Angiografia z zieleni indocyjaninowej (lub ICGA) wykonywana przez wstrzyknięcie żyły ogonowej dostarcza wysokiej jakości obrazów przebiegu czasu ICGA do scharakteryzowania nieprawidłowości w naczyniówce myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie nieprawidłowości w unaczynieniu naczyniówki w mysim modelu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem za pomocą zielonej angiografii indocyjaniny w czasie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Angiografia zielona indocyjaniny (lub ICGA) to technika wykonywana przez okulistów do diagnozowania nieprawidłowości naczyniówki i siatkówki w różnych chorobach oczu, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). ICGA jest szczególnie przydatny do obrazowania tylnego naczyniówki oka ze względu na jego zdolność przenikania przez warstwę pigmentową za pomocą widma podczerwonego. Przebieg czasowy ICGA można podzielić na fazę wczesną, środkową i późną. Te trzy fazy dostarczają cennych informacji na temat patologii problemów z oczami. Chociaż ICGA w czasie przez wstrzyknięcie dożylne (IV) jest szeroko stosowane w klinice do diagnozowania i leczenia problemów z naczyniówką, ICGA przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) jest powszechnie stosowane w badaniach na zwierzętach. Tutaj zademonstrowaliśmy technikę uzyskiwania obrazów przebiegu czasowego ICGA o wysokiej rozdzielczości u myszy poprzez wstrzyknięcie żyły ogonowej i konfokalną skaningową oftalmoskopię laserową. Wykorzystaliśmy tę technikę do zobrazowania zmian naczyniówkowych w mysim modelu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. Chociaż znacznie łatwiej jest wprowadzić ICG do układu naczyniowego myszy za pomocą IP, nasze dane wskazują, że trudno jest uzyskać powtarzalne obrazy przebiegu czasu ICGA za pomocą IP-ICGA. W przeciwieństwie do tego, ICGA poprzez wstrzyknięcie żyły ogonowej zapewnia wysokiej jakości obrazy przebiegu czasu ICGA, porównywalne z badaniami na ludziach. Ponadto wykazaliśmy, że ICGA wykonana na myszach albinosach daje wyraźniejsze obrazy naczyń naczyniówkowych niż ta wykonana na myszach pigmentowanych. Sugerujemy, że przebieg czasowy IV-ICGA powinien stać się standardową praktyką w badaniach nad AMD opartych na modelach zwierzęcych.
Wprowadzenie
Angiografia z zielenią indocyjaninową (ICGA) to test diagnostyczny do obrazowania problemów związanych z naczyniami krwionośnymi w oku. Widmo absorpcyjne ICG waha się od 790-805 nm, podczas gdy widmo emisyjne waha się od 770-880 nm ze szczytową emisją przy 835 nm 1. Różni się on od innego popularnego barwnika, fluoresceiny sodu, której widmo mieści się w zakresie widzialnym. Widmo podczerwieni umożliwia ICG przenikanie przez nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE), płyn surowiczo-sogwiniczny i wysięki lipidowe, z których wszystkie mogą łatwo blokować wizualizację za pomocą angiografii fluoresceinowej na bazie sodu i fluoresceiny (FA). ICG jest w 98% związany z białkami w układzie naczyniowym, co skutkuje mniejszym wynaczynieniem, co pozwala na lepsze obrazowanie naczyń naczyniówkowych i zmian naczyniówkowych1,2. ICGA jest prawie jedynym wyborem do wizualizacji naczyniówki naczyniówkowej, która jest tylna w stosunku do RPE. Rycina 1 przedstawia porównanie ICGA i FA w obrazowaniu naczyń krwionośnych w oczach myszy. FA można wykorzystać do dobrego obrazowania unaczynienia siatkówki, ale nie naczynia naczyniówkowego. W przeciwieństwie do tego, ICGA może być używany do obrazowania zarówno naczyń siatkówkowych, jak i naczyniówkowych. ICGA jest wykonywana za pomocą cyfrowych systemów obrazowania o wysokiej rozdzielczości lub skaningowych oftalmoskopów laserowych (SLO) wraz z kamerami wideo czułymi na podczerwień, które wykorzystamy w tym badaniu.
