Obrazowanie uszkodzeń błon komórkowych i procesów subkomórkowych zaangażowanych w naprawę

Podsumowanie

Proces leczenia uszkodzonych komórek polega na transporcie określonych białek i subkomórkowych przedziałów do miejsca uszkodzenia błony komórkowej. W tym protokole opisano testy do monitorowania tych procesów.

Streszczenie

Zdolność uszkodzonych komórek do leczenia jest podstawowym procesem komórkowym, ale mechanizmy komórkowe i molekularne związane z leczeniem uszkodzonych komórek są słabo poznane. Tutaj opisano testy monitorujące zdolność i kinetykę gojenia się hodowanych komórek po miejscowym urazie. Pierwszy protokół opisuje podejście oparte na punkcie końcowym w celu jednoczesnej oceny zdolności do naprawy błon komórkowych setek komórek. Drugi protokół opisuje podejście do obrazowania w czasie rzeczywistym w celu monitorowania kinetyki naprawy błon komórkowych w poszczególnych komórkach po miejscowym uszkodzeniu za pomocą lasera pulsacyjnego. Ponieważ gojenie uszkodzonych komórek wiąże się z transportem określonych białek i przedziałów subkomórkowych do miejsca uszkodzenia, trzeci protokół opisuje zastosowanie podejścia opartego na powyższym punkcie końcowym do oceny jednego takiego zdarzenia transportu (lizosomalnej egzocytozy) w setkach komórek uszkodzonych jednocześnie, a ostatni protokół opisuje zastosowanie impulsowego uszkodzenia laserowego wraz z mikroskopią TIRF do monitorowania dynamiki poszczególnych przedziałów subkomórkowych w uszkodzonych komórkach przy wysokim poziomie przestrzennym i czasowym rezolucja. Chociaż przedstawione tutaj protokoły opisują zastosowanie tych podejść do badania związku między naprawą błony komórkowej a lizosomalną egzocytozą w hodowanych komórkach mięśniowych, można je zastosować jako takie do każdej innej przylegającej hodowli komórkowej i wybranego przedziału subkomórkowego.

Wprowadzenie

Błona komórkowa utrzymuje integralność komórek, zapewniając barierę między komórką a środowiskiem zewnątrzkomórkowym. Bodziec chemiczny, elektryczny lub mechaniczny, który przekracza normalny próg fizjologiczny, a także obecność atakujących patogenów, może spowodować uszkodzenie błony komórkowej i wywołać późniejszą odpowiedź komórkową w celu naprawy tego urazu. Aby przetrwać te uszkodzenia błony komórkowej, komórki posiadają skuteczny mechanizm naprawy. Mechanizm ten jest zależny od wapnia i obejmuje wewnątrzkomórkowy transport białek, takich jak między innymi aneksyny i MG53, a także przedziałów subkomórkowych, takich jak endosomy, lizosomy, pęcherzyki Golgiego i mitochondria do uszkodzonej błony komórkowej^1-7. Jednak szczegóły sekwencji zdarzeń molekularnych i subkomórkowych zaangażowanych w naprawę uszkodzonej błony komórkowej pozostają słabo poznane.

Odpowiedź naprawcza komórki może być podzielona na wczesne i późne odpowiedzi. Wczesne reakcje, które zachodzą w skali od kilku sekund do minut, są niezwykle ważne w określaniu charakteru późnych odpowiedzi prowadzących do udanej naprawy komórki lub śmierci komórki. Testy punktu końcowego oparte na masowej analizie biochemicznej i komórkowej pomogły ustalić udział procesów molekularnych i komórkowych w naprawie. Jednak ze względu na niejednorodność i szybkość odpowiedzi na naprawę komórkową, testy punktu końcowego nie dostarczają szczegółów kinetycznych i przestrzennych sekwencji zdarzeń prowadzących do naprawy. Podejścia, które umożliwiają kontrolowane uszkodzenie błony komórkowej i umożliwiają monitorowanie naprawy błony komórkowej i związanych z nią odpowiedzi subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej, idealnie nadają się do takich badań. Tutaj takie podejścia zostały zaprezentowane. Dwa z tych protokołów opisują podejścia do monitorowania kinetyki naprawy błony komórkowej w czasie rzeczywistym oraz odpowiedzi subkomórkowych związanych z procesem naprawy w żywych komórkach po uszkodzeniu laserowym. Jako uzupełnienie tych testów opartych na obrazowaniu żywych komórek, opisano również testy punktu końcowego, które zapewniają populacyjną miarę monitorowania naprawy pojedynczych komórek i związanych z nią odpowiedzi subkomórkowych. Aby zademonstrować ich użyteczność, podejścia te wykorzystano do monitorowania transportu i egzocytozy lizosomów w odpowiedzi na uszkodzenie błony komórkowej.

