinowych¹⁴ i uważa się, że to odpowiada za barwienie jądrowe. Jednak AO nie barwi chromatyny żywych komórek; Wydaje się raczej, że specyficzne zmiany zachodzące podczas apoptozy pozwalają na interkalację i barwienie skondensowanych jąder apoptotycznych¹⁵. Barwienie AO ma tę zaletę, że umożliwia szybką analizę apoptotyczną żywych zarodków. Jednak dokumentacja próbek musi być wykonywana szybko ze względu na dynamiczny charakter tworzenia i klirensu komórek apoptotycznych. Z drugiej strony, jednoczesna fiksacja wszystkich próbek zapewnia obraz apoptozy w danym momencie we wszystkich próbkach i nie podlega tej zmiennej czasowej. W związku z tym, że analiza komórek apoptotycznych za pomocą barwienia AO nie jest zgodna z utrwalonymi zarodkami, test Casp3 jest preferowany w eksperymentach, w których wymagana jest dokumentacja fotograficzna i/lub ocena ilościowa na wielu próbkach.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj 500 ml 1x PBST (1x PBS, 0,1% Tween-20) i sterylizuj przez filtr. 1x PBST może być przechowywany w temperaturze pokojowej (RT) przez czas nieokreślony, o ile nie ma oznak rozwoju bakterii.
2. UWAGA: Przygotuj 50 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w kapturze chemicznym, rozpuszczając sproszkowany PFA w 1x PBS w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę i przykrywając folią aluminiową w celu ochrony przed światłem. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc lub w temperaturze -20 °C przez 2 lata.
3. Przygotuj 500 ml świeżego 1x PDT (1x PBST, 0,3% Triton-X, 1% DMSO). 1x PDT może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
4. Przygotować 50 ml buforu blokującego (1x PBST, 10% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca, 2% albumina surowicy bydlęcej). Utworzyć 10 ml podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku. Po rozmrożeniu bufor blokujący może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 48 godzin.
5. Przygotować 100 ml 4% metylocelulozy, podgrzewając 30 ml wody do temperatury 80 °C. Dodać 4 g metylocelulozy do gorącej wody i wymieszać za pomocą mieszadła na mieszadle w temperaturze pokojowej. Dokładne mieszanie trwa zwykle od 4 godzin do nocy. Dodać pozostałą część (niepodgrzanej) wody i mieszać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Sklep w RT.
6. W przypadku stosowania zarodków w stadium między stadiami pąków ogonowych a 32 hpf, należy przygotować 50 ml pronazy w dawce 10 mg/ml i przechowywać przez okres do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C. W przeciwnym razie przechowywać w 10 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
7. Umieścić 50 ml 100% metanolu w temperaturze -20 °C.
8. Przygotuj 60x wodę jajeczną, rozpuszczając 280 g rozpuszczalnej soli morskiej oceanicznej w 2 litrach wody destylowanej (jak w Westerfield¹⁶). Przygotuj 1x wodę jajeczną, rozcieńczając 60x bulion w wodzie dejonizowanej.

2. Przygotowanie zarodków

1. Zbierz zarodki danio pręgowanego na szalce Petriego w 1x wodzie z jajami między stadium 4-komórkowym a 32 hpf.
   1. W przypadku zarodków między etapem 4-komórkowym a pączkiem ogonowym przejdź do kroku 2.2.
   2. W przypadku zarodków między stadium pąka ogonowego a 32 hpf należy usunąć kosmówkę, dodając 100 μl 10 mg/ml pronazy do zarodków w 10 ml 1x wody jajecznej.
   3. Uwaga: Aktywność pronazy może być zmienna między partiami. W związku z tym końcowe stężenie pronazy powinno być zoptymalizowane pod kątem dechorionacji po uzyskaniu nowych partii.
      1. Pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
      2. Wlej wodę z jajka / roztwór pronazy do odpadów i powoli dodaj z powrotem świeżą 1x wodę jajeczną.
      3. Opłucz 2x, wylewając istniejącą wodę z jaj (i swobodnie pływającą choriony) i delikatnie dodaj nową wodę jajeczną.
      4. Uwaga: W tym momencie należy usunąć większość chorionów. Za pomocą pipety transferowej delikatnie zasysaj zarodki w górę i w dół, aż do usunięcia pozostałych kosmówek.
2. Przenieś do 40 zarodków do probówki o pojemności 1,5 ml. Spłukać 2 razy 1 ml 1x PBST.  
3. Usunąć PBST, pozostawiając płyn tuż nad zarodkami (w probówce powinno pozostać około 100 μl objętości). Dodać 1 ml 4% PFA. Ułożyć probówki na boku (tak, aby zarodki były rozłożone wzdłuż probówki) w pojemniku o odpowiedniej wielkości ułatwiającym transport (np. na szalce Petriego lub w pudełku z pipetami) i umieścić na delikatnym bujaku w temperaturze 4 °C przez noc lub do tygodnia.  
   1. W przypadku zarodków między stadiami 4-komórkowymi a pąkiem ogonowym należy ręcznie zdechorionować utrwalone zarodki za pomocą kleszczy.

