Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podwiązanie jelita ślepego i sepsa wywołana nakłuciem jako model do badania autofagii u myszy

28.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51066

⸱

9 lutego 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Renal Division, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3First Department of Critical Care Medicine and Pulmonary Services, University of Athens Medical School, Evangelismos Hospital, Athens, Greece

W tym artykule

Podsumowanie

Eksperymentalna sepsa może być wywołana u myszy za pomocą metody podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP). Aktualne protokoły oceny autofagii in vivo w kontekście sepsy wywołanej CLP przedstawiono tutaj: Protokół pomiaru autofagii przy użyciu myszy (GFP)-LC3 oraz protokół pomiaru tworzenia autofagosomów za pomocą mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

Eksperymentalna sepsa może być wywołana u myszy za pomocą metody podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP), która powoduje posocznicę wielomikrobiologiczną. W tym przypadku zapewniony jest protokół indukowania sepsy o różnym nasileniu u myszy przy użyciu techniki CLP. Autofagia jest podstawową reakcją tkanek na stres i inwazję patogenów. Przedstawiono tu również dwa aktualne protokoły oceny autofagii in vivo w kontekście eksperymentalnej sepsy. (I) Transgeniczne myszy eksprymujące białko fuzyjne białka zielonej fluorescencji (GFP)-LC3 są poddawane CLP. Miejscowe wzmocnienie sygnału GFP (puncta), oceniane za pomocą testów immunohistochemicznych lub konfokalnych, może być stosowane do wykrywania zwiększonego tworzenia autofagosomów, a tym samym zmienionej aktywacji szlaku autofagii. (II) Zwiększone tworzenie autofagicznej wakuoli (autofagosomu) na jednostkę powierzchni tkanki (jako marker stymulacji autofagii) można określić ilościowo za pomocą mikroskopii elektronowej. Badanie autofagicznych odpowiedzi na sepsę jest kluczowym elementem zrozumienia mechanizmów, za pomocą których tkanki reagują na zakażenie. Wyniki badań w tej dziedzinie mogą ostatecznie przyczynić się do zrozumienia patogenezy sepsy, która stanowi poważny problem w medycynie intensywnej terapii.

Wprowadzenie

Sepsa, ogólnoustrojowa reakcja zapalna na infekcję, stanowi główną przyczynę zgonów u pacjentów w stanie krytycznym1. Zakażenia wewnątrzbrzuszne, często prowadzące do sepsy wielodrobnoustrojowej, stanowią 20% przypadków sepsy, które charakteryzują się znaczną śmiertelnością sięgającą nawet 60%2. Śmiertelność związana z sepsą wynika przede wszystkim z dysfunkcji wielonarządowej z późniejszą niewydolnością narządową3,4. Pilnie potrzebne są dodatkowe badania nad mechanizmem patogennym tej choroby, aby wspierać rozwój nowych i skuteczniejszych terapii.

Metoda podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP) jest powszechnie stosowaną procedurą do modelowania sepsy in vivo. Ponieważ jelito ślepe jest pełne bakterii, jego nakłucie powoduje wielobakteryjne zapalenie otrzewnej, translokację bakterii do krwi (bakteriemia), wstrząs septyczny, dysfunkcję wielonarządową i ostatecznie śmierć5. Powszechnie przyjmuje się, że CLP odzwierciedla rzeczywistość kliniczną dokładniej niż poprzednie techniki, takie jak wstrzykiwanie endotoksyny lub nawet oczyszczonych bakterii gryzoniom, dlatego CLP jest uważany za złoty standard (choć nie bez ograniczeń)6 dla indukcji eksperymentalnej, a co za tym idzie, badania patogenezy sepsy. W niniejszej monografii opisano protokoły mające na celu ocenę, czy mechanizmy chorobowe sepsy obejmują autofagię.