W klinice, ICGA zostało zalecone w diagnozowaniu wielu zaburzeń naczyniówkowo-siatkówkowych obejmujących unaczynienie naczyniówki, w tym polipoidalnej waskulopatii naczyniówkowej (PCV), proliferacji naczyniaków siatkówkowych (RAP), smug naczyniościennych, witelowatej dystrofii plamki, centralnej surowiczej chorioretinopatii, naczyniaka krwionośnego, krwotoku tętniczego siatkówki makrotętników, guzów naczyniówki i niektórych form tylnego zapalenia błony naczyniowej oka1,3. Połączenie ICGA z FA i optyczną tomografią koherentną (OCT) zapewnia klinicznym potężnym narzędziom w diagnostyce i leczeniu wysiękowego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD)4-10. ICGA jest szczególnie przydatna w diagnozowaniu stanów obejmujących naczyniówkę. W rzeczywistości ICGA jest uważany za złoty standard w diagnozowaniu PCV, wariantu wysiękowego AMD11-13. PCV charakteryzuje się siecią rozgałęzionych naczyń z końcowymi dylatacjami polipowatymi w naczyniówce11-13. PCV jest często związany z nawracającymi surowiczo-krwawymi odwarstwieniami RPE i siatkówki z przeciekaniem i krwawieniem ze składników polipowatych11,14,15. Niedawno informowaliśmy o wygenerowaniu pierwszego modelu zwierzęcego PCV poprzez transgeniczną ekspresję ludzkiej HTRA1, wielofunkcyjnej proteazy seryny, w nabłonku barwnikowym siatkówki myszy (RPE)16. Wykazaliśmy, że wzrost HTRA1 indukuje charakterystyczne cechy PCV, np. zmiany polipowate.
Tutaj zademonstrowaliśmy użycie ICGA w czasie poprzez wstrzyknięcie żyły ogonowej w badaniach AMD przy użyciu naszego mysiego modelu HTRA1. Nasze dane sugerują, że IV-ICGA jest lepszy od IP (lub podskórnego (SC))-ICGA, które są obecnie stosowane w polu17,18 do charakteryzowania zmian w naczyniówce.
Oświadczenie w sprawie badań na zwierzętach
Eksperymenty na zwierzętach były prowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i były przeprowadzane zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie instrumentów
- Zabieg wykonywany jest na sali zabiegowej w pomieszczeniu dla zwierząt.
- Przed rozpoczęciem eksperymentu załóż maski na twarz, czepki do włosów, fartuchy chirurgiczne, sterylne pokrowce na stopy i rękawiczki.
- Podgrzej wodę w zlewce do temperatury ~40 °C na płycie grzejnej.
- Umieść sterylną niebieską podkładkę na poduszce grzewczej, która będzie później używana do utrzymywania temperatury ciała myszy podczas obrazowania. Włącz poduszkę grzewczą.
- Przygotuj system obrazowania:
- Zdejmij osłonę przeciwpyłową i włącz laser.
- Wyjmij soczewkę 55° i zamontuj ją na maszynie.
- Otwórz oprogramowanie do obrazowania z komputera i wprowadź informacje o myszy do obrazowania pod kartą nowego pacjenta (np. genotyp, wiek itp.). W sekcji "typ urządzenia" wybierz tryb podczerwieni (IR).
Uwaga: Doniesiono, że użycie zewnętrznej podwójnej soczewki asferycznej może poprawić jakość obrazu17-20, chociaż nie mamy problemu z uzyskaniem wysokiej jakości obrazów przez IV-ICGA bez użycia zewnętrznych soczewek (zobacz reprezentatywne wyniki, Rysunki 1-4).
2. Iniekcja żyły ogonowej ICGA
- Rozszerz oczy myszy 1% roztworem okulistycznym Tropicamidu i odczekaj 5 minut.
- Zważ mysz, aby określić ilość potrzebnego znieczulenia (ketamina/ksylazyna/acepromazyna 65-100/10-20/1-3 mg/kg).
- Pobrać jałową strzykawkę o pojemności 1 ml wraz z igłą 32 G. Wstrzyknąć myszu dootrzewnowo środki znieczulające (13 mg/ml ketaminy, 2,6 mg/ml ksylazyny, 0,3 mg/ml acepromazyny w sterylnym PBS). Poczekaj, aż mysz zostanie w pełni znieczulona (~5 min).
- Umieść ogon myszy w ciepłej wodzie o temperaturze 40 °C, aby spowodować rozszerzenie naczyń krwionośnych żyły.
- Pobrać strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 32 G. Pobrać żądaną ilość ICG, zwykle 50 μl 1 mg/ml ICG, która jest sterylnie filtrowana za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μM do sterylnej probówki dla myszy 25 g (2 mg/kg). Należy uważać, aby nie wprowadzić powietrza do strzykawki.