3. Procedura immunofluorescencji

1. Umieść probówki w stojaku na probówki tak, aby wszystkie zarodki opadły na dno probówki. Usunąć PFA (do odpowiedniego pojemnika na odpady) pozostawiając płyn tuż nad poziomem zarodków. Po utrwaleniu (etap 2.3) zarodki nigdy nie powinny być wystawiane na działanie powietrza, aby zapobiec barwieniu przeciwciałami tła.
2. Dodaj kroplami 1 ml lodowatego 100% metanolu (do przepuszczalności). Zarodki są teraz kruche po utrwaleniu i należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec ich przewracaniu się w probówce podczas wszystkich kolejnych wyjmowania/dodawania płynów. Połóż probówki na bokach i umieść w temperaturze -20 °C na 2 godziny. Alternatywnie zarodki można pozostawić w temperaturze -20 °C na okres do 24 godzin.
3. Umieść probówki w stojaku, aby zebrać zarodki na dnie probówki. Usuń metanol, pozostawiając płyn tuż nad poziomem zarodków.
4. Ostrożnie dodać 1 ml 1x PDT. Usuń PDT i dodaj 1 ml świeżego 1x PDT. Połóż rurki na bokach i delikatnie kołysz się w temperaturze RT przez 30 minut. Usuń PDT i powtórz 30-minutowe mycie świeżym PDT.
5. Usuń PDT, aż płyn znajdzie się tuż powyżej poziomu zarodków, i dodaj 500 μl buforu blokującego.
   1. Połóż zarodki na boku w pojemniku transportowym i upewnij się, że zarodki nie przemieszczają się dalej niż 2/3 długości probówki. W przeciwnym razie zarodki zostaną uwięzione w wieczku probówki i na zewnątrz płynu.  
   2. Ostrożnie umieść pojemnik transportowy z rurkami na bardzo delikatnym bujaku w RT na 1 godzinę.
6. Ustaw probówki pionowo w stojaku na probówki i otwórz wszystkie probówki, aby sprawdzić, czy zarodki nie utknęły na pokrywie. W przypadku probówek z zarodkami na pokrywce zamknij górną część i delikatnie kołysz rurką ręcznie, aby wprowadzić wszystkie zarodki z powrotem do płynu.
7. Dodać 1 μl przeciwciała przeciwko kaspazie 3 (rozcieńczenie 1:500).
   1. Jeśli przeprowadzasz eksperyment ze wspólnym znakowaniem, po prostu dodaj odpowiednie rozcieńczenie drugiego przeciwciała niepochodzącego od królika oprócz przeciwciała antyaktywowanego kaspazy 3.
8. Ostrożnie ułóż zarodki na boku i delikatnie kołysz w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Alternatywnie zarodki można inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
9. Postaw probówki w stojaku na tuby. Usunąć roztwór bloku/przeciwciała. Dodać 1 ml 1x PDT. Pamiętaj, aby ręcznie odwrócić probówkę, aby zebrać wszelkie zarodki przyklejone do wieczka probówki. Następnie otwórz wszystkie probówki, aby upewnić się, że wszystkie zarodki zostały usunięte z pokrywy.
10. Powtórz krok 3.4.
11. Powtórz kroki 3.5-3.10, ale zastąp przeciwciało antyaktywowane kaspazą 3 odpowiednim rozcieńczeniem przeciwciała sprzężonego z fluoroforem przeciwko królikowi, które pochłania światło niebieskie i emituje światło zielone. Można jednak użyć tutaj dowolnego przeciwciała sprzężonego z fluoroforem o preferowanych przez użytkownika widmach absorpcji/emisji. Po dodaniu przeciwciała drugorzędowego ważne jest, aby trzymać zarodki w ciemności przez pozostałą część testu. Przykryj pojemnik transportowy folią aluminiową podczas etapów inkubacji, ale nie martw się o ekspozycję na światło podczas wymiany.
    1. Jeśli wykonujesz eksperyment ze wspólnym znakowaniem, po prostu dodaj odpowiednie rozcieńczenie komplementarnego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem na tym etapie.
    2. Uwaga: Jeśli użytkownik chce koznakować aktywną kaspazę 3 z komórkami wykazującymi ekspresję Gfp, wówczas po króliczym przeciwciałie antyaktywnym kaspazie 3 powinno nastąpić drugorzędowe przeciwciało anty-królicze niefluorescencyjne przeciwko królicowi, a po przeciwciałie anty-GFP powinno nastąpić fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe niekrólicze o zielonym fluorze. Wyeliminuje to zamieszanie, jeśli część fluorescencji Gfp pozostanie widoczna po utrwaleniu zarodków.

