Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Streszczenie

Aktywność cytolityczna limfocytów T CD8+ jest rzadko oceniana. Opisujemy tutaj nowy test komórkowy do pomiaru zdolności limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu do zabijania limfocytów T CD4 + obciążonych pokrewnym peptydem. Docelowe limfocyty T CD4 + są podzielone na dwie populacje, znakowane dwoma różnymi stężeniami CFSE. Jedna populacja jest pulsowana peptydem będącym przedmiotem zainteresowania (CFSE-niski), podczas gdy druga pozostaje niepulsująca (CFSE-wysoka). Limfocyty T CD4 + z impulsami i bez impulsów miesza się w równych proporcjach i inkubuje z rosnącą liczbą oczyszczonych limfocytów T CD8 +. Specyficzne zabijanie autologicznych docelowych limfocytów T CD4 + analizuje się za pomocą cytometrii przepływowej po kohodowli z limfocytami T CD8 + zawierającymi specyficzne dla antygenu efektorowe limfocyty T CD8 + wykryte przez barwienie peptydem / tetramerem MHCI. Specyficzna liza docelowych limfocytów T CD4 + mierzona w różnych proporcjach efektorowych w stosunku do celu, pozwala na obliczenie jednostek litycznych, LU₃₀/10⁶ komórek. Ten prosty i nieskomplikowany test pozwala na dokładny pomiar wewnętrznej zdolności limfocytów T CD8 + do zabijania docelowych limfocytów T CD4 +.

Wprowadzenie

Aktywność cytolityczna jest główną funkcją limfocytów T CD8+, ale nadal rzadko jest mierzona, ponieważ testy używane do tego celu są kłopotliwe i trudne do standaryzacji. Dokładny pomiar tej funkcji ma ogromne znaczenie przy charakterystyce funkcji efektorowych limfocytów T CD8 +, ponieważ nie opisano jeszcze wiarygodnych predyktorów skutecznej cytotoksyczności za pośrednictwem komórek^1,2. W tym miejscu proponujemy nowy test funkcjonalny do pomiaru aktywności cytotoksycznej komórek T CD8 + specyficznych dla antygenu na docelowych limfocytach T CD4 +. Opracowano kilka podejść w celu zapewnienia alternatyw dla złotego standardu, testu uwalniania chromu. Przedstawiamy tutaj test komórkowy, który ujawnia cały proces zabijania, ponieważ mierzy śmierć żywych komórek docelowych. Metodę tę wyprowadzono z protokołów testów cytotoksycznych in vivo opartych na cytometrii przepływowej u myszy^4,5 i in vitro u ludzi⁶. W tym protokole limfocyty T CD8 + specyficzne dla antygenu zawarte w całkowitej populacji limfocytów T CD8 + są używane jako komórki efektorowe, a autologiczne limfocyty T CD4 + są używane jako komórki docelowe. Interesujące nas efektorowe limfocyty T CD8 + są wyliczane za pomocą tetramerów MHCI / peptydów⁷. Śmierć komórek docelowych oblicza się na podstawie stosunku limfocytów T CD4 + załadowanych peptydami / niezaładowanych. Wcześniej wykazaliśmy, że metoda ta była powtarzalna, czuła, specyficzna i nie zależała od liczby komórek efektorowych w całej populacji limfocytów T CD8 +⁸. Licząc zarówno liczbę komórek efektorowych, jak i docelowych w teście kokultury, można obliczyć wewnętrzną zdolność limfocytów T CD8 + do zabijania komórek docelowych i wyrazić ją w jednostkach litycznych⁹.