Autofagia, ewolucyjnie zachowany proces komórkowy, ułatwia obrót uszkodzonych białek i organelli, takich jak mitochondria, i odgrywa ważną rolę w usuwaniu wewnątrzkomórkowych patogenów, w tym bakterii7,8. Podczas autofagii białka cytozolowe lub organelle są sekwestrowane w pęcherzyki związane z podwójną błoną zwane autofagosomami, które są następnie dostarczane do lizosomów w celu degradacji9. Szereg białek zostało zidentyfikowanych jako ssacze homologi genów związanych z autofagią (Atg), pierwotnie zidentyfikowanych w drożdżach, które regulują proces autofagii. Konwersja łańcucha lekkiego 3B związanego z białkiem-1 związanym z mikrotubulami (LC3B) (homolog Atg8) z LC3B-I (forma wolna) do LC3B-II (forma sprzężona z fosfatydyloetanoloaminą) stanowi główny krok w tworzeniu autofagosomów9. Dysfunkcja autofagiczna jest związana ze starzeniem się i chorobami człowieka, w tym rakiem i zaburzeniami neurodegeneracyjnymi10. Ponadto autofagia wpływa na odporność wrodzoną i nabytą, taką jak prezentacja antygenu, rozwój limfocytów i wydzielanie cytokin przez komórki odpornościowe8. W związku z tym wydaje się rozsądne, że autofagia może również odgrywać rolę w ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej na zakażenie (tj. w sepsie).

Do tej pory opisano kilka metod oceny roli autofagii w uszkodzeniach tkanek in vivo. Obejmują one zastosowanie białka zielonej fluorescencji (GFP)-LC3 eksprymującego myszy oraz ilościowe oznaczanie autofagosomów w tkance za pomocą mikroskopii elektronowej (te dwie metody opisano w niniejszej monografii). Dodatkowe metody obejmują kwantyfikację ekspresji białek autofagicznych w homogenatach tkankowych oraz analizę strumienia autofagicznego (jak opisano w innym miejscu)11-13. Celem niniejszego przeglądu jest przedstawienie aktualnych protokołów oceny autofagii in vivo w kontekście eksperymentalnej sepsy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Brigham and Women's Hospital/ Harvard Medical School Area zatwierdził następujące procedury.

1. Podwiązanie i nakłucie jelita ślepego

Użyj myszy o tym samym pochodzeniu (C57Bl/6), samce, 8-10 tygodni. Samice myszy są bardziej odporne niż samce na śmiertelność wywołaną sepsą. Myszy starsze niż 8 tygodni dają mniej zmienne wyniki niż młodsze myszy pod względem przeżycia po CLP. Do analizy przeżycia należy użyć około N = 10 myszy na porównywaną grupę. N = 3-5 myszy jest odpowiednie do testów autofagii.

