Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Podsumowanie

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Streszczenie

Kardiomiocyty, komórka robocza serca, zawierają doskonale zorganizowane elementy cytoszkieletu i kurczliwości, które generują siłę skurczu używaną do pompowania krwi. Poszczególne kardiomiocyty zostały po raz pierwszy wyizolowane ponad 40 lat temu, aby lepiej zbadać fizjologię i strukturę mięśnia sercowego. Techniki szybko się poprawiły, obejmując trawienie enzymatyczne za pomocą perfuzji wieńcowej. Niedawno analiza kurczliwości i przepływu wapnia izolowanych miocytów dostarczyła istotnego narzędzia w komórkowej i subkomórkowej analizie niewydolności serca. Echokardiografia i EKG dostarczają informacji o sercu tylko na poziomie narządów. Istnieją systemy hodowli komórek kardiomiocytów, ale komórkom brakuje fizjologicznie niezbędnych struktur, takich jak zorganizowane sarkomery i kanaliki T wymagane do funkcjonowania miocytów w sercu. W przedstawionym tutaj protokole kardiomiocyty są izolowane za pomocą perfuzji Langendorffa. Serce jest usuwane z myszy, montowane przez aortę do kaniuli, perfundowane enzymami trawiennymi, a komórki są wprowadzane do zwiększonego stężenia wapnia. Oprogramowanie do wykrywania krawędzi i sarkomeru służy do analizy kurczliwości, a barwnik fluorescencyjny wiążący wapń służy do wizualizacji stanów przejściowych wapnia w kardiomiocytach o stymulacji elektrycznej; Coraz lepsze zrozumienie roli, jaką zmiany komórkowe odgrywają w dysfunkcji serca. Tradycyjnie używany do testowania wpływu leków na kardiomiocyty, używamy tego systemu do porównywania miocytów myszy WT i myszy z mutacją powodującą kardiomiopatię rozstrzeniową. Protokół ten jest wyjątkowy ze względu na porównanie żywych komórek myszy ze znaną funkcją serca i znaną genetyką. Wiele warunków eksperymentalnych jest wiarygodnie porównywanych, w tym manipulacje genetyczne lub środowiskowe, infekcje, leczenie farmakologiczne i inne. Poza danymi fizjologicznymi, izolowane kardiomiocyty można łatwo utrwalić i wybarwić pod kątem elementów cytoszkieletu. Izolowanie kardiomiocytów za pomocą perfuzji jest niezwykle wszechstronną metodą, przydatną w badaniu zmian komórkowych, które towarzyszą lub prowadzą do niewydolności serca w różnych warunkach eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Kardiomiocyty zapewniają siłę skurczu serca. Każdy miocyt zawiera zorganizowane elementy cytoszkieletu i kurczliwe niezbędne do skurczu. Serce zawiera nie tylko kardiomiocyty, ale także fibroblasty, tkankę łączną i zmodyfikowane miocyty, takie jak włókna Purkinjego. Zmiany w którymkolwiek lub wszystkich tych typach komórek można zaobserwować w niewydolności serca, co utrudnia określenie ostatecznej przyczyny dysfunkcji serca. Zmniejszona kurczliwość komór niewydolnego serca jest poprzedzona różnym stopniem nagromadzenia tkanki włóknistej oraz przerostem i dysfunkcją kardiomiocytów¹. Zaburzenia rytmu serca mogą być spowodowane dysfunkcją komórek przewodzących², zwłóknieniem przerywającym przewodnictwo serca³ lub zmianami w ekspresji kanałów jonowych w kardiomiocytach^1,4. Rzeczywiście, problemy te często współistnieją w skomplikowany sposób.

Izolowanie i badanie kardiomiocytów pozwala na zbadanie dysfunkcji kurczliwości i elektryczności poszczególnych miocytów w kontekście ogólnej funkcji serca. Techniki izolacji pojedynczych miocytów serca zostały opracowane ponad 40 lat temu w celu lepszego zbadania fizjologii tej komórki serca "konia roboczego". Techniki izolacji zostały ulepszone w celu zwiększenia wydajności i jakości komórek, wraz z niezbędnym rozwojem perfuzji wieńcowej poprzez kaniulację aorty, po raz pierwszy wykonaną w 1970^roku5. W artykule opisano izolację kardiomiocytów, a następnie pomiar kurczliwości i stanów przejściowych wapnia przy użyciu oprogramowania do akwizycji danych fluorescencji ratiometrycznej i wymiarowania komórek. Zarówno w genetycznych, jak i środowiskowych modelach chorób serca, wykorzystanie tego protokołu dostarcza kluczowych informacji na temat kurczliwości komórek, kurczliwości i relaksacji sarkomerycznej, stanów przejściowych wapnia i zaburzeń cytoszkieletu. System ten jest często używany do badania wpływu leków na izolowane kardiomiocyty^6,7. Wykorzystujemy system do porównywania kurczliwości i stanów przejściowych wapnia kardiomiocytów między myszami typu dzikiego a myszami z mutacją prowadzącą do kardiomiopatii rozstrzeniowej.

