Artykuł metodologiczny
Sorter robaków ułatwia badania genetyczne u Caenorhabditis elegans, sortując robaki według ekspresji fluorescencyjnych reporterów. W tym miejscu opisujemy nowe zastosowanie: sortowanie według kolonizacji przez patogen wykazujący ekspresję GFP i wykorzystujemy je do zbadania słabo poznanej roli rozpoznawania patogenu w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej.
Sorter robaków to narzędzie analogiczne do maszyny FACS, która jest używana w badaniach nad Caenorhabditis elegans, zazwyczaj do sortowania robaków na podstawie ekspresji fluorescencyjnego reportera. W tym miejscu zwracamy uwagę na alternatywne zastosowanie tego instrumentu do sortowania robaków według stopnia ich kolonizacji przez patogen wykazujący ekspresję GFP. To nowe zastosowanie pozwoliło nam zająć się związkiem między kolonizacją jelita robaka a indukcją odpowiedzi immunologicznej. Chociaż odpowiedzi immunologiczne C. elegans na różne patogeny zostały udokumentowane, nadal nie wiadomo, co je inicjuje. Dwie główne możliwości (które nie wykluczają się wzajemnie) to rozpoznawanie wzorców molekularnych związanych z patogenami oraz wykrywanie uszkodzeń spowodowanych infekcją. Aby odróżnić te dwie możliwości, narażenie na patogen musi być oddzielone od szkód, które powoduje. Sortownik robaków umożliwił oddzielenie robaków, które były w znacznym stopniu skolonizowane przez Gram-ujemny patogen Pseudomonas aeruginosa, z uszkodzeniami prawdopodobnie spowodowanymi przez obciążenie patogenem, od robaków, które były podobnie narażone, ale nie zostały skolonizowane lub zostały skolonizowane w niewielkim stopniu. Te odrębne populacje wykorzystano do oceny związku między obciążeniem patogenem a indukcją transkrypcyjnej odpowiedzi immunologicznej. Wyniki sugerują, że oba są dysocjowane, co potwierdza możliwość rozpoznania patogenu.
Automatyczne sortowanie robaków jest bardzo podobne do FACS, działa poprzez pomiar sygnału fluorescencyjnego w robaku (zazwyczaj dostarczanego przez transgeniczną ekspresję białek reporterowych), gdy przechodzi on wyprostowany w probówce, umożliwiając przekierowanie albo do probówki/studni, albo do pojemnika na odpady zgodnie z parametrami bramkowania ustalonymi przez badacza1. Sorter robaków może ułatwić badania na wiele sposobów; Przykładem zastosowania go jako narzędzia analitycznego jest badanie, w którym śledzono czasoprzestrzenne wzorce aktywności promotora dla prawie 1000 genów2,
Jednak głównym zastosowaniem sortera robaków są badania genetyczne, śledzące docelowe poziomy ekspresji genów lub lokalizację białka fluorescencyjnego wzdłuż osi robaka3-5.
Tutaj opisujemy nowe zastosowanie sortera robaków, w następstwie kolonizacji robaka przez fluorescencyjnie oznakowany patogen. Korzystając z tego narzędzia, skupiliśmy się na związku między kolonizacją/obciążeniem patogenem a odpowiedzią immunologiczną, aby uzyskać nowy wgląd w mechanizmy odpowiedzialne za inicjację odpowiedzi immunologicznej u robaka.
Praktycznie we wszystkich organizmach badanych do tej pory, inicjacja wrodzonych odpowiedzi immunologicznych na patogeny mikrobiologiczne zależy od rozpoznania wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMPs) i/lub wzorców molekularnych związanych z niebezpieczeństwem/uszkodzeniem (DAMPs)6,7. Pierwszym z nich są konserwatywne struktury mikrobiologiczne, które obejmują składniki ściany komórkowej drobnoustrojów, jej wici lub dwuwarstwy lipidowej6; drugi obejmuje obie uwolnione cząsteczki (np. ATP8), zmienione białka lub inne markery zmienionych procesów komórkowych9,10. Oba typy sygnałów są rozpoznawane przez białka oznaczone jako receptory rozpoznawania wzorców (PRR), które po specyficznym związaniu cząsteczki wzorca aktywują łańcuch zdarzeń prowadzących do odpowiedzi ochronnej. C. elegans okazał się niezwykle przydatny jako podatny model do analizy różnych aspektów interakcji gospodarz-patogen, ale jedną rzeczą, która nie jest dobrze poznana, jest to, w jaki sposób odpowiedzi immunologiczne są inicjowane w robaku. Wykazano, że żaden z przypuszczalnych receptorów, które są ortologiczne w stosunku do receptorów rozpoznawania wzorców (PRR) w innych organizmach, nie wiąże PAMP, a wiele ortologów PRR, które są kluczowe dla odpowiedzi immunologicznej w innych organizmach, wykazuje zaskakująco ograniczony wkład w odpowiedzi i oporność na patogeny robaków. Na przykład receptor Drosophila Toll, który jest niezbędny do uodparniania się na patogeny Gram-dodatnie, jest reprezentowany przez C. elegans przez jedyny homolog, tol-1, który przyczynia się do ochrony przed patogenem Gram-ujemnym Salmonella Typhimurium11, ale nie przed innymi badanymi patogenami Gram-ujemnymi lub -dodatnimi11,12 . Obserwacje te, w połączeniu z danymi wskazującymi, że odpowiedzi immunologiczne mogą być indukowane przez zakłócanie translacji białek komórkowych, doprowadziły niektórych do sugestii, że C. elegans wykrywa przede wszystkim DAMPs9,13,14. Niemniej jednak doniesienia opisujące zdolność martwych patogenów do indukowania odpowiedzi immunologicznej sugerują, że wiązanie PAMP może odgrywać ważną rolę w rozpoznawaniu patogenów u C. elegans15,16. Wcześniejsze prace koncentrujące się na odpowiedziach immunologicznych w genetycznie identycznych populacjach C. elegans zsynchronizowanych z wiekiem wykazały dużą indywidualną zmienność w kolonizacji jelit przez bakteryjny patogen Gram-ujemny Pseudomonas aeruginosa.
