Zastosowanie fali uderzeniowej w hodowlach komórkowych

Podsumowanie

Fale uderzeniowe są obecnie dobrze znane ze swoich efektów regeneracyjnych. W związku z tym eksperymenty in vitro cieszą się coraz większym zainteresowaniem. W związku z tym opracowaliśmy model do badań fal uderzeniowych in vitro (IVSWT), który umożliwia nam naśladowanie warunków in vivo, unikając w ten sposób rozpraszających efektów fizycznych.

Streszczenie

Fale uderzeniowe są obecnie dobrze znane ze swoich efektów regeneracyjnych. Wyniki badań podstawowych wykazały, że fale uderzeniowe powodują biologiczny bodziec skierowany do komórek lub tkanek bez żadnych późniejszych uszkodzeń. W związku z tym eksperymenty in vitro cieszą się coraz większym zainteresowaniem. Opisano różne metody nakładania fal uderzeniowych na hodowle komórkowe. Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie istniejące modele koncentrują się na tym, jak najlepiej zastosować fale uderzeniowe do komórek.

Pozostaje jednak pytanie: Co dzieje się z falami po przejściu hodowli komórkowej? Różnica między impedancją akustyczną pożywki do hodowli komórkowej a otaczającym powietrzem jest tak duża, że ponad 99% fal uderzeniowych zostaje odbitych! W związku z tym opracowaliśmy model, który składa się głównie z pojemnika zbudowanego z pleksiglasu, który umożliwia rozchodzenie się fal w wodzie po przejściu przez hodowlę komórkową. Pozwala to uniknąć efektów kawitacji, a także odbicia fal, które w przeciwnym razie zakłóciłyby nadchodzące. Dzięki temu modelowi jesteśmy w stanie naśladować warunki in vivo, a tym samym zdobywać coraz większą wiedzę na temat tego, w jaki sposób bodziec fizyczny fal uderzeniowych jest przekształcany w biologiczny sygnał komórkowy ("mechanotransdukcja").

Wprowadzenie

Fale uderzeniowe to fale ciśnienia dźwięku powstające w wyniku nagłego uwolnienia energii, np. jako grzmot podczas błyskawicy. W medycynie fale uderzeniowe są stosowane od ponad 30 lat w litotrypsji do rozpadu kamieni nerkowych. Od czasu przypadkowego stwierdzenia pogrubienia kości biodrowej u pacjentów z litotrypsją na początku lat 80. XX wieku, przeprowadzono pierwsze badania w celu oceny wpływu leczenia falą uderzeniową (SWT) na gojenie się kości¹. Można zaobserwować imponujące wyniki poprawy gojenia się niezrostów kości długich². Następnie wskazania rozszerzono na rany tkanek miękkich³. Wyniki badań podstawowych wykazały, że fale uderzeniowe powodują biologiczny bodziec w tkance docelowej bez żadnych późniejszych uszkodzeń. Po uwolnieniu angiogennych czynników wzrostu (np. VEGF, PlGF, FGF) następuje znaczna angiogeneza. Doprowadziło to do dalszego rozszerzenia wskazań w kierunku patologii niedokrwiennych. Nasza grupa i inni wykazali pozytywny wpływ SWT na chorobę niedokrwienną serca w modelach zwierzęcych, a także w badaniach klinicznych^4-6.

Jednak dokładny mechanizm przekształcania fizycznego bodźca SWT w sygnał biologiczny (mechanotransdukcja) pozostaje w dużej mierze nieznany. Ponieważ zainteresowanie SWT ze strony kilku dziedzin medycyny stale rośnie, poszukiwanie tego mechanizmu staje się coraz bardziej intensywne. Dlatego eksperymenty z falą uderzeniową in vitro zyskują na znaczeniu. Oprócz zmniejszenia liczby doświadczeń na zwierzętach i opłacalności, największą zaletą leczenia falą uderzeniową in vitro (IVSWT) może być możliwość zbadania specyficznego zachowania określonego typu komórek. W regeneracji tkanek za pośrednictwem fali uderzeniowej najprawdopodobniej zaangażowane są wszystkie komórki leczonej tkanki, a nawet omawiane są skutki ogólnoustrojowe. Niemniej jednak każdy typ komórki odgrywa określoną rolę i ma swoją własną wewnętrzną funkcję. IVSWT umożliwia nam wykrycie tej konkretnej funkcji, a tym samym pozwala nam lepiej zrozumieć złożone procesy leżące u jej podstaw.

