Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Szlaki immunologiczne polegają na różnych modyfikacjach potranslacyjnych (PTM) białek, aby szybko transdukować sygnały i aktywować odpowiedzi immunologiczne¹. PTM to szybkie, odwracalne i wysoce specyficzne zmiany chemiczne w strukturze białka, które mogą wpływać na konformację, aktywność, stabilność, lokalizację i interakcje białko-białko^2-4. W roślinach zidentyfikowano ponad 300 typów PTM, w tym ubikwitynację, sumoilację, siarczanowanie, glikozylację i fosforylację^2,5. Coraz więcej dowodów wskazuje na znaczenie PTM w różnych aspektach odporności roślin^1,5,6. Fosforylacja białek, odwracalne przyłączanie grupy fosforanowej do reszty seryny, treoniny lub tyrozyny, jest regulatorem wielu funkcji komórkowych i nie jest zaskoczeniem, że jest to najlepiej zbadany PTM w kaskadach sygnalizacji obrony roślin^5-11. Sygnalizacja zależna od fosforylacji jest integralną częścią aktywacji obronnej roślin inicjowanej po zewnątrzkomórkowym postrzeganiu drobnoustrojów przez receptory transbłonowe lub rozpoznawaniu wewnątrzkomórkowym przez wielodomenowe białka oporności^5,8.

Po inwazji na rośliny, mikroby są wykrywane przez receptory błony plazmatycznej zwane receptorami rozpoznawania wzorców (PRR)¹². Znane PRR to albo białka podobne do receptorów (RLP), albo kinazy receptoropodobne (RLK), z których oba zawierają ektodomenę wiążącą ligand i jednoprzebiegową domenę transbłonową. W przeciwieństwie do RLP, RLK mają wewnątrzkomórkową domenę kinazy^13-15. Ektodomena PRR wiąże się z konserwatywnymi cząsteczkami elicytorowymi drobnoustrojów zwanymi wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP), co w przypadku RLK prowadzi do autofosforylacji i transfosforylacji w obrębie domeny wewnątrzkomórkowej ^6,16. Po indukowanej percepcją fosforylacji PRR, późniejsza fosforylacja białek cytoplazmatycznych, w tym kinaz^17,18, ligaz E3¹⁹, kinaz białkowych aktywowanych mitogenem (MAPK)^20,21, kinaz białkowych zależnych od wapnia (CDPK)^22,23 i czynników transkrypcyjnych^24,25, prowadzi do odporności wyzwalanej przez PAMP (PTI).