4. Analiza komórek apoptotycznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

1. Analizuj zarodki w 1x PDT na małej szalce Petriego lub szklanej płytce punktowej pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu odpowiedniego filtra światła. Jeśli kontrole pozytywne mają jasną fluorescencję z minimalnym tłem, przejdź do kroku 4.2. (Jeśli nie, zapoznaj się z sekcją dotyczącą rozwiązywania problemów w Dyskusji i powtórz protokół z nowymi zarodkami.) Zarodki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w 1x PDT przez okres do 48 godzin.
2. Wlej 4% metylocelulozy do szalki Petriego o średnicy 3,5 cm, tylko tyle, aby przykryć dno naczynia. Alternatywnie można zastosować szklaną płytkę punktową lub szkiełko wgłębieniowe z dużą kroplą metylocelulozy w wgłębieniu. Ostrożnie zassać zarodki z dna probówki do czystej pipety transferowej i przenieść na płytkę Petriego w celu wizualizacji.
3. Zorientuj interesujący zarodek do dokumentacji za pomocą sondy kątowej. Prawdopodobnie wystąpi pewna zmienność między zarodkami z tej samej próbki, dlatego ważne jest, aby wykonać zdjęcia, które reprezentują intensywność fluorescencji i wzór obserwowany w większości zarodków z tej próbki. Dokumentację należy wykonać w ciągu 48 godzin od zakończenia testu, aby zapobiec akumulacji niespecyficznej fluorescencji tła. Pozostałe 4% metylocelulozy nie będzie zakłócać kolejnych reakcji PCR wymaganych do genotypowania zarodków.
4. Uwaga: Aby pomóc w unieruchomieniu zarodka pod pewnym kątem, pomocne jest delikatne dociśnięcie zarodka do dna naczynia, tak aby żółtko lub inna część zarodka (w zależności od pożądanego widoku) spoczywała na dnie naczynia. Następnie użyj sondy, aby przesunąć zarodek lub bezpośrednio otaczającą metylocelulozę (jednocześnie wizualizując pod mikroskopem), aby uzyskać pożądany kąt do dokumentacji.