Badanie pojedynczych miocytów serca ma wiele zalet w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi metodami badania anatomii i fizjologii serca. Echokardiografia i elektrokardiografia dostarczają informacji na temat funkcji skurczowej i przewodnictwa elektrycznego całego serca. Żadna z tych metod nie wyjaśnia przyczyny ani charakteru dysfunkcji poniżej poziomu całego narządu. Pomiar kurczliwości poszczególnych kardiomiocytów za pomocą algorytmów wykrywania krawędzi i długości sarkomeru może wykazać, że zmiany w komórce kurczliwej serca są obecne w globalnej dysfunkcji serca. Pomiar stanów przejściowych wapnia pokazuje wpływ zmian strumienia jonów na poziomie komórkowym na dysfunkcję skurczu lub arytmie.

Oprócz uzupełniania badań nad całymi narządami, ten protokół zapewnia łatwe barwienie komórek na składniki subkomórkowe. Możliwe jest zaobserwowanie zmian cytoszkieletu poprzez barwienie odcinków tkanek całego serca; Jednak można wizualizować tylko przekrój komórek. Cały kardiomiocyt jest grubszy niż typowy wycinek tkanki, a biorąc pod uwagę układ i długość kardiomiocytów, trudno jest zobaczyć całe komórki w jednej sekcji. Izolowane kardiomiocyty można natychmiast utrwalić i wybarwić pod kątem różnych elementów cytoszkieletu i kanałów jonowych. Obrazy konfokalne można kompilować do stosów z o pełnej grubości komórki. Dodatkowo barwienie izolowanych miocytów serca pozwala na barwienie elementów, które są niemożliwe do uwidocznienia w sekcjach, takich jak wgłębienia błony znane jako kanaliki teowe.

Istnieją hodowlane linie komórkowe miocytów serca, z których niektóre mają podobne profile transkrypcyjne i cechy fenotypowe do miocytów serca. Niektóre, takie jak linia komórkowa HL-1, zachowują nawet pewną organizację sarkomeryczną i szczątkową zdolność skurczową⁸. Pomimo tych cech, hodowane komórki nie mają kształtu "wagonu pudełkowego" i struktury kanalików T kardiomiocytów i mają mniej sarkomeryczną organizację. Składniki te są niezbędne do funkcjonowania kardiomiocytów in vivo. Ponadto wykorzystanie hodowanych komórek pozwala na manipulację genetyczną, ale nie na manipulację fizjologiczną in vivo. Izolowane kardiomiocyty zachowują swoją organizację komórkową wystarczająco długo, aby można je było badać^{, ale} nadal można je łatwo obrazować, a nawet transdukować.

Izolowane kardiomiocyty są niezwykle wszechstronne, dostarczając substratu do identycznej analizy komórek z różnych warunków eksperymentalnych. Izolacja i analiza fizjologiczna miocytów były wykorzystywane przez niezliczone laboratoria do różnych eksperymentów, w tym do badania wpływu leków^6,7 lub małych cząsteczek¹⁰, stresorów środowiskowych¹¹, infekcji¹², choroby¹³ lub mutacji genetycznej^14,15 na kurczliwość i / lub przejściowe stany wapnia oraz badanie regulacji kurczliwości i uwalniania wapnia w kardiomiocytach^15-17. Przy zastosowaniu któregokolwiek z tych stresorów zmiany w funkcjonowaniu serca mogą być spowodowane dowolną kombinacją zmian w samych kardiomiocytach i zmian w otaczającym środowisku serca, takich jak blizny, zmiany przewodnictwa lub zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej. Jest to idealny protokół do odpowiedzi na pytania badawcze dotyczące indywidualnej struktury i funkcji miocytów w kontekście niewydolności serca z jakiejkolwiek przyczyny.