Oprócz zewnątrzkomórkowej percepcji przez PRR, wewnątrzkomórkowe rozpoznawanie patogenów odbywa się poprzez receptory cytoplazmatyczne. Te wielodomenowe białka oporności (R) zawierają zmienną domenę N-końcową, centralny motyw wiążący nukleotydy (NB) i C-końcowe powtórzenia bogate w leucynę (LRR), a zatem nazywane białkami NB-LRR^26,27. Białka R bezpośrednio lub pośrednio rozpoznają cząsteczki wirulencji pochodzące z patogenu, zwane efektorami, o których wiadomo również, że celują w PRR i inne węzły układu odpornościowego. Rozpoznanie indukuje silne mechanizmy obronne prowadzące do odporności wyzwalanej efektorowo (ETI)^28-31. Białka NB-LRR mają niezbędny motyw wiążący ATP w domenie NB^30,32, ale brakuje im domeny kinazy. Fosforylacja konserwatywnych domen NB-LRR została opisana w zakrojonym na szeroką skalę badaniu proteomicznym³³, ale jej znaczenie dla ETI jest niejasne. Podobnie jak w przypadku PTI, aktywacja białek NB-LRR prowadzi do fosforylacji białek cytoplazmatycznych, w tym MAPK^34-37 i CDPK^38-40. Co najważniejsze, rozpoznawanie efektorów może prowadzić do fosforylacji białek dodatkowych, które oddziałują bezpośrednio z białkami NB-LRR⁴¹. Niektóre przykłady obejmują białka RIN4 (Arabidopsis thaliana) i Pto (pomidor, Solanum lycopersicum), które oddziałują z białkami NB-LRR, odpowiednio RPM1^42,43 i Prf⁴⁴. Podczas zakażenia bakteriami Pseudomonas syringae białko efektorowe AvrB indukuje fosforylację RIN4, najprawdopodobniej przez receptoropodobną kinazę RIPK^45,46. Podobnie w pomidorach efektory P. syringae AvrPto i AvrPtoB indukują fosforylację Pto⁴⁷. W przeciwieństwie do RIN4, który nie ma domeny kinazy i musi być transfosforylowany, Pto jest aktywną kinazą zdolną do autofosforylacji⁴⁸ i transfosforylacji substratów ^49,50. Podczas gdy Pto wymaga aktywności kinazy do zależnej od efektora inicjacji sygnalizacji, mutanty Pto martwe w kinazie są nadal w stanie sygnalizować w sposób niezależny od efektora⁵¹. Niedawno wyjaśniliśmy te obserwacje, wykazując, że kompleks Prf / Pto jest oligomeryczny, zawiera wiele cząsteczek Prf i Pto⁵² i że cząsteczki Pto w tym samym kompleksie mogą się nawzajem transfosforylować⁴⁷. Zaproponowaliśmy model, w którym jedna cząsteczka Pto (czujnika) oddziałuje z białkiem efektorowym, powodując zmianę konformacji białka NB-LRR (Prf), która z kolei aktywuje drugą cząsteczkę Pto (pomocnik) w kompleksie. Następnie cząsteczka pomocniczego Wom transfosforyluje czujnik Pto, prowadząc do pełnej aktywacji kompleksu oporowego⁴⁷.

Te przykłady pokazują, że identyfikacja składników kompleksu immunologicznego i ich potencjalnych PTM po rozpoznaniu efektora może prowadzić do lepszego zrozumienia, w jaki sposób sygnały są przekazywane od percepcji efektora do dalszych celów. W tym miejscu opisujemy metodę oczyszczania białek oddziałujących z NB-LRR i późniejszą identyfikację ich PTM. Jako modelu używamy Nicotiana benthamiana i kompleksu Prf/Pto pomidora, ale ten sam protokół można łatwo zastosować do RLK z N. benthamiana i A. thaliana⁵³ z niewielkimi modyfikacjami, jak opisujemy w protokole.

Uwaga: wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Przygotowanie materiałów roślinnych i

1. Dla N. benthamiana
   1. Hodować szczepy Agrobacterium tumefaciens będące przedmiotem zainteresowania do przejściowej ekspresji (w tym przykładzie Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG i pusty wektor jako kontrola) przez wytrząsanie (200 obr./min) w płynnej kulturze (pożywka L z odpowiednimi antybiotykami) w temperaturze 28 °C do fazy stacjonarnej.
   2. Zebrać i ogranulować agrobakterie przez odwirowanie (3 000 x g przez 5 min). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane agrobakterie w buforze infiltracyjnym.
   3. Zmierzyć ilość agrobakterii, uzyskując wartość gęstości optycznej (OD) przy absorbancji 600 nm (Abs 600 nm). Dostosuj OD bakterii do 0,1-0,8.
   4. Naciekać 4-tygodniowe rośliny N. benthamiana (22 °C, 16 godzin światła) agrobakteriami ręcznie (za pomocą 1 ml strzykawki bezigłowej) lub próżniowo (dodać 0,02% v/v środka powierzchniowo czynnego).
      Uwaga: Użyj pierwszego, prawie w pełni rozwiniętego liścia i dwóch bezpośrednio starszych liści, aby uzyskać najbardziej efektywną ekspresję białka. W celu wykrycia ubikwitynowanych lub acetylowanych białek należy naciekać liście odpowiednio 100 nM MG-132 lub 100 ng/ml Trichostatyny A po 1 i 2 dniach od infiltracji.
   5. Zbierz infiltrowane liście 2-5 dni po infiltracji i zamroź w ciekłym azocie. Próbki należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
      Uwaga: Określ wcześniej najlepszy poziom ekspresji białka, które Cię interesuje, pobierając próbki w ciągu 5 dni i wykrywając poziomy białka za pomocą immunoblottingu.
2. Dla stabilnych linii transgenicznych A. thaliana
   1. Nasiona A. thaliana uprawiać na 6-dołkowych płytkach uzupełnionych 5 ml płynnego podłoża MS (1% w/v sacharozy) na dołek. Umieść od trzech do pięciu nasion (wysterylizowanych i rozwarstwionych) interesującej nas linii transgenicznej lub nieprzekształconej linii kontrolnej na studzienkę. Wstrząsać z prędkością 200 obr./min przez dwa dni przed przeniesieniem płytki do pomieszczenia wzrostowego i pozostawić na 2 tygodnie (22 °C, 10 godzin światła).
   2. Pobrać próbki i zamrozić w ciekłym azocie.
      Uwaga: Możesz użyć jako kontroli linii transgenicznej wyrażającej niepowiązane białko z tym samym znacznikiem, co białko będące przedmiotem zainteresowania.
3. 1. Przygotować bufor A. Odgazować bufor przez 1-2 godziny (dla RLK, innych białek związanych z błoną i białek jądrowych dodać 1% v/v IGEPAL CA-630⁵³).
      Uwaga: Bufor A można przechowywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony. Możesz użyć 1% v/v Triton zamiast IGEPAL CA-360.
   2. Przygotować 80 ml zimnego buforu B co najmniej 1-2 godziny przed ekstrakcją.
      Uwaga: Idealny stosunek buforu tkankowego do ekstrakcyjnego wynosi 1:4 (w/v).

2. Ekstrakcja białka

1. Tuż przed ekstrakcją przygotować 80 ml zimnego buforu C.
   Uwaga: Dodać 10 μM MG-132 w celu wykrycia ubikwitynowanych białek.
2. Zmielić 20 g tkanki N. benthamiana (około 15 liści) lub siewek A. thaliana (2-4 g na płytkę 6-dołkową) w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka.
3. Dodać 80 ml zimnego buforu C do 20 g zmielonej tkanki, dobrze wymieszać i rozmrozić na lodzie.
   Uwaga: Zmielić wszystkie próbki w tym samym czasie (białko będące przedmiotem zainteresowania i kontrolne).
4. Homogenizować w 3 seriach po 10 sekund każdy z pełną prędkością za pomocą homogenizatora tkankowego (wstępnie schłodzonego w temperaturze 4 °C). Przefiltrować przez tkankę o wielkości 22-25 μm i odwirować przy 30 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Alternatywnie homogenizować ze świeżym, wstępnie schłodzonym moździerzem i tłuczkiem.
5. Do etapów blokowania i przemywania matrycy powinowactwa przygotować 20 ml buforu D.
6. Umieścić 100 ml odpowiedniej matrycy powinowactwa przy użyciu 500 ml zimnego buforu D zawierającego 1 % masy ciała przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Preferowane matryce powinowactwa obejmują agarozę anty-FLAG M2, agarozę streptawidyny, GFP-Trap_A i agarozę anty-HA.
7. Przemyć 3x 1 ml zimnego buforu D.
8. Usunąć supernatant ekstraktu z liści i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,45 μm do nowej probówki na lodzie.
   Uwaga: Kolor ekstraktu powinien być zielony lub żółty; Jeśli próbka zmieniła kolor na brązowy, należy ją wyrzucić i zacząć od nowa.
9. Pobrać podwielokrotność surowego ekstraktu do immunoblotu, dodać 5x bufor ładujący SDS-PAGE, odwirować i zdenaturować przez gotowanie próbek przez 10 minut w temperaturze 80-100 °C w bloku grzewczym.

3. Immunoprecypitacja białek

1. Podzielić ekstrakt białkowy na dwie probówki o pojemności 50 ml i dodać 50 μl matrycy powinowactwa zawieszonej w buforze D do każdej probówki. Inkubować z delikatnymi obrotami przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Nie stwierdzono, aby dłuższe inkubacje zwiększały plony.
2. Przygotować 600 μl (6x objętość kulki matrycy powinowactwa) buforu elucyjnego, dodając do buforu D (stężenia końcowe): 0,5% BSA, 0,25 mg/ml peptydu FLAG (dla agarozy anty-FLAG M2) lub 10 mM D-biotyny (dla agarozy Streptawidyny).
   Uwaga: Elucja nie jest zalecana w przypadku matryc GFP-Trap_A i anty-HA, dlatego należy przejść bezpośrednio do wrzenia w buforze ładującym 1x SDS-PAGE, krok 3.11.
3. Wytrącić matrycę powinowactwa przez odwirowanie w temperaturze 4 °C (5 min przy 1 000 x g).
4. Pobrać porcję niezwiązanego ekstraktu na immunoblot, odrzucić resztę supernatantu, pozostawiając około 500 μl na dnie probówki.
5. Ponownie zawiesić roztwór gnojowicy za pomocą końcówki o szerokim otworze.
6. Przenieść zmieszany roztwór zawiesiny z obu probówek do jednej probówki o pojemności 1,5 ml.
   Uwaga: Od teraz używaj 1,5 ml niskobiałkowych probówek do mikrofuge.
7. Pulsować 3x przez 5 sekund za pomocą wirówki stołowej, aby wytrącić matrycę powinowactwa i usunąć supernatant.
8. Przemyć 3-5x 1 ml zimnego buforu D. Pomiędzy płukaniami wytrysnąć matrycę powinowactwa zgodnie z wcześniejszym opisem i wyrzucić supernatant. W ostatnim praniu usuń nadmiar buforu D za pomocą igły strzykawki.
   Uwaga: Końcowe płukanie przy użyciu buforu D z 0,1% IGEPAL może być użyte w celu dalszego zmniejszenia niespecyficznego wiązania.
9. Eluować za pomocą 200 μl odpowiedniego buforu elucyjnego (dla agarozy anty-FLAG M2 lub streptawidyny, patrz krok 3.2) 3x, 5 minut za każdym razem, przy ciągłym wstrząsaniu.
10. Połącz 3 eluaty w jednej probówce. Zagęść białka za pomocą 30 μl żywicy absorpcyjnej. Odstawić na 5 minut i wytrącić żywicę (2 minuty przy 10 000 x g). Odrzucić supernatant.
    Uwaga: W przypadku GFP-Trap_A i agarozy anty-HA należy pominąć kroki 3.9 i 3.10.
11. Dodać 50 μl 1x bufora ładującego SDS-PAGE do wytrąconej matrycy powinowactwa lub żywicy absorpcyjnej. Wirować i gotować przez 10 minut w temperaturze 80-100 °C w bloku grzewczym.
12. Odwirować gotowaną matrycę powinowactwa lub żywicę przez 2 minuty przy 10 000 x g. Podwielokrotność 5 μl supernatantu do immunoblot i przeprowadzić z innymi frakcjami na żel SDS-PAGE o długości ~10 cm (ryc. 2).
13. W celu separacji i identyfikacji fosforylowanych białek za pomocą spektrometrii mas, pozostałe 45 μl należy załadować na żel SDS-PAGE o długości ~19 cm, jeśli wymagana jest dodatkowa separacja (Rysunek 2).
    Uwaga: Między wszystkimi próbkami można umieścić pusty pas ruchu, aby zmniejszyć zanieczyszczenie próbek.