- Przetrzyj ogon wacikiem nasączonym alkoholem, aby wysterylizować obszar, który ma zostać wstrzyknięty.
- Przytrzymaj ogon jedną ręką tak, aby boczna żyła ogonowa była skierowana do góry. Ze skosem igły skierowanym do góry, wstrzyknąć igłę ~2 mm do żyły pod minimalnym kątem. Uważaj, aby nie przebić żyły. Lekko odciągnąć strzykawkę i poszukać śladów przepływu krwi do piasty igły, co wskazuje, że igła została pomyślnie wprowadzona do żyły.
- Powoli wstrzyknąć ICG do żyły. Opór podczas wstrzykiwania powinien być minimalny. Wyjmij igłę i przyłóż wacik nasączony alkoholem bezpośrednio do miejsca wstrzyknięcia na ~5-10 sekund, aby zatrzymać krwawienie. Mysz jest wtedy gotowa do obrazowania. Aby uchwycić wczesną fazę (0-4 minuty po wstrzyknięciu), konieczne jest szybkie zobrazowanie myszy.
Uwaga: Oczy myszy mogą łatwo stać się suche i mogą rozwinąć się zaćma pod narkozą. Ważne jest, aby oko było nawilżone poprzez stosowanie sterylnego PBS podczas zabiegu. Zetrzyj nadmiar PBS sterylnym wacikiem przed zapisem ICGA. Inne laboratoria używały soczewek kontaktowych, aby uniknąć odwodnienia rogówki17-20.
3. Angiografia ICG
- Rozpocznij robienie zdjęć 30-40 sekund po wstrzyknięciu ICG, co pozwala na uchwycenie wczesnej fazy wypełnienia naczyniówki, aż krążenie siatkówki i naczyniówki osiągnie maksymalną jasność (0-4 min). Unaczynienie siatkówki najlepiej uwidocznić przy ognisku ~35-45 dioptrii, a unaczynienie naczyniówki jest uwidocznione przy 10-15 dioptriach.
nuta: Podczas pierwszego badania modelu zwierzęcego zaleca się wykonanie zdjęć pod każdym kątem (nosowym, skroniowym, grzbietowym i brzusznym) w celu zidentyfikowania wszystkich możliwych nieprawidłowości w układzie naczyniowym. We wczesnej fazie zarówno średnie, jak i duże tętnice i żyły naczyniówkowe są dobrze uwidocznione. W modelu zwierzęcym zastosowanym w tym protokole zmiany naczyniówkowe (np. poszerzenia polipowate) mogą zacząć pojawiać się po 1 minucie we wczesnej fazie. - Ustaw ostrość obrazu na układzie naczyniowym. Steruj jasnością i ostrością za pomocą odpowiednio modułu sterującego i pokrętła ostrości. Wartości te można regulować cyfrowo i można je łatwo utrzymać na stałym poziomie. Utrzymuj stałą odległość od oka myszy do obiektywu aparatu, aby zapewnić powtarzalność jakości obrazu przy użyciu poniższej techniki.
nuta: Ponieważ urządzenie może obrazować tylko część tylnego oka, staramy się utrzymać stałą ostrość, jasność i odległość między obiektywem aparatu a okiem myszy, obrazując całe tylne oko pod różnymi kątami. Kluczem do tego jest wyrównanie luminescencji w kształcie koła emitowanej przez ICG przez oko z polem widzenia kamery. Osiąga się to poprzez dokonywanie regulacji pozycji kamery od lewej do prawej, góra i dół oraz do wewnątrz i na zewnątrz, aż cały obraz nie będzie miał ciemnych obszarów. Gdy luminescencja i pole widzenia kamery są wyrównane, odległość od oka do obiektywu będzie odtwarzalna dla następnego zestawu obrazów, a także w optymalnej odległości dla wysokiej jakości obrazowania. - Gdy układ naczyniowy jest ostry, uchwyć klatki obrazu, naciskając okrągły przycisk na module akwizycji. Okrągły przycisk może być również używany do zmniejszania lub wzmacniania sygnału ICG w celu uzyskania najlepszej jakości obrazu.
- Określ optymalny kąt widzenia i głębokość ostrości, aby zobrazować zmiany naczyniówkowe. Ważne jest, aby pozycja oka, głębokość ostrości i inne ustawienia urządzenia były stałe dla całego czasu ICGA. Obrazy są zapisywane poprzez naciśnięcie przycisku akwizycji na panelu ekranu dotykowego modułu akwizycji.