Protokół

1. Przygotowanie efektorowych limfocytów T CD8+

1. Rozmrozić autologiczne kriokonserwowane PBMC (2-3 fiolki po 50 x 10⁶ komórek), przenosząc kriowial z ciekłego azotu do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Umyj komórki, wypełniając probówkę do 50 ml pełnym RPMI (4 mM L-glutaminy i 100 U/ml penicyliny i streptomycyny, uzupełnione 10% FBS). Policz PBMC i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 5 x 10⁶/ml w pełnym RPMI.
3. Dodać specyficzny peptyd (5 μg/ml) i IL-2 (10 ng/ml) do PBMC.
4. Założyć kulturę na płytce z 96 głębokimi dołkami; wysiać 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej studzienki.
5. Po 3 dniach hodowli zastąp połowę pożywki do hodowli komórkowych świeżą, kompletną RPMI.
6. Po 6 dniach hodowli zebrać wszystkie PBMC za pomocą pipety wielokanałowej i przenieść komórki do sterylnego zbiornika.
7. Policzyć, przemyć i ponownie zawiesić PBMC w dawce 5 x 10⁷/ml w zalecanym buforze separacyjnym w 14 ml probówkach z okrągłym dnem. Dodać ludzki koktajl wzbogacający limfocyty T CD8 + o stężeniu 50 μl/ml komórek. Mieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodać cząstki magnetyczne w stężeniu 150 μl/ml i inkubować przez 5 minut.
8. Doprowadzić zawiesinę komórek do objętości 7 ml, dodając bufor rozdzielający. Przystąp do izolacji immunomagnetycznej nietkniętych limfocytów T CD8 +, umieszczając rurkę w magnesie. Po 5 minutach, trzymając probówkę nadal w magnesie, przelej interesujące komórki do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Weź małą porcję i wybarwić komórki przeciwciałami przeciwko CD3 i CD8 w 1X PBS-2% FBS przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Czystość limfocytów T CD8 + można następnie zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej z oczekiwaną czystością 95% lub wyższą.
9. Zawiesić limfocyty T CD8 + w 450 μl z pełnym RPMI.
10. Dodaj 225 μl kompletnego RPMI do 5 probówek z nakrętką.
11. Przygotować seryjne rozcieńczenia (od 1:2 do 1:32), przenosząc 225 μl CD8+ do następnej probówki (patrz górny panel Rysunek 1).

2. Przygotowanie docelowych limfocytów T CD4+

1. Rozmrozić autologiczne kriokonserwowane PBMC (1 fiolka z 50 x 10⁶ komórek) poprzez przeniesienie kriowialu z ciekłego azotu do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml RPMI.
3. Przemyć komórki i ponownie zawiesić PBMC w dawce 5 x 10⁷/ml z buforem separacyjnym w 14 ml probówkach z okrągłym dnem. Dodać koktajl wzbogacający ludzkie limfocyty T CD4 + o stężeniu 50 μl/ml komórek. Mieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodać cząstki magnetyczne w stężeniu 100 μl/ml i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Doprowadzić zawiesinę komórek do objętości 7 ml przez dodanie buforu rozdzielającego. Przystąp do izolacji limfocytów T CD4 +, umieszczając rurkę w magnesie. Po 5 minutach, gdy probówka nadal znajduje się w magnesie, wlej wybrane komórki do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Pobrać małą porcję i wybarwić komórki przeciwciałami przeciwko CD3 i CD4 w 1x PBS-2% FBS przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Czystość limfocytów T CD4 + można następnie zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej z oczekiwaną czystością 95% lub wyższą.
5. Policz limfocyty T CD4 +, podziel je na dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml i umyj w ciepłym 1x PBS.
6. Przygotować roztwór roboczy o wysokiej zawartości CFSE o wysokiej zawartości 0,4 μM w ciepłym PBS.
7. Przygotuj roztwór roboczy o niskiej zawartości CFSE o stężeniu 0,04 μM, rozcieńczając porcję 10-krotnego roztworu roboczego o wysokiej zawartości CFSE w ciepłym PBS.
8. Ponownie zawiesić komórki w 20 x 10⁶/ml PBS (jeśli liczba komórek T CD4 + jest mniejsza niż 10 x 10⁶ / ml zawiesić komórki w 0,5 ml PBS) i wybarwić połowę komórek T CD4 +, dodając jedną równą objętość 0,4 μM roztworu roboczego o wysokiej zawartości CFSE (stężenie końcowe 0,2 μM). Na przykład na 1 ml komórek dodać 1 ml roztworu roboczego CFSE. Wybarwić pozostałą połowę CD4+, dodając jedną równą objętość 0,04 μM roztworu roboczego o niskiej zawartości CFSE (stężenie końcowe 0,02 μM). Barwienie komórek przez 15 min w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 .}
9. Po inkubacji osadzać komórki z prędkością 1,500 obr./min przez 5 minut i ponownie zawieś w 1 ml ciepłego pełnego RPMI w celu wygaszenia reakcji znakowania.
10. Pulsować limfocyty T CD4 + o niskim poziomie CFSE, dodając interesujący peptyd o końcowym stężeniu 5 μg / ml w pełnym RPMI i inkubować przez 45 minut w atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
11. Umyj limfocyty T CD4 + o wysokiej i niskiej CFSE w pełnym RPMI. Powtórz w sumie dwa prania. Zawiesić ponownie w stężeniu 2 x 10^{po 5} komórek/ml w pełnej liczbie obrotów na minutę.
12. Wymieszaj dwie populacje docelowe w stosunku 1:1 (CFSE-Wysoki:CFSE-Niski) (patrz Rysunek 1 dolny panel).