Protokół

1. Obrazowanie naprawy błony komórkowej za pomocą masowego ranienia (szklane kulki)

Ten protokół pozwala na oddzielne oznaczanie uszkodzonych komórek i tych, które się nie goją. Kwantyfikacja tych populacji komórek wymaga zastosowania trzech warunków: 1. Test (C1) - Komórki mogą się naprawiać w obecności Ca²⁺, 2. Kontrola 1 (brak uszkodzenia C2) - Komórki są inkubowane w obecności Ca²⁺, ale nie są uszkodzone, i 3. Kontrola 2 (brak naprawy C3) - komórki mogą się naprawiać przy braku Ca²⁺.

1. Hoduj komórki do >50% konfluencji na trzech sterylnych szkiełkach nakrywkowych i umyj C1 i C2 dwukrotnie CIM w temperaturze 37 °C i C3 PBS w temperaturze 37 °C, a następnie przenieś szkiełka nakrywkowe na silikonowe O-ringi.
2. Dodać 100 μl wstępnie podgrzanego roztworu dekstranu FITC w CIM na C1 i C2 lub w PBS na C3.
3. Uszkodzić błonę plazmatyczną na C1 i C3, delikatnie tocząc szklane kulki 40 mg po szkiełku nakrywkowym w temperaturze pokojowej, ręcznie przechylając szkiełka nakrywkowe do przodu i do tyłu 6-8 razy pod kątem 30°.
   Uwaga: W przypadku lekkich obrażeń upewnij się, że szklane koraliki są równomiernie rozłożone, minimalizując w ten sposób powtarzające się obrażenia. Aby poprawić odtwarzalność uszkodzeń między próbkami, należy jednocześnie przeprowadzić zranienie kulką szklaną różnych próbek, które mają być porównane.
4. Unikając dalszego zwijania się ściegów, przenieść wszystkie szkiełka nakrywkowe do inkubatora o temperaturze 37 °C przy temperaturze otoczenia_{CO 2} i odczekać, aż naprawa będzie kontynuowana przez 5 minut.
5. Nie dopuszczając do toczenia się kulek, usuń szklane kulki i dekstran FITC, przemywając CIM (C1 i C2) lub PBS (C3) w temperaturze 37 °C.
6. Umieścić szkiełka nakrywkowe z powrotem na pierścieniu uszczelniającym o przekroju okrągłym i dodać 100 μl wstępnie podgrzanego, utrwalanego lizyną, roztworu dekstranu TRITC w CIM na C1 i C2 lub w PBS na C3.
7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w temperaturze otoczenia_{CO 2} .
8. Szkiełka nakrywkowe umyć dwukrotnie wstępnie podgrzanym CIM i utrwalić 4% PFA przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
9. Przemyć dwukrotnie PBS i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w barwniku Hoechst.
10. Próbki należy dwukrotnie przemyć PBS, zamontować na szkiełku za pomocą pożywki montażowej i komórkach obrazowych za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.
11. Użyj komórek z C2, aby określić intensywność czerwonego i zielonego zabarwienia tła i użyj tej wartości, aby określić próg kanałów czerwonego i zielonego dla wszystkich próbek (C1-C3).
12. Oceń całkowitą liczbę komórek, które są a) zielone (uszkodzone i naprawione) oraz b) czerwone lub zarówno czerwone, jak i zielone (uszkodzone, ale nie udało się naprawić) w próbkach C1 i C3.
13. Policz >100 zielonych komórek dla każdego stanu i wyraź frakcję komórek, które nie uległy naprawie, jako procent wszystkich uszkodzonych komórek (zielony i czerwony).