- Obrazy należy wykonywać w środkowej fazie po 6-15 minutach od wstrzyknięcia.
nuta: Zarówno naczynia naczyniówkowe, jak i siatkówkowe stają się mniej wyraźne. Naczyniówka objawia się jako rozlana fluorescencja. Zmiany naczyniówkowe wykazujące hiperfluorescencję pojawiają się w przeciwieństwie do blaknięcia otaczającego normalną fluorescencję tła. - Obrazy należy wykonywać w późnej fazie po 17-25 minutach od wstrzyknięcia.
nuta: Hiperfluorescencja zanika. Zarówno naczynia naczyniówkowe, jak i siatkówkowe nie są już widoczne. Głowa nerwu wzrokowego staje się. Hiperfluorescencyjne zmiany naczyniówkowe mają maksymalny kontrast z zanikającym tłem. - Po zakończeniu akwizycji obrazów nałóż przezroczysty smarujący żel pod oczy myszy na oczy myszy i pozostaw mysz na poduszce grzewczej w celu odzyskania sprawności.
- Wróć myszy do ich klatek i obszaru przetrzymywania. Eksportuj obrazy jako pliki Tiff lub JPEG w celu dalszej analizy.
Uwaga: Czas każdej fazy nie jest bezwzględny. Odkryliśmy, że czas każdej fazy może się zmieniać w zależności od ilości wstrzykniętego ICG. Więcej ICG ma tendencję do wydłużania każdej fazy. Najlepszym sposobem zdefiniowania fazy jest skorzystanie z kluczowych cech każdej fazy wymienionych powyżej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przeprowadzono badanie czasowe ICGA u myszy transgenicznych HTRA1 oraz kontrolnych myszy WT z tego samego miotu, obie grupy na tle genetycznym CD1. Wybrano albinotyczne tło CD1, aby ułatwić obrazowanie w angiografii z użyciem zieleni indocyjaninowej (ICGA) (patrz: DYSKUSJA). W wczesnej fazie u myszy HTRA1 zaczęły pojawiać się niektóre rozszerzenia przypominające tętniaki (Rysunek 2, czerwona strzałka wskazuje rozszerzenie na końcówce naczynia, a czerwone koło wskazuje polipowatą zmianę typu skupiskowego)...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym badaniu wykazaliśmy zastosowanie ICGA do obrazowania zmian naczyniówkowych u myszy transgenicznych HTRA1. Charakterystyka wczesnej, środkowej i późnej fazy ICGA w naszym modelu mysim dobrze pasuje do przebiegu czasu w badaniach na ludziach1. Jest to ważne, aby dokonać lepszych porównań między patologią człowieka a fenotypami zwierzęcymi, które są nieocenione w badaniach nad mechanizmami patofizjologicznymi i strategiami leczenia stanów związanych z naczyniówką, takich jak AMD.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
YF jest wynalazcą dwóch zgłoszonych patentów, które są istotne dla modelu myszy AMD użytego w tej pracy. SK, ZB i ADJ nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant NIH 1R01EY022901, Nagrodę Rozwoju Kariery od Research to Prevent Blindness (RPB), C.M.Reeves & M.A. Reeves Foundation, E. Matilda Ziegler Foundation for the Blind, Knights Templar Eye Foundation oraz nieograniczony grant dla Wydziału Okulistyki Uniwersytetu Utah od RPB. Dziękujemy Balamurali Ambati za pomoc techniczną w zakresie systemu obrazowania multimodalnego Spectralis oraz Tao Zhangowi za dyskusje i komentarze na temat manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Multimodalny system obrazowania Spectralis | Heidelberg Engineering, Niemcy | SPECTRALIS HRA+OCT | |
| Tropicamide roztwór okulistyczny (1%) | Bausch & Lomb | NDC 24208-585-64 | do rozszerzania źrenic |
| GenTeal Gel | Genteal NDC | 58768-791-15 | Przezroczysty żel pod oczy |
| Ketamine | Vedco Inc | NDC 50989-996-06 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA 139-236 | |
| Acepromazine | Vedco Inc | NDC 50989-160-11 | |
| 32-G Igła | Steriject | PRE-32013 | |
| 1-ml strzykawka | BD | 309659 | |
| Indocyanine Green | Pfaltz & Bauer | I01250 |
Bibliografia
- Duane, T. D., Tasman, W., Jaeger, E. A. Chapter 4a, Indocyanine Green Angiography. Duane's clinical ophthalmology on CD-ROM. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2002).