Wyniki

Test Casp3 dostarcza wyraźnych dowodów na obecność komórek apoptotycznych od stadium 4 komórek do 32 hpf. Rysunek 2A wykazuje, że wstrzyknięcie do embrionów wysokich stężeń mRNA kodującego silne proapoptotyczne białka z grupy bh3-only, takie jak Bim lub Noxa, prowadzi do szybkiego powstania aktywnej kaspazy 3 do stadium 4 komórek. W konsekwencji śmierć embrionów następuje w ciągu 1 h⁴Należy zauważyć, że intensywność fluorescencji jest umiarkowana, jednak wyniki są jednoznaczne. W późniejszych etapach intensywność fluorescencji jest silniejsza. Na przykład, Rycina 2B wykazuje jasne, aktywne komórki dodatnie pod kątem kaspazy 3 w embrionach w stadium sfery, którym wstrzyknięto umiarkowanie toksyczne poziomy4 mRNA kodującego proapoptotyczne białka z domeną BH3 (bh3-only) gen pumamRNA kodujący białko antyapoptotyczne bcl-2 gen został wstrzyknięty równocześnie, aby udowodnić, że wstrzyknięcie puma mRNA indukuje apoptozę poprzez wewnątrzpochodny szlak zależny od mitochondriów.

Apoptoza indukowana przez promieniowanie jonizujące (IR) u danio pręgowanego wymaga p53-zależnej transkrypcji genów typu bh3-only, takich jak puma^5-6. Opóźnienie apoptozy indukowanej przez IR przedstawione na Ryc. 3 jest zgodne z wymogiem transkrypcji pośredniczonej przez p53.

Protokół Casp3 powinien zapewnić wysoki stosunek sygnału do szumu. Rysunek 4 porównuje optymalny wynik testu Casp3 z dwoma typowymi wynikami suboptymalnymi, które pojawiają się, gdy kluczowe etapy zostaną pominięte lub wykonane nieprawidłowo (patrz sekcja Dyskusja): słaby stosunek sygnału do szumu wynikający z fluorescencji tła w tkance zwierzęcej oraz fluorescencji żółtka, która zakłóca sygnał docelowy.

Eksperymenty z podwójnym znakowaniem z wykorzystaniem transgenicznych linii wykazujących ekspresję GFP przybliżają obraz tkanek przechodzących apoptozę (Rysunek 5).

Rycina 1. Uproszczony schemat protokołu Casp3.

Rycina 2. (A) Analiza apoptozy w embrionach w stadium 4-komórkowym. Embriony w stadium jednego komórki zostały wstrzyknięte z 50 pg mRNA kodującego egfp (kontrola) lub proapoptotycznymi genami bh3-only: bim oraz noxa. W stadium 4-komórkowym (około jednej godziny po wstrzyknięciu, hpi), embriony poddano analizie immunofluorescencyjnej w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3. mRNA bim i noxa indukują szybką apoptozę w embrionach danio pręgowanego bezpośrednio po wstrzyknięciu, co w przypadku pozostawienia embrionów do dalszego rozwoju prowadzi do śmierci do 2 hpi4. Do porównania przedstawiono obraz w świetle przechodzącym embrionu typu dzikiego w stadium 4-komórkowym. (B) Analiza apoptozy w embrionach danio pręgowanego w stadium sfery. Embriony w stadium jednego komórki zostały wstrzyknięte z mRNA kodującym odpowiednio 50 pg egfp (kontrola), 5 pg puma oraz 45 pg egfp (puma), lub 5 pg puma oraz 45 pg bcl-2 (bcl-2). W stadium sfery (około 4 hpi), embriony przeanalizowano za pomocą testu Casp3. Przedstawiono widoki boczne oraz od strony bieguna zwierzęcego w celu wizualizacji komórek apoptotycznych. Zahamowanie apoptozy indukowanej przez puma przez bcl-2 wskazuje, że wstrzyknięcie mRNA puma indukuje apoptozę specyficznie poprzez wewnątrzkomórkową ścieżkę zależną od mitochondriów. Do porównania przedstawiono obraz w świetle przechodzącym embrionu typu dzikiego w stadium sfery.

Rysunek 3. Przebieg czasowy apoptozy indukowanej promieniowaniem jonizującym (IR) między 17 a 20 hpf. Zarodki zebrafish zostały napromieniowane dawką 8 Gy IR w 17 hpf i przeanalizowane w czasie 0, 1,5, 2 i 3 h po napromieniowaniu (hpIR) za pomocą testu Casp3. Strzałki w 20 hpf wskazują akumulację komórek apoptotycznych w rdzeniu kręgowym w 3 hpIR. Dla porównania przedstawiono obraz w świetle przechodzącym zarodka w 17 hpf.