2. Obrazowanie na żywo kinetyki naprawy błony komórkowej po uszkodzeniu laserowym

1. Umyj komórki wstępnie podgrzanym CIM, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe w CIM z barwnikiem FM.
2. Umieścić szkiełko nakrywkowe w uchwycie w inkubatorze ze stopniem utrzymywanym w temperaturze 37 °C.
3. Wybierz obszar błony komórkowej o wielkości 1-2^mm2 i naświetlaj przez <10 ms laserem impulsowym. Osłabij moc lasera za pomocą oprogramowania do 40-50% mocy szczytowej. Optymalna moc pozwala na konsekwentne, ale nieśmiertelne obrażenia, które muszą być określane metodą prób i błędów dla każdego używanego instrumentu i linii komórkowej.
4. Aby monitorować naprawę, obrazuj co 10 sekund w epifluorescencji i jasnym polu, zaczynając przed urazem i kontynuuj przez 3-5 minut po urazie.
   Uwaga: W przypadku braku kontroli naprawy powtórz kroki 2.1-2.4 z komórkami uszkodzonymi w PBS zawierającym barwnik FM.
5. Aby określić ilościowo kinetykę naprawy, zmierz komórkową fluorescencję barwnika FM i wykreśl zmianę intensywności (ΔF/F0) w trakcie obrazowania. Dane te należy uśrednić dla ponad 10 komórek w każdym warunku i wykreślić jako wartość uśrednioną lub wartość pojedynczej komórki, w zależności od potrzeb.

3. Obrazowanie masowe (szklane kulki) Uraz wywołany lizosomalną egzocytozą

Próbki zawierają następujące komórki wyhodowane do>50% konfluencji: 1. Test (C1) - Komórki dopuszczone do naprawy w obecności Ca>²⁺, 2. Kontrolka 1 (C2; Brak uszkodzeń) - Komórki nie uszkodzone ani nie inkubowane z przeciwciałem pierwszorzędowym, oraz 3. Kontrolka 2 (C3; Brak naprawy) - Komórki mogą się naprawiać przy braku Ca²⁺.

1. Szkiełka nakrywkowe C1 i C2 umyć dwukrotnie CIM w temperaturze 37 °C, a C3 PBS w temperaturze 37 °C i przenieść na silikonowe O-ringi.
2. Dodać 100 μl wstępnie podgrzanego, utrwalanego lizyny dekstranu TRITC w CIM na C1 i C2 oraz w PBS na C3.
3. Uszkodzić błonę plazmatyczną na C1 i C3, jak w kroku 1.3.
4. Unikając dalszego zwijania się ściegów, przenieść wszystkie szkiełka nakrywkowe do inkubatora o temperaturze 37 °C przy temperaturze otoczenia_{CO 2} i odczekać, aż naprawa będzie kontynuowana przez 5 minut.
5. Usuń szklane kulki i dekstran TRITC, myjąc szkiełka nakrywkowe w zimnym podłożu wzrostowym, ponownie upewniając się, że szklane kulki nie toczą się na komórkach.
6. Szkiełka nakrywkowe należy dwukrotnie przepłukać zimnym podłożem i przenieść na O-ringi.
7. Do C1 i C3 dodać 100 μl szczurzego przeciwciała anty mysiego LAMP1 w zimnej pożywce pełnoporcjowej i dodać zimną, kompletną pożywkę wzrostową do C2.
8. Aby umożliwić wiązanie przeciwciał, inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
9. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie zimnym CIM i utrwal wszystkie szkiełka nakrywkowe 4% PFA przez 10 minut w temperaturze suchej, a następnie spłucz 3x CIM.
10. Inkubować wszystkie szkiełka nakrywkowe w 100 μl roztworu blokującego przez 15 minut w temperaturze pokojowej
11. Inkubować wszystkie szkiełka nakrywkowe w 100 μl przeciwciała przeciw szczurom Alexa Fluor 488 przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
12. Przemyć dwukrotnie PBS i inkubować przez 2 minuty w RT w Hoechst.
13. Umyj komórki dwukrotnie PBS, zamontuj na szkiełku za pomocą podłoża montażowego i zobrazuj za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.
14. Korzystając z obrazów komórek C2, określ niespecyficzne barwienie tła w kanałach czerwonym (dekstran TRITC) i zielonym (przeciwciało Alexa Fluor 488) i użyj tych wartości barwienia tła do progu kanałów czerwonego i zielonego dla wszystkich próbek (C1-C3).
15. Użyj >100 oznaczonych na czerwono komórek C1 i C3, aby zmierzyć intensywność barwienia LAMP1 (na zielono) w uszkodzonych komórkach. Aby eksperyment zakończył się sukcesem, barwienie LAMP1 w komórkach z C3 będzie znacznie niższe niż w komórkach z C1.