Jednak badania profilowania transkrypcyjnego traktowały te różnorodnie skolonizowane populacje jako jedną całość17,18. Wykorzystując tę zmienność, opracowaliśmy protokół skupiający automatyczny sortownik robaków na oddzielaniu różnie skolonizowanych populacji Caenorhabditis elegans narażonych na P. aeruginosa wykazujący ekspresję GFP. Badanie ekspresji genów w różnie skolonizowanych populacjach ułatwiło ocenę związku między obciążeniem patogenem (i związanymi z nim uszkodzeniami) a odpowiedziami immunologicznymi oraz dostarczyło nowych informacji na temat rozpoznawania patogenów u C. elegans19. Poniżej opisujemy protokół, który można zastosować do sortowania robaków zakażonych dowolnym patogenem znakowanym fluorescencyjnie.
Potencjalnym użytkownikom powinno się zauważyć, że liczba robaków wymaganych do uporządkowania zależy od charakteru kolejnych analiz i używanych protokołów. Na przykład, w przypadku analizy ekspresji genów mikromacierzy, >1,000 robaków będzie potrzebnych do uzyskania wystarczającej ilości RNA, jeśli stosowane są standardowe protokoły, ale ~100 robaków wystarczy, jeśli zastosuje się amplifikację, co pozwoli na szybkie zbieranie materiału, a tym samym zminimalizuje stres u robaków.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
1. Uzyskanie zsynchronizowanej kultury młodych dorosłych zwierząt
2. Przygotowanie płytek Pseudomonas aeruginosa i infekowanie robaków
3. Konfiguracja sortera robaków
Przed wykonaniem sortowania próbek upewnij się, że maszyna działa prawidłowo. Szczegółowe informacje można uzyskać pod adresem http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, a podstawowe kroki opisano poniżej.
4. Sortowanie robaków skolonizowanych i nieskolonizowanych
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Gdy genetycznie identyczne C. elegans są narażone na P. aeruginosa, obserwuje się szeroki rozkład poziomów kolonizacji (Rysunek 1A). Za pomocą opisanego tutaj protokołu można osiągnąć skuteczne oddzielenie robaków nieskolonizowanych od skolonizowanych (ryc. 1B). W przeciwieństwie do robaków nieskolonizowanych, skolonizowane robaki wykazują oznaki uszkodzeń, takie jak ospałość i zmniejszone wypróżnianie19. To ostatnie może być powodem, dla którego robaki skolo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Metoda, którą opisujemy, wykorzystuje fluorescencyjne znakowanie jednostek znajdujących się poza robakiem, aby śledzić interakcje między robakiem a jego otoczeniem. W przedstawionym przez nas przypadku separacja opierała się na znakowaniu patogenu i została zastosowana do oddzielenia robaków z dużym obciążeniem patogenem od tych bez (lub niewielkich) obciążeń. Późniejsza analiza ekspresji genów nie wykazała różnicy w odpowiedziach immunologicznych między dwiema grupami, co sugeruje, że były one niezależne od obciążenia p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Autorzy dziękują Fundacji Medycznej Ellisona za wsparcie. Pragniemy również podziękować członkom laboratorium Abby Dernburg za pomoc w korzystaniu z sortera robaków.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bufor M9 | przygotowany we własnym zakresie | Przepis w wormbook.org | |
| Ryfampicyna | Sigma | R3501 | |
| Roztwór do przygotowania jaj | przygotowany w domu | 50 ml wody; 40 ml wybielacza; 10 ml 10 N wodorotlenku sodu | |
| Płytki NGM | przygotowane we własnym zakresie | Przepis na | |
| wormbook.org Talerze SKP | przygotowane we własnym zakresie | Przepis taki sam jak NGM: tylko 0,35% peptonu zamiast 0,25% | |
| Kontroluj cząstki testowe | Union Biometrica | 310-5071-001 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie