Eksperymentalna sepsa może być wywołana u myszy za pomocą metody podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP). Aktualne protokoły oceny autofagii in vivo w kontekście sepsy wywołanej CLP przedstawiono tutaj: Protokół pomiaru autofagii przy użyciu myszy (GFP)-LC3 oraz protokół pomiaru tworzenia autofagosomów za pomocą mikroskopii elektronowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podwiązanie jelita ślepego i sepsa wywołana nakłuciem jako model do badania autofagii u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Eksperymentalna sepsa może być wywołana u myszy za pomocą metody podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP), która powoduje posocznicę wielomikrobiologiczną. W tym przypadku zapewniony jest protokół indukowania sepsy o różnym nasileniu u myszy przy użyciu techniki CLP. Autofagia jest podstawową reakcją tkanek na stres i inwazję patogenów. Przedstawiono tu również dwa aktualne protokoły oceny autofagii in vivo w kontekście eksperymentalnej sepsy. (I) Transgeniczne myszy eksprymujące białko fuzyjne białka zielonej fluorescencji (GFP)-LC3 są poddawane CLP. Miejscowe wzmocnienie sygnału GFP (puncta), oceniane za pomocą testów immunohistochemicznych lub konfokalnych, może być stosowane do wykrywania zwiększonego tworzenia autofagosomów, a tym samym zmienionej aktywacji szlaku autofagii. (II) Zwiększone tworzenie autofagicznej wakuoli (autofagosomu) na jednostkę powierzchni tkanki (jako marker stymulacji autofagii) można określić ilościowo za pomocą mikroskopii elektronowej. Badanie autofagicznych odpowiedzi na sepsę jest kluczowym elementem zrozumienia mechanizmów, za pomocą których tkanki reagują na zakażenie. Wyniki badań w tej dziedzinie mogą ostatecznie przyczynić się do zrozumienia patogenezy sepsy, która stanowi poważny problem w medycynie intensywnej terapii.
Wprowadzenie
Sepsa, ogólnoustrojowa reakcja zapalna na infekcję, stanowi główną przyczynę zgonów u pacjentów w stanie krytycznym1. Zakażenia wewnątrzbrzuszne, często prowadzące do sepsy wielodrobnoustrojowej, stanowią 20% przypadków sepsy, które charakteryzują się znaczną śmiertelnością sięgającą nawet 60%2. Śmiertelność związana z sepsą wynika przede wszystkim z dysfunkcji wielonarządowej z późniejszą niewydolnością narządową3,4. Pilnie potrzebne są dodatkowe badania nad mechanizmem patogennym tej choroby, aby wspierać rozwój nowych i skuteczniejszych terapii.
Metoda podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP) jest pows....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Brigham and Women's Hospital/ Harvard Medical School Area zatwierdził następujące procedury.
1. Podwiązanie i nakłucie jelita ślepego
Użyj myszy o tym samym pochodzeniu (C57Bl/6), samce, 8-10 tygodni. Samice myszy są bardziej odporne niż samce na śmiertelność wywołaną sepsą. Myszy starsze niż 8 tygodni dają mniej zmienne wyniki niż młodsze myszy pod względem przeżycia po CLP. Do analizy przeżycia należy użyć około N = 10 myszy na porównywaną grupę. N = 3-5 myszy jest odpowiednie do testów autofagii.
- Używaj sterylnych m....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Bakteremia występuje u myszy już 6 h po sepsie wywołanej przez CLP14. Objawy kliniczne sepsy (w tym dreszcze, tachypnoe i upośledzona aktywność ruchowa) pojawiają się około 12 h po zabiegu. Myszy poddane CLP zaczynają ginąć około 18 h po indukcji zapalenia otrzewnej. Im cięższy przebieg sepsy, tym wyższa śmiertelność15. Szczegółowo, sepsa o wysokim stopniu ciężkości powoduje 100% śmiertelność w ciągu 2-3 dni, podczas gdy sepsa o średnim stopniu ciężkości skutkuje około 60% śmiertelnością w 7 dni po .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Główną zaletą CLP jest to, że pozwala naukowcom badać sepsę o różnym nasileniu (tj. od niskiego, przez średnie, aż do wysokiego stopnia). Na nasilenie posocznicy indukowanej ma wpływ długość podwiązanego jelita ślepego (co jest najważniejszym wyznacznikiem), wielkość igły użytej do nakłucia oraz liczba wykonanych otworów15. Ponadto szczep myszy i płeć mogą mieć wpływ na nasilenie sepsy; Niektóre szczepy są bardziej podatne niż inne, a samce są na ogół bardziej podatne niż samice19,20. Powyż.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez NIH granty P01 HL108801, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, dla A. M. K. Choi. S. Ryter otrzymał wsparcie płacowe od Instytutu Badań nad Układem Oddechowym Lovelace
.....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| GFP-LC3 Transgeniczne myszy | Riken (Japonia | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Ksylazyna | Henry-Schein | 568-0606 | Ksylazyna HCl do wstrzykiwań Vet |
| Ketamina | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg / ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Klasa histologiczna |
| EtOH | Fisher | A407-1 | do sterylizacji |
| jedwabne szwy chirurgiczne 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorfina-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampułki |
| roztwór paraformaldehydu (37%) | JT Baker | S898-09 | |
| ksyleny | Fisher | X3P-1GAL | |
| monoklonalne anty-GFP | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Aldehyd glutarowy 2,5% w kakodylan sodu | Mikroskopia elektronowa Sciences | 15960 | |
| tlenek propylenu | Żywica Sigma | 240397 | |
| Agar 100 | Agar scientific | R1045 | |
| bezwodnik dodecenylsztynowy | Sigma | 46346 | |
| bezwodnik metylonadowy | Sigma | 45359 | |
| N-benzylodimetyloamina | Sigma | 185582 |
Bibliografia
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
- Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
- Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