  1. Używaj sterylnych małych narzędzi chirurgicznych (tj. skalpela, nożyczek i kleszczy anatomicznych), które powinny być odpowiednie do operacji gryzoni
    2. .
  2. Przygotuj mieszaninę znieczulającą: Do 7,95 ml PBS dodać 150 μl ksylazyny (AnaSed iniekcja 100 mg/ml) i 700 μl ketaminy (Ketaset CIII, 100 mg/ml).
  3. Aby zapewnić aseptyczne warunki podczas zabiegu, należy nosić rękawiczki, maskę na twarz i fartuch chirurgiczny.
  4. Waż zwierzęta. Znieczulić je, wstrzykując dootrzewnowo (i.p.) mieszaninę wymienioną w kroku 3 w dawce μl (10x masa ciała w g). Na przykład myszy o wadze 22 g należy podać 10x22= 220 μl mieszaniny znieczulającej. Zatem końcowe dawki ksylazyny i ketaminy wynoszą odpowiednio 17 i 80 mg/kg masy ciała. Upewnij się, że znieczulenie jest odpowiednie; Po uszczypnięciu palca u nogi nie powinno dojść do zgięcia kończyny. Uwaga: Użyj maści okulistycznej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  5. Ułóż zwierzęta na czystej powierzchni roboczej na ich grzbietach. Ogony i tylne łapy są skierowane w stronę badacza. Zdezynfekuj skórę brzucha za pomocą alkoholu (70% roztwór EtOH). nuta: Obszar operacyjny powinien być całkowicie ogolony, aby uniknąć zanieczyszczenia rany w wyniku kontaktu z sierścią. Ponadto, optymalnie, należy użyć podkładki z krążącą ciepłą wodą, aby utrzymać normotermię znieczulonych myszy podczas operacji.
  6. Za pomocą skalpela wykonaj małe podłużne nacięcie skóry równolegle i około 1 cm w lewo do linii środkowej. Nie wnikać jeszcze do jamy otrzewnej. Użyj małych nożyczek, aby przedłużyć początkowe nacięcie.
  7. Zidentyfikuj mięśnie brzucha i wypreparuj je, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej.
  8. Za pomocą kleszczy anatomicznych zidentyfikuj jelito ślepe i wynieś je z jamy otrzewnej. Należy uważać, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych krezki (może to prowadzić do śmiertelnego krwotoku).
  9. Zwiąż 60% jelita ślepego, aby osiągnąć sepsę średniego stopnia. Podwiązanie równe lub więcej niż 75% jelita ślepego na ogół powoduje posocznicę o wysokim stopniu złośliwości, podczas gdy podwiązanie równe lub mniejsze niż 25% jelita ślepego powoduje posocznicę o niskim stopniu złośliwości. Należy uważać, aby nie podwiązać zastawki krętniczo-kątniczej (może to zablokować ciągłość jelitową).
  10. Za pomocą igły 21 G należy przebić jelito ślepe przez jedno nakłucie na wylot (dwa otwory) w pobliżu podwiązania. Kierunek perforacji powinien być od krezki do antykrezkowej strony jelita ślepego. Uważaj, aby nie przebić naczyń krwionośnych krezki.
  11. Wyjąć igłę. Delikatnie ściśnij podwiązane jelito ślepe, aby potwierdzić drożność przez dwa otwory; Należy przez nie wytłaczać tylko niewielką ilość kału.
  12. Przenieś podwiązane i przebite jelito ślepe do jamy otrzewnej.
    Uwaga: W przypadku myszy pozorowanych pomiń kroki 1.10-1.12.
  13. Użyj jedwabnych szwów chirurgicznych 6-0 z igłą tnącą, aby zamknąć mięśnie brzucha. Użyj jedwabnych szwów chirurgicznych 6-0 z igłą tnącą, aby zamknąć skórę brzucha.
  14. Wstrzyknąć 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) soli fizjologicznej w celu uzupełnienia ciepła i nawodnienia utraconych podczas zabiegu. Umieść myszy pod lampą grzewczą do czasu ich reanimacji. Uwaga: Optymalnie zamiast lampy grzewczej można użyć bezpieczniejszego urządzenia grzewczego (takiego jak podkładka z cyrkulacyjną ciepłą wodą).
  15. Po operacji wstrzyknąć buprenorfinę (0,05 mg/kg masy ciała s.c.) w celu uzyskania znieczulenia. nuta: Zwierzę nie powinno być pozostawione bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Zwierzę, które zostało poddane leczeniu chirurgicznemu, nie powinno być zwracane do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie zostanie w pełni wyleczone.
  16. Umieść zwierzęta z powrotem w klatkach z nieograniczonym dostępem do jedzenia i wody. Myszy zostaną poddane eutanazji, gdy staną się w stanie agonalnym (na co wskazują objawy kliniczne, takie jak brak ruchu po dotknięciu lub sinica). Sprawdzaj myszy co 4 godziny, aby uniknąć ich śmierci przed eutanazją.

2. Pobieranie i utrwalanie tkanek

  1. Przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu (PFA): Do 889 ml PBS dodaj 111 ml 37% PFA.
  2. Ofiaruj myszy za pomocą narkozy indukowanej CO2 lub roztworu ketaminy/ksylazyny w wysokiej dawce.
  3. Unieruchom myszy na czystej powierzchni roboczej. Spryskaj skórę brzucha i klatki piersiowej 70% roztworem EtOH, aby ją zdezynfekować.
  4. Za pomocą skalpela i małych nożyczek usuń skórę brzucha i klatki piersiowej, a także skórę pokrywającą obszar tchawicy.
  5. Odsłoń tchawicę, usuwając otaczające ją tkanki (mięśnie i tkankę łączną).
  6. Założyć szew (bez igły tnącej) wokół tchawicy. Nie dokręcaj go jeszcze.
  7. Użyj małego cewnika do żył obwodowych (20 G) do "intubacji" tchawicy. Zachowaj ostrożność podczas wprowadzania cewnika, aby uniknąć rozerwania tchawicy. Należy pamiętać, że największa średnica tchawicy znajduje się tuż poniżej chrząstki pierzastego.
  8. Zaciśnij szew wokół tchawicy/cewnika. Wyjąć igłę, pozostawiając tylko plastikową kaniulę cewnika do tchawicy. Igła służyła jedynie jako prowadnik do wprowadzania plastikowej kaniuli.
  9. Po zamocowaniu plastikowej kaniuli w tchawicy, przetnij mięśnie brzucha, otwórz brzuch i odsłoń przeponę.
  10. Za pomocą igły nakłuć przeponę, aby wytworzyć odmę opłucnową (tj. wprowadzenie powietrza do jamy opłucnej). Płuca powinny być wtedy zapadnięte.
  11. Za pomocą małych nożyczek usuń przeponę, przetnij wzdłuż mostka (sternotomia), usuń klatkę piersiową i odsłoń serce i płuca.
  12. Przez plastikową kaniulę wprowadzoną do tchawicy utrwalić płuca roztworem formaldehydu pod ciśnieniem 30 cmH2O.
  13. Usuń płuca i umieść je w 4% PFA na 24 godziny, a następnie w 70% roztworze EtOH do czasu przetworzenia.
  14. Zidentyfikuj i usuń serce, wątrobę i nerki. W ten sam sposób umieść je w 4% PFA na 24 godziny, a następnie w 70% roztworze EtOH do czasu przetworzenia.

3. Myszy GFP i wyświetlanie slajdów GFP

  1. Wykonaj CLP i pozorowaną operację na myszach GFP-LC3 zgodnie z opisem w kroku 1 oraz procedury pooperacyjne zgodnie z opisem w kroku 2 protokołu.
  2. Zanurzyć tkanki (tj. płuca, serce, wątrobę i nerki) w parafinie i pociąć je na szeregowe odcinki 5 μm.
  3. Gdy jest gotowy do barwienia GFP, inkubować w temperaturze 60 °C przez 30-60 minut, aż parafina się rozpuści, a tkanka stanie się przezroczysta.
  4. Odparafinować standardową serią stopniowanych ksylenów lub substytutów ksylenu, 5 min ksylenu 1, ksylenu 2 i ksylenu 3, następnie inkubować 3 minuty w stopniowanych seriach EtOH: 100%, 95%, 75%, a następnie spłukać w wodzie destylowanej.
    nuta: Po deparafinowaniu należy unikać wysuszenia tkanek, co zwiększa tło próbki.
  5. Pobrać antygen za pomocą buforu kwasu cytrynowego (10 mM kwasu cytrynianu sodu, 0,05% Tween 20, pH 6,0), podgrzewając w kuchence mikrofalowej przez 10-20 minut. Należy uważać, aby okresowo wymieniać bufor, aby uniknąć wysuszenia tkanek.
  6. Pozostaw roztwór do ostygnięcia przez 20 minut na stole, aby zakończyć pobieranie antygenu.
  7. Umyć 2-3x PBS. Usuń nadmiar bufora i przenieś szkiełka z pozycji zębatej do pozycji poziomej w pudełku na suwaki lub innej wilgotnej komorze, aby zapobiec wysuszeniu.
  8. Blokuj 45-60 minut w temperaturze pokojowej z 10% normalną surowicą osła (również 5% albuminy surowicy bydlęcej lub najlepiej surowicy zwierzęcej, u której wytworzono przeciwciało drugorzędowe) w PBS.
  9. Próbki inkubować w pierwszorzędowym przeciwciałie GFP w rozcieńczeniu 1:100 w PBS przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze. Delikatnie nałóż małe kawałki Parafilmu na tkankę z przeciwciałem, aby zapewnić jednorodny kontakt z tkanką i zapobiec parowaniu.
    nuta: Pozostałe kroki wykonuje się w temperaturze pokojowej.
  10. Przemyć 5x PBS, aby usunąć nadmiar przeciwciał pierwszorzędowych. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym 1:500-1:1,000 w PBS przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
  11. Przemyć 5x PBS, aby usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych. W razie potrzeby na tym etapie przeciwplamić szkiełka.
  12. W przypadku stosowania fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego inkubuj 0,1% Sudan Black w 70% EtOH przez 15-20 minut, aby zmniejszyć autofluorescencję. Zetrzyj nadmiar Sudan Black z okolic chusteczki i przemyj 5x PBS przez 20 min.
  13. Zamocuj próbkę za pomocą szkiełka nakrywkowego i przechowuj poziomo, aż roztwór montażowy stwardnieje.

