Opisano ilościową metodę badania spontanicznej migracji komórek w jednowymiarowym, zamkniętym mikrośrodowisku. Metoda ta wykorzystuje mikrofabrykowane kanały i może być stosowana do badania migracji dużej liczby komórek w różnych warunkach w pojedynczych eksperymentach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisana tutaj metoda pozwala na badanie migracji komórek w zamknięciu w jednym wymiarze. Opiera się na wykorzystaniu mikrofabrykowanych kanałów, które narzucają komórkom spolaryzowany fenotyp za pomocą fizycznych ograniczeń. Po wejściu do kanałów komórki mają tylko dwie możliwości: poruszać się do przodu lub do tyłu. Ta uproszczona migracja, w której kierunkowość jest ograniczona, ułatwia automatyczne śledzenie komórek i ekstrakcję parametrów ilościowych w celu opisania ruchu komórek. Parametry te obejmują prędkość komórki, zmiany kierunku i przerwy podczas ruchu. Mikrokanaliki są również kompatybilne z użyciem markerów fluorescencyjnych i dlatego nadają się do badania lokalizacji organelli i struktur wewnątrzkomórkowych podczas migracji komórek w wysokiej rozdzielczości. Wreszcie, powierzchnia kanałów może być funkcjonalizowana za pomocą różnych substratów, co pozwala na kontrolę właściwości adhezyjnych kanałów lub badanie haptotaksji. Podsumowując, opisany tutaj system przeznaczony jest do analizy migracji dużej liczby komórek w warunkach, w których zarówno geometria, jak i biochemiczny charakter środowiska są kontrolowane, ułatwiając normalizację i odtwarzalność niezależnych eksperymentów.
Wprowadzenie
Migracja to złożona funkcja komórkowa, która jest ważna dla wielu procesów fizjologicznych w organizmach wielokomórkowych, w tym rozwoju, odpowiedzi immunologicznych i regeneracji tkanek. Ponadto niektóre sytuacje patologiczne, takie jak inwazja guza i przerzuty, zależą od ruchliwości komórek1. Z tych powodów migracja komórek stała się głównym obszarem badań zarówno w kontekście badań podstawowych, jak i translacyjnych. In vivo większość tkanek charakteryzuje się bogatą macierzą zewnątrzkomórkową i dużą gęstością komórek. Migracja komórek w warunkach fizjologicznych zachodzi zatem w złożonym, zamkniętym środowisku. Klasycznie, najprawdopodobniej ze względów historycznych i ograniczeń technicznych, migrację komórek badano w płaskich systemach 2D, które nie odtwarzają wielu właściwości środowiskowych występujących w tkankach, takich jak uwięzienie. Co więcej, ostatnio wykazano, że czynniki takie jak adhezja komórek, które są niezbędne dla ruchliwości w 2D, niekoniecznie są wymagane do migracji in vivo lub wewnątrz żeli, co sugeruje, że mechanizmy rządzące lokomocją, które rządzą lokomocją, w 2D i w innych środowiskach, są odrębne2. Opracowano kilka systemów naśladujących złożone właściwości tkanek, z których najbardziej znane to żele kolagenowe, które mają na celu rekapitulację właściwości kompozycji macierzy zewnątrzkomórkowej3. W tym miejscu proponujemy mikrokanały jako prostą metodę uzupełniającą, która umożliwia badanie migracji komórek w jednym wymiarze w ograniczonym środowisku.
W tym systemie komórki migrują wzdłuż mikrokanałów, do których wchodzą spontanicznie. Komórki wędrowne nabierają następnie kształtu kanałów, przyjmując geometrię rurkową, która najprawdopodobniej wzmacnia ich polarność. Liniowy ruch komórek w kanałach umożliwia automatyczne śledzenie komórek i ekstrakcję parametrów ilościowych z eksperymentów. Z technicznego punktu widzenia system ten jest łatwy i elastyczny. Powłoką ścianek kanałów można manipulować, dostosowywać rozmiar i kształt kanałów, a w pojedynczych eksperymentach można analizować dużą liczbę komórek. System ten można również rozbudować w celu przeprowadzenia analizy przesiewowej cząsteczek biorących udział w ruchliwości komórek w średnim zakresie. Opisany tutaj protokół został ustandaryzowany przy użyciu komórek dendrytycznych (DC) jako modelu komórkowego. Komórki te mają kluczowe znaczenie dla układu odpornościowego, ponieważ uczestniczą w inicjacji i utrzymaniu specyficznych odpowiedzi immunologicznych4. W badaniach in vitro wykazano, że DC spontanicznie migrują w ograniczonych środowiskach i dlatego są dobrym modelem do badania ruchliwości komórek w mikrokanałach5,6. Co ważne, system ten można rozszerzyć o analizę migracji dowolnego innego typu komórek ruchliwych, takich jak limfocyty T, neutrofile lub komórki nowotworowe7-9.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ważna uwaga: Ten protokół zakłada, że forma zawierająca kształt dla pożądanych mikrokanałów została już wykonana. Dalsze informacje na temat przygotowania formy zostały już opublikowane10. Protokół ten zakłada również, że posiew DC szpiku kostnego jest znany.