Rycina 4. Optymalne i suboptymalne wyniki immunofluorescencji Casp3 na zarodkach w 27 hpf. Zarodki danio pręgowanego zostały napromieniowane (lub nie) w 24 hpf dawką 15 Gy i poddane analizie testem Casp3. Grupa „optimal” wykazuje idealne wyniki, w których komórki apoptotyczne wykazują silną fluorescencję, a komórki nieapoptotyczne i żółtko wykazują minimalną fluorescencję tła. Strzałki w grupie „background fluorescence in control” wskazują nadmierną fluorescencję tła w tkankach zwierzęcych zarodków kontrolnych. Gwiazdki w grupie „yolk fluorescence” wskazują nadmierną nieswoistą fluorescencję w żółtku.

Rysunek 5. Eksperymenty z podwójnym znakowaniem określają specyficzność tkankową apoptozy indukowanej przez IR. Linia transgeniczna Tg(olig2:egfp)^vu12 znakuje neurony ruchowe i oligodendrocyty¹⁷, a linia Tg(elavl3:egfp) znakuje wszystkie różnicujące się neurony¹⁸. Każda linia transgeniczna została naświetlona dawką 15 Gy w 24 hpf i przeanalizowana 3 h później przy użyciu mysich przeciwciał pierwszorzędowych anty-GFP oraz króliczych przeciwciał pierwszorzędowych anty-aktywna-Kaspaza 3, a następnie odpowiednio zielonych i czerwonych fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych. Przedstawiono powiększenie rdzenia kręgowego (zlokalizowanego grzbietowo względem końca wyrostka żółtka embrionów w 27-hpf, 3-hpIR). Komórki apoptotyczne wydają się być częściowo zlokalizowane w populacjach Tg(elavl3:egfp) oraz Tg(olig2:egfp)^vu12 (patrz groty strzałek na obrazie nałożonym), co sugeruje, że neurony i oligodendrocyty są wrażliwe na apoptozę indukowaną przez IR.

Dyskusja

Test Casp3 przedstawiony w tym protokole ma być prosty, a jeśli zostanie przeprowadzony zgodnie z instrukcjami w niniejszym dokumencie, powinien dać solidny stosunek sygnału do szumu. Krytyczne etapy tego protokołu obejmują użycie świeżego buforu 1x PDT do wszystkich płukań, wystarczającą długość etapów płukania w buforze PDT po inkubacji zarodków w pierwotnym przeciwciałie, delikatne obchodzenie się z zarodkami oraz skrupulatne rozliczanie wszystkich zarodków w probówkach lub pipetach transferowych podczas wszystkich etapów protokołu.

Z naszego doświadczenia wynika, że najczęstszymi przyczynami braku sygnału o kontrolach pozytywnych są: 1) 1x PBST jest zastępowany przez 1x PDT podczas etapów mycia, 2) 1x bufor PDT jest starszy niż jeden miesiąc, 3) zastosowano niewłaściwe przeciwciało drugorzędowe, 4) zarodki są starsze niż 32 hpf i/lub 5) w jednej probówce przeanalizowano więcej niż 40 zarodków. Gdy w próbkach pojawiają się niespójne wyniki lub zmienność, dzieje się tak zwykle dlatego, że 1) nie zadbano o to, aby wszystkie zarodki pozostały w płynie przez cały czas trwania zabiegu i/lub 2) zarodki nie były inkubowane pod wystarczającym kołysaniem. Wysoki poziom szumu tła jest często wizualizowany jako ogólna fluorescencyjna mgiełka powstająca w tkance zwierzęcej zarodka (patrz Ryc. 4, "fluorescencja tła"). Słaby stosunek sygnału do szumu może wystąpić, gdy 1) zarodki nie były myte przez wystarczająco długi czas po podaniu przeciwciała pierwotnego i/lub 2) zarodki pozostawiono w PFA lub metanolu dłużej niż zalecany czas. Jeżeli zarodki nie pozostaną nienaruszone do końca testu: 1) roztwory nie zostały dodane kroplami po utrwaleniu z PFA i/lub 2) prędkość obrotowa podczas etapów inkubacji była zbyt wysoka.