4. Trawienie białek

1. Zabarwić żel SDS-PAGE koloidalną plamą Coomassie Brilliant Blue (cCBB).
   Uwaga: Zminimalizuj obchodzenie się z żelem, aby zmniejszyć zanieczyszczenie keratynami. Upewnij się, że żaden ze sprzętów ani narzędzi nie był używany do immunoblottingu lub innych czynności, które mogły pozostawić resztkowe zanieczyszczenie białkami.
2. Odplamić żel przez obfite mycie w wodzie, najlepiej O/N. Odetnij interesujący nas pasek od żelu czystą żyletką.
   Uwaga: W razie potrzeby wyrównaj żel z immunoblotem, aby zlokalizować właściwy obszar. Ponieważ fosforylacja może opóźnić migrację białek na SDS-PAGE, należy przeciąć obszar bezpośrednio powyżej i poniżej pasma zainteresowania.
3. Plasterek żelu pokrój w kostkę o grubości 2-4 mm (gwarantuje to, że żel zostanie pokryty roztworami w tubce bez zatykania końcówek pipet). Umieść w tubie.
4. Oszacuj objętość potrzebną do utrzymania żelu w głębokim zanurzeniu. Użyj tej ilości do derywatyzacji, inkubacji z ekstrakcją proteazy i peptydów, a następnie użyj podwójnej lub potrójnej objętości do mycia.
   Uwaga: W typowym trawieniu zawierającym około 100 μl pociętych kawałków żelu należy użyć 500 μl roztworu do przemycia, 2 x 180 μl do odwodnienia, 150 μl do redukcji, 120 μl do alkilacji i 120 μl do trawienia.
5. Umyj kawałki żelu 2 x 20 minut (lub do momentu odbarwienia), dodając 50% acetonitrylu (w 50 mM wodorowęglanu amonu, ABC). Odpipetować roztwór, uważając, aby nie usunąć kawałków żelu.
6. Odwodnić 100% acetonitrylem przez 5 minut i usunąć wolny płyn.
   Uwaga: Żel powinien wydawać się skurczony i biały. Jeśli niebieski kolor utrzymuje się, należy inkubować dłużej w acetonitrylu/ABC i/lub w podwyższonej temperaturze (45-55 °C).
7. Zredukuj wiązania dwusiarczkowe białek, dodając 10 mM DTT do wody i inkubuj przez 30-45 minut w temperaturze 56 ºC z wytrząsaniem. Usuń wolny płyn.
8. Reszty alkilatowo-cysteinowe przez dodanie 55 mM chloroacetamidu (w 50 mM ABC) przez 20-30 min (temperatura pokojowa, ciemność). Usuń wolny płyn.
9. Umyj kawałki żelu 2 x 10 min z 50% acetonitrylem (w 50 mM ABC). Usuń wolny płyn.
10. Odwodnić kawałki żelu 100% acetonitrylem przez 5 minut i usunąć wolny płyn.
11. Do trawienia tryptycznego dodać 40 μl roztworu roboczego trypsyny (100 ng trypsyny w buforze wytrawiającym: 50 mM ABC, 5% acetonitrylu dla przeciętnego pasma barwionego Coomassie). Pozostaw kawałki żelu do nawodnienia przez 10 minut. Dodać tyle buforu wytrawiającego, aby w razie potrzeby pokryć kawałki żelu. Inkubować w temperaturze 37 °C O/N.
12. Aby zatrzymać trawienie i wyekstrahować peptydy z kawałków żelu, dodaj 5% kwasu mrówkowego (w 50% acetonitrylu) (dodaj taką samą objętość jak objętość trawienia). Sonikacja przez 5-10 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki. Powtórz ekstrakcję 3 razy.
13. Wysuszyć peptydy przez liofilizację (preferowane) lub koncentrator próżniowy (taki jak Speed-Vac lub Savant). Przechowywać w temperaturze -20 ºC.
14. Prześlij próbkę do spektrometrii mas.
    Uwaga: Przesłaliśmy naszą próbkę do zakładu spektrometrii mas w The Sainsbury Laboratory (Norwich, Wielka Brytania). Protokoły w obiektach spektrometrii mas różnią się znacznie, ale zazwyczaj peptydy są rozpuszczone w 0,2% kwasie trifluorooctowym z 2% acetonitrylem przed załadowaniem do systemu chromatografii cieczowej sprzężonego z tandemową spektrometrią mas z elektrorozpylaniem.