4. Obrazowanie na żywo uszkodzenia błony komórkowej wywołane transportem subkomórkowym

1. Fluorescencyjnie znakować interesujący nas przedział poprzez transfekcję odpowiedniego reportera (np. CD63-GFP dla lizosomów⁸) lub przy użyciu barwników fluorescencyjnych⁹.
2. W celu znakowania lizosomów barwnikiem fluorescencyjnym należy inkubować komórki wyhodowane do 50% konfluencji w pożywkach wzrostowych zawierających FITC-dekstran
3. Pozostawić dekstran do endocytozy przez 2 godziny (lub dłużej, w zależności od potrzeb, w celu wystarczającego znakowania endosomalnego dekstranem przez linię komórkową będącą przedmiotem zainteresowania) w inkubatorze CO₂ .
4. Umyj komórki wstępnie podgrzaną pożywką wzrostową i inkubuj w niej przez 2 godziny w inkubatorze CO_{2 ,} aby umożliwić zgromadzenie całego endocytozowanego dekstranu w lizosomie.
5. Przed obrazowaniem przepłukać szkiełko nakrywkowe we wstępnie ogrzanym CIM i zamontować w uchwycie szkiełka nakrywkowego na inkubatorze stage w temperaturze 37 °C.
6. Wykonaj obrazowanie szerokopolowe (do ruchu w całej komórce) lub TIRF (ruch na powierzchni komórki i egzocytoza) - komórki, które nie mają stłoczonych lizosomów znakowanych dekstranem FITC, są idealne do obrazowania ruchu i egzocytozy poszczególnych lizosomów.
7. Ustawianie laserów TIRF do mikroskopu obrazowego: Użyj obiektywu 60X lub 100X z >1.45 NA. Ustaw kąt padania wiązki laserowej TIRF, korzystając z podejścia producenta.
8. Uszkodzić błonę komórkową, naświetlając mały obszar (1-2^mm2) przez <100 ms, laserem impulsowym o tłumieniu 40-50%.
9. Aby monitorować odpowiedź lizosomu na uszkodzenie komórek, obrazuj komórki z prędkością 4-6 klatek na sekundę przez co najmniej 2 minuty lub dłużej, w zależności od dynamiki egzocytozy w interesujących komórkach.

Wyniki

Opisane tutaj protokoły dla obrazowania pojedynczych komórek służą do monitorowania zdolności i kinetyki naprawy błony komórkowej (Protokoły 1 i 2) oraz subkomórkowego transportu i fuzji lizosomów podczas naprawy (Protokoły 3 i 4).

Protokół 1 pokazuje masowy test, który pozwala oznaczyć wszystkie uszkodzone komórki i zidentyfikować te uszkodzone komórki, które nie uległy naprawie. Wyniki przedstawione na rysunku 1 pokazują, że podczas gdy nieuszkodzone komórki (rysunek...

Dyskusja

Uszkodzenie błony komórkowej in vivo występuje z powodu różnych fizjologicznych czynników stresogennych i opracowano kilka podejść eksperymentalnych w celu ich naśladowania. Obejmują one uszkodzenie błony komórkowej przylegających komórek poprzez zeskrobanie ich z naczynia lub przejście przez strzykawkę o wąskim otworze^9,10. Po takich urazach komórki goją się w zawiesinie i nie przylegają do macierzy zewnątrzkomórkowej, jak to zwykle ma miejsce w tkance. Jeszcze inne, takie jak stosowanie toksyn tworz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HBSS	Sigma	H1387	Służy do przygotowania CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)
HEPES	Fisher	BP410	Służy do przygotowania CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)
Dekstran FITC (utrwalany lizyną)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml w CIM lub PBS
Koraliki szklane	Sigma	G8772
TRITC dekstran (utrwalany lizyną)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml w CIM lub PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% w PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 w PBS
FM barwnik	Invitrogen	T3163	1 µ g/&mikro; l w CIM lub PBS
FITC dekstran	Sigma	FD40S	2 mg/ml w pożywce wzrostowej
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 w pożywce wzrostowej
Alexa Fluor 488 kurczak anty-szczurzy IgG	Invitrogen	A21470	1/500 w roztworze blokującym
Nośnik montażowy	Dako	S3023
Szkiełka nakrywkowe	Fisher	12-545-86
Szklane dno petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silikonowy O-ring	Bellco	1943-33315
Uchwyt na szkiełko nakrywkowe	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Używany do podłoża wzrostowego: 10% FBS, 1% P/S w DMEM
Penicylina/Sreptomycyna	VWR	12001-350	Używany do podłoża wzrostowego: 10% FBS, 1% P/S w DMEM
Surowica kurczaka	Sigma	C5405	5% surowica kurczaka w CIM służy do blokowania roztworu podczas barwienia immunologicznego
PBS (wolne od Ca2+ i Mg2+)	VWR	12001-664
Mikroskop epifluorescencyjny	Olympus America, oświetlacz PA	IX81
TIRF	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Oświetlacz epifluorescencyjny	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Laser impulsowy	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Inkubator górny	Tokaihit, Japonia	INUBG2ASFP-ZILCS