Wizualizacja całościowa nieodłącznie związana z testem Casp3 jest pomocna w przestrzennej lokalizacji komórek apoptotycznych. Jednak swoistość tkankowa jest przybliżona i prawdopodobnie będzie zależeć od technik wspólnego znakowania (patrz rycina 5) i/lub sekcji zarodków w celu określenia dokładnej tożsamości komórek poddawanych apoptozie. W opisanym tutaj protokole wspólne znakowanie jest ograniczone przez wymóg specyficznego przeciwciała pochodzącego od królika użytego w naszym teście. Nie zidentyfikowaliśmy komercyjnie dostępnego przeciwciała antyaktywowanego kaspazy 3 pochodzącego z królika, które specyficznie znakuje komórki apoptotyczne przez immunofluorescencję całej góry w zarodkach danio pręgowanego. W związku z tym przeciwciała specyficzne dla typu komórkowego, które są hodowane u królików, nie będą kompatybilne z testem Casp3 do eksperymentów ze wspólnym znakowaniem. Jedną z alternatyw jest wykonanie testu TUNEL, który wymaga przeciwciała pochodzącego od myszy do znakowania komórek apoptotycznych6. Odkryliśmy jednak, że test TUNEL z pełnym wierzchowaniem przeprowadzony na zarodkach danio pręgowanego jest bardzo wrażliwy na szereg zmiennych w reakcji, w tym stężenie enzymu TdT, czas inkubacji zarodka w enzymie TdT oraz liczbę zarodków obecnych w probówce (nasze niepublikowane obserwacje). W związku z tym trudno jest znaleźć równowagę enzymów, która daje spójną interpretację wyników. Dlatego preferowaną alternatywą jest analiza komórek apoptotycznych w transgenicznych zarodkach danio pręgowanego, które wyrażają fluorofor (z dostępnymi na rynku silnymi przeciwciałami), taki jak GFP, w określonym typie komórki. Następnie eksperymenty ze wspólnym znakowaniem można przeprowadzić przy użyciu pierwszorzędowego mysiego przeciwciała anty-Gfp, a następnie fluoryzującego na zielono przeciwciała anty-mysiego przeciwciała wtórnego. Zobacz rysunek 5 , aby zapoznać się z przykładem.

Podczas gdy protokół Casp3 zapewnia solidne, niezawodne barwienie komórek apoptotycznych w zarodkach od stadium 4-komórkowego do 32 hpf, ma ograniczone zastosowanie powyżej 32 hpf ze względu na niezdolność przeciwciał do przenikania przez skórę starszych zarodków. Dodatkowe techniki przenikania zarodków, w tym leczenie kolagenazą, trypsyną, acetonem lub etanolem, mogą być potencjalnie zoptymalizowane w celu dostosowania tego testu do analizy starszych zarodków. Barwienie AO można jednak przeprowadzić na żywych danio pręgowanych w wieku do co najmniej 5 dni⁹. W ten sposób test AO omija ograniczenie stadium embrionalnego i stanowi szybki test do analizy komórek apoptotycznych (1-2 godziny). Natomiast test Casp3 wymaga utrwalenia zarodków przez noc i trwa 2-4 dni. Wady testu AO obejmują to, że skuteczna dokumentacja fotograficzna zarodków może być trudna w przypadku wielu próbek, ponieważ zarodki są żywe, a komórki apoptotyczne są szybko tworzone i oczyszczane. Może to być szczególnie problematyczne, jeśli zarodki muszą zostać zamontowane w celu uzyskania określonej orientacji do dokumentacji. Ponadto odkryliśmy, że barwienie AO zmniejsza się po utrwaleniu za pomocą PFA, więc nie jest zgodne z eksperymentami koznakowania obejmującymi immunofluorescencję.