Opisujemy tutaj protokół oczyszczania oznaczonych białek ze stabilnych transgenicznych linii A. thaliana lub po przejściowej ekspresji białek w N. benthamiana. Jak pokazano na rysunku 1, oczyszczanie docelowego białka jest sprzężone ze spektrometrią mas, aby umożliwić identyfikację oddziałujących białek i PTM docelowego białka. Protokół został opracowany do oczyszczania białek zaangażowanych w odporność roślin i identyfikacji ich PTM, ale może być stosowany do oczyszczania dowolnego znakowanego białka roślinnego.

Jako przykład używamy oczyszczania kompleksu Prf/Pto z N. benthamiana. Transgeniczna linia N. benthamiana 38-1254, wyrażająca 35S: Pto, została przejściowo przekształcona w 35S: Prf-FLAG, a kompleks poddano immunoprecypitacji agarozą anty-FLAG M2 (Figura 2A). Immunobloty (IB) na rycinie 2A ilustrują, że większość docelowego białka (Prf) została wytrącona immunologicznie. Pto i oddziałujące białko efektorowe AvrPtoB oczyszczono jednocześnie z Prf i wykryto za pomocą przeciwciał i analizy spektrometrii mas (ryc. 2A i 2B). Odkryliśmy, że Pto, który został oczyszczony z Prf, migrował wolniej w żelu SDS-PAGE, gdy ulegał koekspresji z efektorem, konstruuje 35S: AvrPto i 35S: AvrPtoB (Figura 2A). Oba białka efektorowe indukowały wolniejszą migrację PTO oddziałującego z Prf (Figura 2A). Ta zależna od rozpoznawania efektorowego powolna migracja PTO była wcześniej przypisywana fosforylacji, ponieważ można ją było usunąć przez leczenie fosfatazą44. Aby wykryć miejsca fosforylacji przyczyniające się do powolnej migracji Pto, poddaliśmy kooczyszczający Pto Prf analizie spektrometrii mas. Pomimo wysokiej ekspresji Pto i jej łatwego wykrywania za pomocą immunoblotów, udało nam się odzyskać peptydy pokrywające tylko 57% sekwencji Pto i nie udało nam się zidentyfikować żadnych miejsc fosforylacji (Figura 2B).

Następnie zmieniliśmy strategie, aby celować w białko Pto za pomocą anty-FLAG. N. benthamiana (N. benthamiana) Elektrownie WT zostały przejściowo przekształcone w 35S:Prf-3HA i 35S:Pto-FLAG, z lub bez 35S:AvrPto i 35S:AvrPtoB. Całkowita ilość białka Pto, składającego się zarówno z formy skompleksowanej Prf, jak i wolnej, została immunoprecypitowana agarozą anty-FLAG M2 i poddana frakcjonowaniu SDS-PAGE, trawieniu tryptycznemu w żelu i analizie spektrometrii mas (Figura 2C). Dzięki takiemu podejściu zidentyfikowaliśmy peptydy Pto obejmujące około 80% jego sekwencji i nieznane białko oddziałujące o masie 100 kDa. Zidentyfikowaliśmy zestaw pojedynczych i podwójnych miejsc fosforylacji dla peptydów Pto 187-202 i 188-202 (Tabela 1). Ser-198 i Thr-199 były dominującymi miejscami fosforylacji, ale wykryto również inne miejsca fosforylacji (Tabela 1). Co najważniejsze, podwójna fosforylacja na Ser-198 i Thr-199 została zidentyfikowana tylko w obecności któregokolwiek z białek efektorowych (Tabela 1). Niedawno zidentyfikowaliśmy podobny zestaw miejsc fosforylacji Pto i zilustrowaliśmy znaczenie zdarzenia podwójnej fosforylacji dla sygnalizacji47. Postępując zgodnie z opisanym tutaj protokołem, byliśmy w stanie zidentyfikować dynamiczne zmiany w stanie fosforylacji białka docelowego.