4. Alternatywny protokół: Bezpośrednie wykrywanie GFP-LC3

  1. Kanuluj i napompuj płuca za pomocą ~500 ml 50/50 v/v OCT PBS.
  2. Osadź w OCT, umieszczając niewielką ilość OCT na dnie krioformy.
  3. Ostrożnie umieść wypreparowany kompleks płuc w formie.
  4. Powoli zamrażać nad metylobutanem schłodzonym przy użyciu suchego lodu.
  5. Dodaj więcej OCT, aż tkanka zostanie całkowicie pokryta i zamrożona w stanie stałym. Przechowywać na suchym lodzie w temperaturze -80 °C.
  6. Za pomocą kriomikrotomu wyciąć odcinki o grubości 5-10 μm, chroniąc je przed światłem. Skrawki i pozostałą tkankę przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Aby przygotować preparaty do obrazowania, wyjmij część z zamrażarki i natychmiast nałóż kroplę PBS, aby zapobiec wysuszeniu.
  8. Utrwal na 30 minut z 4% PFA. Umyć PBS.
  9. Stosować DAPI/Hoescht przez 10 min. Umyć 3x PBS.
  10. Zamocuj próbkę za pomocą szkiełka nakrywkowego i przechowuj poziomo, aż roztwór montażowy stwardnieje.
  11. Obraz za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.