- Alfaro, D. V. Age-related macular degeneration : a comprehensive textbook. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am. J. Ophthalmol. 151, 745-751 (2011).
- Destro, M., Puliafito, C. A. Indocyanine green videoangiography of choroidal neovascularization. Ophthalmology. 96, 846-853 (1989).
- Scheider, A., Schroedel, C. High resolution indocyanine green angiography with a scanning laser ophthalmoscope. Am. J. Ophthalmol. 108, 458-459 (1989).
- Guyer, D. R., et al. Digital indocyanine-green angiography in chorioretinal disorders. Ophthalmology. 99, 287-291 (1992).
- Yannuzzi, L. A., Slakter, J. S., Sorenson, J. A., Guyer, D. R., Orlock, D. A. Digital indocyanine green videoangiography and choroidal neovascularization. Retina. 12, 191-223 (1992).
- Regillo, C. D., Benson, W. E., Maguire, J. I., Annesley, W. H. Indocyanine green angiography and occult choroidal neovascularization. Ophthalmology. 101, 280-288 (1994).
- Scheider, A., Kaboth, A., Neuhauser, L. Detection of subretinal neovascular membranes with indocyanine green and an infrared scanning laser ophthalmoscope. Am. J. Ophthalmol. 113, 45-51 (1992).
- Kuck, H., Inhoffen, W., Schneider, U., Kreissig, I. Diagnosis of occult subretinal neovascularization in age-related macular degeneration by infrared scanning laser videoangiography. Retina. 13, 36-39 (1993).
- Imamura, Y., Engelbert, M., Iida, T., Freund, K. B., Yannuzzi, L. A. Polypoidal choroidal vasculopathy: a review. Surv. Ophthalmol. 55, 501-515 (2010).
- Ciardella, A. P., Donsoff, I. M., Yannuzzi, L. A. Polypoidal choroidal vasculopathy. Ophthalmol. Clin. N. Am. 15, 537-554 (2002).
- Spaide, R. F., Yannuzzi, L. A., Slakter, J. S., Sorenson, J., Orlach, D. A. Indocyanine green videoangiography of idiopathic polypoidal choroidal vasculopathy. Retina. 15, 100-110 (1995).
- Coppens, G., Spielberg, L., Leys, A. Polypoidal choroidal vasculopathy, diagnosis and management. Bull. Soc. belge d'Ophtalmol.. , 39-44 (2011).
- Tsujikawa, A., et al. Pigment epithelial detachment in polypoidal choroidal vasculopathy. Am. J. Ophthalmol. 143, 102-111 (2007).
- Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 14578-14583 (2011).
- Alex, A. F., Heiduschka, P., Eter, N. Retinal fundus imaging in mouse models of retinal diseases. Methods Mol. Biol. 935, 41-67 (2013).
- Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45, 3512-3519 (2005).
- Fischer, M. D., Zhour, A., Kernstock, C. J. Phenotyping of mouse models with OCT. Methods Mol. Biol. 935, 79-85 (2013).
- Jian, Y., Zawadzki, R. J., Sarunic, M. V. Adaptive optics optical coherence tomography for in vivo mouse retinal imaging. J. Biomed. Opt. 18, 56007 (2013).
- Ciardella, A. P., Donsoff, I. M., Huang, S. J., Costa, D. L., Yannuzzi, L. A. Polypoidal choroidal vasculopathy. Surv. Ophthalmol. 49, 25-37 (2004).
- Sasahara, M., et al. Polypoidal choroidal vasculopathy with choroidal vascular hyperpermeability. Am. J. Ophthalmol. 142, 601-607 (2006).
- Silva, R. M., et al. Polypoidal choroidal vasculopathy and photodynamic therapy with verteporfin. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 243, 973-979 (2005).
- Yannuzzi, L. A., et al. Polypoidal choroidal vasculopathy masquerading as central serous chorioretinopathy. Ophthalmology. 107, 767-777 (2000).
- Janssen, A., et al. Abnormal vessel formation in the choroid of mice lacking tissue inhibitor of metalloprotease-3. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 2812-2822 (2008).
- Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. Molecular pathology of age-related macular degeneration. Prog. Retin. Eye Res. 28, 1-18 (2009).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Mol. Aspects Med. 33, 487-509 (2012).
- Elizabeth Rakoczy, P., Yu, M. J., Nusinowitz, S., Chang, B., Heckenlively, J. R. Mouse models of age-related macular degeneration. Exp. Eye Res. 82, 741-752 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