Rysunek 1. Ogólny projekt eksperymentalny. Białko docelowe do immunoprecypitacji (IP) jest znakowane i ulega ekspresji w roślinie, przejściowo w Nicotiana benthamiana lub stabilnie w Arabidopsis thaliana. Po ekstrakcji białka białko docelowe jest immunoprecypitowane z matrycą powinowactwa. Białka są rozdzielane na żelu akrylowym za pomocą elektroforezy. Opaski żelowe są wycinane. Białka są ekstrahowane z prążków żelowych i poddawane spektrometrii mas. Identyfikowane są miejsca fosforylacji i białka oddziałujące na siebie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 2. Immunoprecypitacja Prf i PTO. A). Konstrukcja 35S:Prf-FLAG była przejściowo wyrażona w linii 38-12 (35S:Pto) wraz z pustym wektorem (EV), 35S:AvrPto lub 35S:AvrPtoB. Trzy dni po infiltracji Prf poddano immunoprecypitacji przy użyciu matrycy powinowactwa anty-FLAG. Wykonano immunobloty (IB) w kierunku Prf, AvrPtoB i Pto. Jak wskazują strzałki na dole panelu immunoblot Pto, AvrPto i AvrPtoB indukują wolniejszą migrację Pto. B). Konstrukt 35S:Prf-FLAG był przejściowo wyrażony w linii 38-12 (35S:Pto) wraz z pustym wektorem (EV), 35S:AvrPto lub 35S:AvrPtoB. Trzy dni po infiltracji Prf poddano immunoprecypitacji za pomocą agarozy anty-FLAG i oddzielono na SDS-PAGE. Żel wybarwiono koloidalnym błękitem brylantowym Coomassie (cCBB), a widoczne prążki białek Prf, Pto i AvrPtoB wycięto z żelu i przeanalizowano za pomocą spektrometrii mas. Wskazano procentowe pokrycie peptydami sekwencji Pto i Prf zidentyfikowanych za pomocą spektrometrii mas. C). Konstrukcje 35S:Prf-3xHA i 35S:Pto-FLAG były przejściowo wyrażane wraz z 35S:AvrPtoB, 35S:AvrPto lub pustym wektorem (EV) w N. benthamiana. Trzy dni po infiltracji całkowita ilość Pto-FLAG została immunoprecypitowana za pomocą agarozy anty-FLAG i rozwiązana na SDS-PAGE. Widoczne prążki białkowe oddziałujące z Pto i Pto wycięto z żelu i przeanalizowano za pomocą spektrometrii mas. Pto i pasmo białkowe oddziałujące z Pto o mocy 100 kDa są wyraźnie widoczne na koloidalnym żelu barwionym Coomassie Brilliant Blue (cCBB), podczas gdy Prf jest nieco mniej widoczny (jak wskazują strzałki). IP: Immunoprecypitacja; IB: Immunoblot; CBB: barwienie Coomassie Brilliant Blue; cCBB: koloidalne barwienie Coomassie Brilliant Blue. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Tabela 1. Podwójna fosforylacja peptydu Pto po aktywacji sygnalizacji. 35S:Prf-3xHA i 35S:Pto-FLAG były przejściowo wyrażane wraz z pustym wektorem (EV), 35S:AvrPto lub 35S:AvrPtoB w N. benthamiana. Trzy dni po infiltracji całkowita ilość białka Pto-FLAG została immunoprecypitowana przy użyciu macierzy powinowactwa anty-FLAG i rozwiązana na SDS-PAGE. Widoczne prążki Pto na koloidalnym żelu barwionym na błękit brylantowym Coomassie wycięto i przeanalizowano za pomocą spektrometrii mas. Wskazana jest liczba peptydów Pto zidentyfikowanych ze zdarzeniami fosforylacji 0, 1 i 2.

Tabela 2. Receptury i pożywek.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów (finansowych lub innych).