5. Przygotowanie tkanki do mikroskopii elektronowej

  1. Pokrój tkanki w kostkę o grubości około 1 mm w celu utrwalenia.
  2. Utrwal tkankę w 2% formaldehydzie, 2,5% aldehydzie glutarowym w 0,1 M buforze kakodylanu sodu, pH 7,4.
  3. Przemyć 0,1 M buforem kakodylanu sodu przez 1-2 godz.
    nuta: Utrwalona tkanka może być przechowywana w 0,1 M kakodylanu sodu w temperaturze 4 °C.
  4. Post fix w 1% tetratlenku osmu w 0,2 M buforze kakodylanu sodu przez 1 godzinę.
  5. Płukać w 0,2 M buforze kakodylanu sodu przez 10 min 3x.
  6. Odwodnić w 70% EtOH, 20 min 2x. Odwodnić w 90% EtOH, 10 min 2x. Odwodnić w 100% EtOH, 20 min 2x.
  7. Inkubować z tlenkiem propylenu (epoksydowo-propanem) przez 10 minut 2x.
  8. Inkubować z mieszaniną tlenku propylenu i żywicy epoksydowej (50:50) przez 1 godzinę. Mieszanina żywic epoksydowych to: 24 g żywicy Agar 100, 13 g bezwodnika dodecenylobursztynowego, 13 g bezwodnika metylonadynowego i 1 ml N-benzylodimetyloaminy. Dokładnie wymieszaj w jednorazowej zlewce za pomocą drewnianej szpatułki.
  9. Inkubować z żywicą epoksydową przez noc w niezakorkowanych fiolkach (pozwala to na odparowanie pozostałego tlenku propylenu).
  10. Zatopić w oznakowanych kapsułkach ze świeżo przygotowaną żywicą. Polimeryzować w temperaturze 60 °C przez 48 godzin.
  11. Sfotografować skrawki tkanek za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego przy napięciu 80 lub 60 kV na film mikroskopu elektronowego. Wydrukuj obrazy na papierze fotograficznym lub przechowuj jako nośnik cyfrowy.
  12. Przeanalizuj tworzenie autofagosomów w nienaruszonych komórkach zawierających jądro. Pola o małej mocy (np. 2000-4000X) mogą być używane do identyfikacji komórek jądrzastych. Zazwyczaj do tej kwantyfikacji autofagosomów używa się obrazów 6,800-10,000X. Policz autofagosomy na jednostkę powierzchni z 15-30 pól, aby uzyskać odpowiednią reprezentację statystyczną. Autofagosomy mają strukturę podwójnej błony, gdzie autofogosomy w późnym stadium przypominały wypełnione wakuole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Bakteremia występuje u myszy już 6 h po sepsie wywołanej przez CLP14. Objawy kliniczne sepsy (w tym dreszcze, tachypnoe i upośledzona aktywność ruchowa) pojawiają się około 12 h po zabiegu. Myszy poddane CLP zaczynają ginąć około 18 h po indukcji zapalenia otrzewnej. Im cięższy przebieg sepsy, tym wyższa śmiertelność15. Szczegółowo, sepsa o wysokim stopniu ciężkości powoduje 100% śmiertelność w ciągu 2-3 dni, podczas gdy sepsa o średnim stopniu ciężkości skutkuje około 60% śmiertelnością w 7 dni po ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Główną zaletą CLP jest to, że pozwala naukowcom badać sepsę o różnym nasileniu (tj. od niskiego, przez średnie, aż do wysokiego stopnia). Na nasilenie posocznicy indukowanej ma wpływ długość podwiązanego jelita ślepego (co jest najważniejszym wyznacznikiem), wielkość igły użytej do nakłucia oraz liczba wykonanych otworów15. Ponadto szczep myszy i płeć mogą mieć wpływ na nasilenie sepsy; Niektóre szczepy są bardziej podatne niż inne, a samce są na ogół bardziej podatne niż samice19,20. Powyż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH granty P01 HL108801, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, dla A. M. K. Choi. S. Ryter otrzymał wsparcie płacowe od Instytutu Badań nad Układem Oddechowym Lovelace

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
GFP-LC3 Transgeniczne myszyRiken (JaponiaRBRC00806GFP-LC3#53
KsylazynaHenry-Schein568-0606Ksylazyna HCl do wstrzykiwań Vet
KetaminaHenry-Schein995-2949Ketaset Inj 100 mg / ml
EtOHFisherA405-20Klasa histologiczna
EtOHFisherA407-1do sterylizacji
jedwabne szwy chirurgiczne 6-0Owens & Minor2300-0078OG, 017624
buprenorfina-HClHenry-Schein614-5157Buprenex Ampułki
roztwór paraformaldehydu (37%)JT BakerS898-09
ksylenyFisherX3P-1GAL
monoklonalne anty-GFPLife TechnologiesG10362
HoeschtSigma944403
DAPIInvitrogenD1306
OCTVWR scientific25608-930
Sudan BlackSanta Cruzsc-203760
EM grade Aldehyd glutarowy 2,5% w kakodylan soduMikroskopia elektronowa Sciences15960
tlenek propylenuŻywica Sigma240397
Agar 100Agar scientific R1045
bezwodnik dodecenylsztynowySigma46346
bezwodnik metylonadowySigma45359
N-benzylodimetyloaminaSigma185582
przeciwciało

Bibliografia

  1. Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
  2. Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
  3. Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
  4. Rivers, E., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. Med, shock.N. .E. ngl.J. . 345, 1368-1377 (2001).
  5. Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).
  6. Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
  7. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
  8. Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
  9. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  10. Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
  11. Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
  12. Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
  13. Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
  14. Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
  15. Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
  16. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  17. Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
  18. Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
  19. Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
  20. Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
  21. Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
  22. Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ligacja i punkcja kątnicymodel sepsyocena autofagiimyszy GFP-LC3mikroskopia elektronowapobieranie tkanekprocedura chirurgicznatworzenie autofagosomówsepsa polimikrobowaznieczulenie myszy
Podwiązanie jelita ślepego i sepsa wywołana nakłuciem jako model do badania autofagii u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.