Dzisiejsza wiedza na temat wpływu fali uderzeniowej na hodowle komórkowe obejmuje wzrost proliferacji, zmianę receptorów błony komórkowej, wzrost i przyspieszenie różnicowania komórek, uwalnianie czynników wzrostu i chemo-atraktantów, a także zwiększoną migrację komórek^7-9.

Rozpraszające efekty fizyczne w większości modeli in vitro Opisano różne metody stosowania fal uderzeniowych na hodowlach komórkowych. Fakt ten prowadzi do problemu, że bardzo trudno jest porównać wyniki, ponieważ fizyczne warunki stymulacji komórek są dość różne między tymi modelami. Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie istniejące modele koncentrują się na tym, jak najlepiej zastosować fale uderzeniowe do komórek.

Pozostaje jednak pytanie: Co dzieje się z falami po przejściu hodowli komórkowej? Główny problem polega na tym, że różnica impedancji akustycznej pożywki do hodowli komórkowej i otaczającego powietrza jest tak duża, że ponad 99% fal uderzeniowych zostaje odbitych (rysunek 1).

Ze względu na różnicę w impedancji akustycznej dwóch mediów, fale nie tylko odbijają się, ale następuje przesunięcie fazowe o 180°, co powoduje silne siły rozciągające na komórki Rysunek 2.

Impedancja akustyczna jest definiowana jako iloczyn gęstości materiału i jego prędkości dźwięku Z=ρ x c. Dla wody impedancja akustyczna wynosi ZWater= 1 440 000 Ns/m³, dla powietrza tylko 420 Ns/m³. Duża różnica tych dwóch wartości powoduje odbicie i przesunięcie fazowe fal uderzeniowych. Przesunięcie fazowe zamienia impuls dodatniego ciśnienia w falę rozciągającą.

Nawet jeśli ta siła rozciągająca nie jest szkodliwa dla komórek, przeszkadza ona w naśladowaniu efektów fali uderzeniowej in vivo in vitro. In vivo te siły rozciągające prawie nie występują ze względu na duże struktury ciała.

Ponadto, fale biegnące z tyłu mogą nawet przeszkadzać tym nadchodzącym. Może to powodować zakłócenia. Znane są dwa rodzaje zakłóceń. Interferencja konstruktywna oznacza, że obie fale są dodawane, co skutkuje podwojeniem amplitudy Rysunek 3. Interferencja destrukcyjna występuje, gdy fale spotykają się ze sobą diametralnie przeciwstawnymi. Powoduje to zniesienie fal (rys. 3). Dlatego IVSWT potrzebuje modelu, który umożliwia rozchodzenie się fal uderzeniowych po przejściu przez hodowlę komórkową.

Kąpiel wodna IVSWT

Rozważania wynikające z wyżej wymienionych obaw doprowadziły nas do zaprojektowania kąpieli wodnej w celu uniknięcia opisanych problemów Rysunek 4. Zasadniczo składa się z pojemnika zbudowanego z pleksiglasu z membraną do łączenia każdego rodzaju aplikatora fali uderzeniowej. Do sprzężenia między tą membraną a aplikatorem należy użyć żelu do transmisji ultradźwięków. Łaźnia wodna jest napełniana odgazowaną wodą, aby uniknąć kawitacji, która wystąpiłaby, gdyby gaz został rozcieńczony w wodzie. Grzałka na dole z czujnikiem temperatury podłączonym do jednostki sterującej umożliwia regulację temperatury w celu imitacji warunków in vivo i uniknięcia wychładzania się kultur komórkowych podczas zabiegu. Temperaturę można utrzymać na stałym poziomie 37 stopni Celsjusza, tak jak ma to miejsce w inkubatorze. Uchwyt na próbki komórek pozwala na zanurzenie dowolnego rodzaju kolby hodowlanej lub probówki. W związku z tym naczynie na próbkę musi być całkowicie wypełnione pożywką hodowlaną, ponieważ pęcherzyki powietrza blokowałyby fale uderzeniowe! Absorber w kształcie klina na tylnej ścianie wanny niszczy fale, aby nie odbijały się i nie cofały, aby uniknąć zakłóceń.

Kolejną zaletą innych modeli IVSWT jest możliwość zmiany odległości między aplikatorem a kolbami hodowlanymi. Wyniki naszej grupy i innych osób korzystających z tego modelu wyraźnie pokazują, że każdy typ komórek reaguje bardzo specyficznie na różne parametry leczenia. Co więcej, określenie odległości między źródłem fal a próbką ma kluczowe znaczenie, ponieważ pozwala nam kontrolować ogniwa, aby znajdowały się w określonej pozycji w stosunku do ogniska aplikatora fali uderzeniowej.

Protokół

Etyczne uprawnienie

Po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody pacjentów, pobrano pępowinę z cesarskiego cięcia na Oddziale Ginekologii w celu wyizolowania ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Zgodę uzyskała komisja etyczna Uniwersytetu Medycznego w Innsbrucku (nr UN4435).

1. Przygotuj kąpiel wodną IVSWT

1. Przygotuj 3,5 l wody z kranu w odpowiednim zbiorniku. Woda musi być podgrzana do temperatury 37 °C (patrz protokół 6).
2. Wlej wodę do łaźni wodnej, aż poziom wody znajdzie się około 3 cm poniżej krawędzi. Zwróć uwagę, aby całkowicie pokryć membranę wodą. Będzie to wymagało około przygotowanych 3,5 l.
3. Podłącz czujnik temperatury do zasilania.
4. Umieść czujnik w przeznaczonej do tego oprawce na tylnej ścianie łaźni wodnej.
5. Podłącz ogrzewanie do zasilania czujnika temperatury. Nie rób tego bez wody w wannie, ponieważ grzejnik stopi pleksi.
6. Poczekaj, aż woda osiągnie stabilną temperaturę 37 °C. Regularnie mieszaj wodę patyczkiem, aby zagwarantować stałą temperaturę przez cały czas trwania kąpieli wodnej.

2. Przygotowanie komórek i kolb hodowlanych

1. Komórki nasienne przez noc o pożądanej gęstości w kolbach hodowlanych T25 lub hodować komórki w kolbach bezpośrednio, aż osiągną pożądaną konfluencję.
2. Przed eksperymentem ustaw kolby pionowo.
3. Napełnij kolby hodowlane pożywką hodowlaną aż do momentu znalezienia się tuż pod szyjką. Nie wlewać zbyt dużej ilości pożywki do kolb, ponieważ medium stykające się z szyjką lub nakrętką zamykającą może zostać zanieczyszczone.
4. Przykręcić kolby z solidnymi nakrętkami bez filtrów, aby zapobiec zanieczyszczeniu wodą. Należy pamiętać, że woda w wannie i sama kąpiel nie są sterylne.
5. Uszczelnić nakrętki preparatem Parafilm przed włożeniem do łaźni wodnej.
6. Zamocuj szczelnie zamknięte kolby hodowlane w dostarczonym stojaku.
7. Włożyć stałą kolbę do łaźni wodnej. Zwróć uwagę, aby środek kolby do hodowli komórkowej znajdował się na tej samej wysokości co środek membrany aplikatora fali uderzeniowej. Prowadzi Cię linia z boku wanny.

3. Zdefiniuj parametry leczenia

1. Określ odległość między źródłem fali uderzeniowej a próbką. Zidentyfikuj idealne parametry leczenia, przeprowadzając eksperyment pilotażowy polegający na znalezieniu parametrów, jak opisano na rysunku 6.
2. Wybierz odpowiednie parametry zabiegu (energia, strumień energii, gęstość, częstotliwość) na urządzeniu do fal uderzeniowych. Ponownie zapoznaj się z rysunkiem 6.

4. Aplikacja fali uderzeniowej

1. Nałóż dużą ilość dostępnego na rynku żelu do transmisji ultradźwięków na aplikator fali uderzeniowej, a także na membranę łaźni wodnej. Ma to na celu zapewnienie sprzężenia. Między aplikatorem a membraną nie powinno znajdować się powietrze ani pęcherzyki powietrza, ponieważ pochłaniałyby one fale uderzeniowe.
2. Podłącz aplikator do membrany i trzymaj go stabilnie na środku membrany. Uważaj, aby był wyrównany w poziomie.
3. Upewnij się, że prawidłowe pionowe położenie sondy wewnątrz łaźni wodnej jest zgodne ze wskazanym oznaczeniem z boku wanny.
4. Trzymać środki aplikatora i kolby stabilnie w linii poziomej.
5. Aktywuj urządzenie do fal uderzeniowych i aplikuj impulsy, utrzymując kolbę hodowlaną oraz aplikator w stabilnej pozycji podczas całego zabiegu.

5. Po leczeniu

1. Wyjąć kolbę hodowlaną z łaźni wodnej.
2. Osusz go zwykłymi ręcznikami papierowymi.
3. Dokładnie przetrzeć kolbę środkami dezynfekującymi.
4. Usuń uszczelkę i nasadkę Parafilm.
5. Odpipetować pożywkę znajdującą się wewnątrz kolb do probówek odśrodkowych.
6. Odpowiednio odwirować. Parametry wirowania zależą od rodzaju użytego ogniwa, np. W przypadku HUVEC należy użyć 290 g w temperaturze pokojowej.
7. Dodać 5 ml pożywki do hodowli komórkowej do kolby. Zawiesić odwirowany osad komórkowy z 2 ml pożywki do hodowli komórkowych. Odpipetować zawiesinę do kolby. W ten sposób fragmenty komórek lub komórki, które mogły zostać oderwane podczas leczenia, nie gubią się.

Pułapki

1. Przygotowanie, jak również obróbka, powinny być przeprowadzane w sterylnych warunkach wewnątrz przepływu laminarnego, aby uniknąć zanieczyszczenia hodowli komórkowej.
2. Zaleca się dobrą praktykę hodowli komórkowych, aby uniknąć zanieczyszczenia sond. W szczególności zdecydowanie zaleca się dezynfekcję zewnętrznej strony kolb przed ponownym umieszczeniem ich w inkubatorze. Kąpiel wodna, podobnie jak woda w środku, nie jest sterylna!
3. Nie podłączaj grzejnika do zasilania, chyba że łaźnia wodna jest napełniona wodą, aby uniknąć uszkodzenia wanny zbudowanej z pleksiglasu.
4. Użyj dużych ilości żelu ultradźwiękowego na aplikatorze fali uderzeniowej, aby zagwarantować prawidłowe sprzężenie i rozchodzenie się fali do kąpieli. Powietrze, a nawet małe pęcherzyki powietrza pochłaniają fale uderzeniowe!
5. Sprawdź położenie sond wewnątrz łaźni wodnej w stosunku do aplikatora, aby zapewnić obróbkę całego obszaru wzrostu.
6. Nie zanurzaj sond zbyt głęboko w wodzie, aby uniknąć zanieczyszczenia.

Wyniki

Stosując opisaną metodę, poddaliśmy działaniu fal uderzeniowych ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVECs), które wcześniej wyizolowaliśmy z pępowin. Pępowiny pobrano podczas planowych cięć cesarskich.

Komórki HUVEC przy konfluencji 90% w kolbie hodowlanej T25 poddano terapii systemem fal uderzeniowych elektrohydraulicznych. Parametry zabiegu obejmowały gęstość strumienia energii 0,1 mJ/mm² oraz częstotliwość 5 Hz. Z odległości 5 cm od źródła fal uderzeniowych do warstwy k...

Dyskusja

Znaczenie proponowanego modelu dla leczenia falą uderzeniową in vitro polega na tym, że fale mogą rozchodzić się po przejściu przez hodowlę komórkową, w przeciwieństwie do istniejących modeli. W ten sposób można uniknąć zakłócających skutków fizycznych, takich jak siły rozciągające. Model ten bardziej przypomina warunki panujące in vivo niż te, w których inni naukowcy przykładają fale bezpośrednio do kolb do hodowli komórkowych.

Dodatkowym atutem jest możliwość zmiany odległo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Urządzenie do fal uderzeniowych Orthogold	Technologie Regeneracji Tkanek, Woodstock, GA – wyprodukowane przez MTS-Europe GmbH, Konstancja, Niemcy
Kąpiel wodna IVSWT V2.0	Johann Hohenegger - Produkty
EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Czynniki wzrostu	Lonza	CC-3156 & CC-4176	Pożywka ta została użyta do pokazanych eksperymentów z HUVEC w celu napełnienia kolby do hodowli komórkowych. W przypadku innych typów komórek użyj zalecanej pożywki.
Pechiney  Parafilm M PM996	Pechiney Opakowanie z tworzywa sztucznego	PH-LF-PM996-EA w labplanet.com	do uszczelniania kolb
Pipety serologiczne Falcon 25 ml	Becton Dickinson Labware	357525
Pipeta serologiczna CellMate II	Matrix Technologies
Skintact Żel ultradźwiękowy	Skintact	UL-01 250 ml
T25 Kolby do hodowli komórkowych	COSTAR	3056
Mikrozid środek dezynfekujący	Schü lke
3,5 l Odgazowana woda
Ręczniki

techniczne papierowe