3. Kultura

1. Z każdego rozcieńczenia limfocytów T CD8 + wysiewać 100 μl w dwóch egzemplarzach na okrągłodenną 96-dołkową płytkę.
2. Dodać zmieszane docelowe limfocyty T CD4+ (100 μl) do każdego rozcieńczenia komórek efektorowych do końcowej objętości 200 μl.
3. Aby zmierzyć podstawową apoptozę, wysiewaj 3 dołki samymi komórkami docelowymi.
4. Inkubować kokulturę przez 6 godzin w atmosferze 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.

4. Barwienie i akwizycja cytometrii przepływowej

1. Przenieść komórki na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V i wybarwić tetramerami pMHC sprzężonymi z PE przez 15 minut w atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
2. Umyć w 1x PBS-2% FBS i zabarwić komórki za pomocą Far Red LIVE/DEAD fixable dead cell, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 przez 30 min w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
3. Umyj komórki raz 1x PBS-2% FBS i ponownie zawieś w 100 μl z 2% formaldehydu w 1x PBS.
4. Pozyskaj komórki na cytometrze przepływowym.

Wyniki

Schemat przedstawiony na Rysunku 1 podsumowuje przebieg testu. Oczyszczone limfocyty T CD8+ (komórki efektorowe) resuspendowano w 450 µl kompletnego medium RPMI, a następnie wykonano rozcieńczenia seryjne, dodając 225 µl limfocytów T CD8+ do kolejnej probówki zawierającej 225 µl medium (panel górny). Oczyszczone limfocyty T CD4+ (komórki docelowe) policzono, podzielono do dwóch probówek i barwiono dwiema różnymi stężeniami CFSE (wysokim i niskim) zgodnie z opisem w protokole. Limfocyty T CD4+ CFSE-low in...

Dyskusja

Opisany tutaj test pozwala na ilościowe określenie głównej funkcji limfocytów T CD8 +: aktywności cytolitycznej. Dokładny pomiar tej funkcji ma ogromne znaczenie przy charakteryzowaniu funkcji efektorowych limfocytów T CD8 +, ponieważ poprzednie badania wykazały niezgodność między tą funkcją a wydzielaniem cytokin przez limfocyty T CD8 + specyficzne dla antygenu^10,11. Ze względu na krótki czas inkubacji kokultury (6 godzin) i zastosowanie autologicznych komórek docelowych, wskaźnik niespecyficznego zabijania k...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów T CD4+ EasySep	Komórka macierzysta	19052
Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów T EasySep CD8	macierzysta	19053
Zestaw do proliferacji komórek CellTrace CFSE - do cytometrii przepływowej	Invitrogen	C34554
Far Red LIVE/DEAD do naprawy martwa komórka	Invitrogen	L10120
Alexa Fluor 700 Mysz anty-ludzka CD3	BD
Brilliant Violet 650 Przeciwciało anty-ludzkie CD4	Biolegend	317435
Przeciwciało anty-ludzkie CD8 PerCP	Biolegend	344707
RPMI 1640 Medium 1x	VWR	10-040-CV
Penicylina-Streptomycyna 100x Roztwór	Invitrogen	15070063
Płodowa surowica bydlęca - złota, inaktywowana termicznie	PAA	A15-252
Płytki 96-dołkowe; Traktowane; U-dół; z pokrywką	BD Falcon	353077
25 ml sterylnego polistyrenu, indywidualnie pakowane zbiorniki	USA Scientific	2321-2230
96-dołkowe U-denne, sterylne płytki głębinowe 2 ml	Thermo Scientific 275743
Human IL-2 (v126), klasa badawcza	Miltenyi Biotec	130-093-096
RoboSep Buffer, bufor separacyjny	Komórka	macierzysta20104
15 ml Polipropylenowa rurka stożkowa	BD Falcon	352097
14 ml probówka z okrągłym dnem, polipropylenowa	BD Falcon	352059
komórka trzpieniowa	z magnesem Easy EasySep	18001
PBS 1x	VWR	21-040-CV
96-dołkowa; Płytka V dolna z pokrywką	Fisher	12-565-481
Roztwór formaldehydu, odczynnik ACS, 37 % wag. w H2O	Sigma-Aldrich	252549-500ML
1,5 ml mikroprobówka z nakrętką, stożkowa	Sarstedt	72.692.005

+ Komórka 557943Duża