1. Produkcja chipów
- Wymieszaj olej PDMS i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1 w plastikowym kubku. Dokładnie wymieszaj oba związki.
- Odlej mieszankę na mikrokanaliki z łożyskiem formy. Całkowita wysokość musi wynosić od 0,5 do 1 cm.
- Usuń pęcherzyki powietrza z dzwonu słoika próżniowego w ciągu 1 godziny.
- Utwardź PDMS w formie, umieszczając go w piekarniku na 2 godziny w temperaturze 65 °C.
- Gdy PDMS osiągnie temperaturę pokojową, wytnij duży kawałek wokół konstrukcji za pomocą ostrza chirurgicznego i oderwij go od formy (ryc. 1A).
- Wywierć otwory, w które zostaną wstrzyknięte komórki (zwykle 2 mm) i zmień rozmiar PDMS za pomocą ostrza chirurgicznego, aby dopasować rozmiar do naczyń ze szklanym dnem, w których będzie oceniana migracja (ryc. 1B). Przed kontynuowaniem usuń resztki kurzu z naczynia za pomocą papieru do czyszczenia soczewek. Sprzyja to wiązaniu PDMS ze szkłem opisanym w kroku 1.10.
- Wyczyść chip PDMS o zmienionym rozmiarze zawierający kanały, przyklejając i odklejając taśmę klejącą po bokach konstrukcji.
- Sonikuj kawałki PDMS przez 30 sekund w 70% etanolu, aby usunąć pyły i małe cząsteczki PDMS. Następnie szybko je wysusz, wydmuchując czyste powietrze.
- Aktywuj PDMS (struktury do góry) i szalki hodowlane za pomocą obróbki plazmą powietrzną (lub tlenową) w ciągu 30 sekund przy 300 mTorr.
- Umieść obie aktywowane powierzchnie w kontakcie, aby trwale przykleić PDMS do podłoża. W razie potrzeby użyj metalowych kleszczyków, aby lekko docisnąć górną część PDMS, aby wymusić kontakt między polimerem a szklanką naczynia (Rysunek 1C).
- Inkubować chipsy w piekarniku w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę, aby wzmocnić wiązanie.
2. Powlekanie mikrokanalików
- Aktywuj całą strukturę za pomocą plazmy powietrznej o temperaturze 300 mTorr przez 1 min. Ułatwi to wejście cieczy do kanałów w następnym kroku.
- Szybko napełnij otwory wejściowe chipa fibronektyną w stężeniu 10 μg/ml w wodzie. Inne podłoża, takie jak PEG, mogą być używane do modyfikowania przylegania komórek do ścian kanału. Zwróć uwagę, aby płyn rozchodził się po całej konstrukcji. Można to łatwo sprawdzić wzrokowo przy zwykłym świetle lub za pomocą zwykłego mikroskopu jasnego pola.
UWAGA: W bardzo małych konstrukcjach, w których dyfuzja jest trudniejsza, wejście cieczy do kanałów można wymusić poprzez umieszczenie struktury w dzwonie słoika próżniowego na co najmniej 15 minut. Aby sprawdzić skuteczność powłoki, można użyć podłoży fluorescencyjnych (rysunek 2). - Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić adsorpcję fibronektyny lub innego podłoża powlekającego do ścianek kanałów.
- Umyj struktury 3x PBS, aby usunąć niezwiązane podłoże.
- Po umyciu należy przejść do protokołu 3 lub przechowywać chip w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia (maksymalnie 24 godziny).
3. Wczytywanie komórek
- Usunąć PBS z płytki i napełnić mikrosystem pożywką komórkową. Pozostawić do inkubacji przez 1 godzinę, aby nasycić kanały pożywką.
UWAGA: W przypadku eksperymentów z udziałem leków, takich jak inhibitory molekularne, zaleca się wstępną inkubację kanałów z pożywką zawierającą lek o odpowiednim stężeniu. Ponadto niektóre leki mają tendencję do rozpuszczania się w strukturze PDMS, co zmniejsza efektywne stężenie. Zaproponowano pewne rozwiązania, które mają przeciwdziałać temu problemowi11-12. - Usuń pływające DC i odzyskaj częściowo przylegające komórki, przepłukując je pożywką hodowlaną. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
UWAGA: W przypadku obrazowania jądra można wcześniej wybarwić Hoechst 33342 poprzez inkubację 2 x 106 komórek w ciągu 30 minut z barwnikiem o stężeniu 200 ng / ml w kompletnym pożywce. Umyj dwukrotnie przez odwirowanie, aby usunąć nadmiar barwnika przed kontynuowaniem protokołu. - Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut (czas i prędkość mogą się różnić w zależności od typu komórki) i wyrzucić pożywkę. Rozcieńczyć osad do uzyskania stężenia 20 x 106 komórek/ml.