Analizę ilościową aktywowanej kaspazy 3 można przeprowadzić za pomocą oprogramowania, które mierzy intensywność fluorescencji udokumentowanych obrazów. Określiliśmy ilościowo apoptozę indukowaną przez IR w tkance nerwowej, metodę, którą szczegółowo opisaliśmy w innym miejscu¹⁰. W zależności od eksperymentu, analiza ilościowa aktywowanej kaspazy 3 może wymagać dalszej manipulacji zarodkami, takiej jak montaż płaski, w celu uzyskania właściwej orientacji dla optymalnej analizy tkanki. Ponadto liniowość analizy będzie zależała od grubości analizowanej tkanki. Na przykład przeanalizowaliśmy apoptozę indukowaną przez IR w tkance nerwowej, mierząc immunofluorescencję aktywnej kaspazy 3 w płytkiej tkance nerwowej rdzenia kręgowego, a nie w gęstej od neuronów tkance mózgu^4,10.

Z naszego doświadczenia wynika, że test Casp3 jest najbardziej solidnym i wiarygodnym testem dostępnym do analizy apoptozy w zarodkach danio pręgowanego między stadium 4-komórkowym a 32 hpf, gdy analiza wymaga dużo czasu na dokumentację. Gdy dostępne są odpowiednie przeciwciała lub linie transgeniczne do identyfikacji określonych komórek, test ten jest również wysoce podatny na koznakowanie w celu identyfikacji określonych typów komórek ulegających apoptozie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki 1,5 ml	Denville Scientific	c2170	Bezpieczny Wystarczą podobne plastikowe rurki o długości 1,5 m.
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma Aldrich	P5493	Bezpieczny
Przeciwciało a-aktywowane-ludzkie-kaspazy-3	Fisher Scientific	BDB559565	Może być szkodliwe w przypadku wdychania lub połknięcia.
Przeciwciało monoklonalne a-GFP (mysz)	Life Technologies	33-2600	Może być szkodliwe w przypadku wdychania lub połknięcia.
a-HuC/HuD ludzkie białko neuronalne, mysie IgG2b, monoklonalne 16A11 - UNCONJ	Life Technologies	A21271	Może być szkodliwe w przypadku wdychania lub połknięcia.
Albumina, izolacja szokiem cieplnym BSA bydła	Amresco	CAS 9048-46-8	Bezpieczny Można również kupić za pośrednictwem Bioexpress: 0332-1006
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse IgG	Life Technologies	A11029	Stosować w rozcieńczeniu 1:200. Może być szkodliwy w przypadku wdychania lub połknięcia.
Alexa Fluor 488 Donkey anty-Rabbit IgG	Life Technologies	A21206	Stosować w rozcieńczeniu 1:200. Może być szkodliwy w przypadku wdychania lub połknięcia.
Alexa Fluor 568 Donkey anty-Rabbit IgG	Life Technologies	A10042	Stosować w rozcieńczeniu 1:200. Może być szkodliwy w przypadku wdychania lub połknięcia.
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma Aldrich	D8418	Łatwopalny.
Kleszcze Dumont #5 Inox (końcówki standardowe/proste)	Narzędzia do nauki	11251-20	Ostre!
FBS HyClone Płodowa surowica bydlęca	Thermo-Fisher	SH3091003	bezpieczny.
Fisher Scientific Ocelot Rotator	Fisher Scientific	05-450-21	Odpowiedni jest każdy rotator z ręczną regulacją prędkości.
Natychmiastowa sól oceaniczna do akwarium	Petco	1373684	bezpieczne.
Metanol (bez acetonu)	Sigma Aldrich	M1775	Łatwopalny: działa toksycznie przez drogi oddechowe, spożycie i kontakt
Metyloceluloza	Sigma Aldrich	M0387-1006	Bezpieczny
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich	P6148	Łatwopalny: działa toksycznie przez drogi oddechowe, spożycie i kontakt.
Sonda (kątowa 80 krótka/15,5 cm/0,15 mm średnicy końcówki)	Fine Science Tools	10140-02	Ostra!
Pronase	Roche	11459643001	bezpieczny.
Płyta punktowa Pyrex	Fisher Scientific	13-748B	Bezpieczny
Pipety transferowe, Samco ogólnego przeznaczenia	Thermo-Scientific	204	Bezpieczne.
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	Działa drażniąco: działa szkodliwie po spożyciu lub kontakcie.
Tween-20	Sigma Aldrich	P7949	Bezpieczny Inne marki to VWR #97063-872.

precyzyjnej .