- Usunąć nadmiar pożywki z płytki i opróżnić otwory wejściowe w strukturze PDMS za pomocą mikropipety. Wypełnij wpisy 5 μl roztworu komórek, aby uzyskać ilość 1 x 105 komórek w każdym otworze wejściowym.
UWAGA: Wymagana jest wysoka gęstość komórek, aby sprzyjać kontaktowi komórek z kanałami. Niskie zagęszczenie komórek może skutkować małą liczbą komórek wewnątrz kanałów i niepowodzeniem eksperymentu. - Inkubować mikroczip przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Dodać 2 ml kompletnej pożywki do naczynia doświadczalnego.
UWAGA: Cała struktura PDMS musi być pokryta, aby uniknąć wysuszenia komórek podczas eksperymentu. Jeśli 2 ml to za mało, dodaj więcej pożywki, aby całkowicie pokryć strukturę PDMS.
4. Obrazowanie
- Oczyść zewnętrzną dolną powierzchnię naczyń chusteczką do czyszczenia soczewek przed umieszczeniem płytek pod mikroskopem.
- Aby przeanalizować migrację w dużej liczbie komórek, należy użyć 10-krotnego powiększenia i oświetlenia o szerokim polu widzenia w wideomikroskopie wyposażonym w CO2 i temperaturę (ryc. 3). Aby ułatwić śledzenie komórek, można zastosować barwienie Hoechst i światło UV (patrz krok 3.2). Migrację można również analizować za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu uzyskania wyższej rozdzielczości struktur komórkowych podczas migracji.
- W przypadku mikroskopii poklatkowej z prędkością 10X wybierz częstotliwość czasu zgodnie z oczekiwaną prędkością komórki (zwykle 2 minuty dla komórek dendrytycznych migrujących z prędkością 5 μm/min).
nuta: Opisany tutaj protokół nie obejmuje analizy parametrów migracji komórek. W dyskusji wymieniono kilka punktów, które mają doradzić czytelnikom, jak postępować w celu wydobycia informacji z filmów poklatkowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W każdym eksperymencie powierzchnia PDMS jest powlekana cząsteczką dostosowaną do celu badania. Rysunek 2 przedstawia kanały powlekane fluorescencyjną cząsteczką, PLL-g-PEG, przed i po płukaniu (krok 2.4). Taki eksperyment pozwala na kontrolę jednorodności powłoki w kanałach.
Po załadowaniu komórek można przeprowadzić mikroskopię wideo w celu śledzenia migracji komórek. Rysunek 3A przedstawia przykład migracji komórek DC w mikrokanałach przy gęstości odpowiedn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu opisujemy urządzenie złożone z mikrokanałów jako metodę badania właściwości migracyjnych dużej liczby komórek w pojedynczych eksperymentach. Ten eksperymentalny system naśladuje ograniczone ograniczenia środowiskowe występujące w tkankach przez endogenne komórki migrujące. Jednak wymuszając migrację w jednym wymiarze, ułatwia automatyczne śledzenie komórek i ekstrakcję mierzalnych danych (ryc. 5). Pokazujemy również, że nasze urządzenie jest kompatybilne z mikroskopią fluorescencyjną i dlat...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy bardzo cenią platformę PICT IBiSA w Instytucie Curie (CNRS UMR144). Praca została sfinansowana z grantów: Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych dla A-M. L-D (Strapacemi 243103), Association Nationale pour la Recherche (ANR-09-PIRI-0027-PCVI), fundacji InnaBiosanté (Micemico) do M.P. i A-M. L-D i grant ERC Strapacemi dla młodego badacza dla A-M. L-D.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Polidimetylosiloksan (PDMS)GE | Silikony | RTV615 | Pakiet 90% bazy silikonowej i 10% utwardzacza |
| Frez do próbek | rdzeniowych Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Średnica 2,5 mm |
| Naczynie ze szklanym dnem | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
| Myjka ultradźwiękowa | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
| Myjka plazmowa | Harrick Plasma | PDC 32 G | Do małych próbek (35 szalek). Dostępna jest również większa wersja |
| Fibronektyna z osocza bydlęcego | Sigma Aldrich | F0895 | |
| PEG szczepiony polilizyną (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
Bibliografia
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines. J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).
- Steinman, R. M. Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).
- Faure-André, G., et al. Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain. Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).
- Renkawitz, J., et al. Adaptive force transmission in amoeboid cell migration. Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).
- Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).
- Moreau, H., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay. Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).
- Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules. Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).
- Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. Whole-Teflon microfluidic chips. PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).
- Maiuri, P., et al. The first World Cell Race. Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