Chociaż ma niezliczone zalety w porównaniu z innymi technikami, analiza fizjologiczna izolowanych kardiomiocytów nie jest idealna dla każdego pytania badawczego. Izolacja jest procedurą terminalną, dlatego kardiomiocyty można ocenić tylko w jednym momencie życia myszy. Można to częściowo przezwyciężyć za pomocą kohort i poświęcania pojedynczych myszy w trakcie rozwoju choroby lub poprzez monitorowanie myszy w celu ustalenia, czy ma klinicznie istotną niewydolność serca przed izolacją. Chociaż protokół ten może określić, czy wystąpiła dysfunkcja kardiomiocytów, nie można wyciągnąć wniosku, że ta dysfunkcja jest główną przyczyną niewydolności serca bez dodatkowych informacji eksperymentalnych. Możliwe, że sama dysfunkcja kardiomiocytów jest wtórna do innych zmian w sercu. Pomimo tych wyzwań, badanie kardiomiocytów dostarcza cennych informacji w określaniu charakteru dysfunkcji serca, zwłaszcza w połączeniu z innymi eksperymentami.

Poniższy protokół jest zaadaptowany z dostarczonego przez Dr. Chee Lim, Vanderbilt University. Chociaż dane dotyczące kurczliwości i strumienia wapnia są wysoce powtarzalne i przydatne w porównywaniu serc z manipulacjami genetycznymi lub środowiskowymi, sama izolacja pozostaje protokołem zależnym od techniki, wymagającym optymalizacji. Zminimalizowanie czasu między usunięciem serca od myszy a perfuzją serca przez kaniulację aorty jest niezbędne dla wysokiej jakości trawienia. Ponadto czas trawienia i stężenie enzymów można zoptymalizować w celu uzyskania miocytów najwyższej jakości. Kroki, które mogą wymagać optymalizacji, wraz z sugestiami dotyczącymi optymalizacji, są wymienione poniżej.

Protokół

Upewnij się, że wszystkie procedury dotyczące zwierząt są zatwierdzone przez odpowiedni organ ds. użytkowania i opieki nad zwierzętami.

1. Przygotuj zapasów z wyprzedzeniem

1. Przygotuj 2 litry zapasu Ca²⁺ wolne Tyrode (Tabela 1). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH.
2. Przygotuj 2 litry zapasów 1,2 mM Ca²⁺ Tyrode (Tabela 2). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH.

2. W dniu eksperymentu przygotuj perfuzji, transferu i trawienia

1. Przygotować 150 ml buforu perfuzyjnego w Tyrode'ie wolnym od Ca²⁺ (Tabela 3) i przefiltrować przez filtr 0,2 μm.
2. Przygotować 35 ml "buforu A" do swobodnego transferu^Ca2+ (Tabela 4) i 25 ml Ca²⁺ zawierającego "bufor B" (Tabela 5). Przefiltruj każdy z nich przez filtr 0,2 μm.
3. Przygotować roztwory 0,06, 0,24, 0,6 i 1,2 mM Ca²⁺, mieszając bufor A i B zgodnie z tabelą 6.
4. Przygotować 25 ml buforu wytrawiającego, rozpuszczając enzymy wytrawiające w 25 ml buforze perfuzyjnym (Tabela 7) w oparciu o masę ciała (m.c.) myszy. Przed użyciem przefiltrować przez filtr 0,2 μm.

3. Konfiguracja eksperymentalna

1. Zmontuj aparat Langendorffa o stałym przepływie, dostępny na rynku lub przy użyciu pompy perystaltycznej, rurki i cewki wymiennika ciepła, aby umożliwić natężenie przepływu 3 ml/min perfuzatu podgrzanego do 37 °C. Prosty schemat znajduje się w przeglądzie z 2011 r. autorstwa Bella i wsp. ¹⁸.
2. Ustawić temperaturę kąpieli wodnej obiegowej (~47 °C) aparatu Langendorffa tak, aby odpływ z kaniuli wynosił 37 °C przy natężeniu przepływu 3 ml/min.
3. Przepuść 70% etanolu przez system perfuzyjny przez 15 minut, a następnie dodaj 100 ml ultraczystej wody typu I. Przepuść bufor perfuzyjny przez system przez 5 minut, eliminując pęcherzyki powietrza.
4. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne pożądaną metodą.
5. Utwórz kaniulę, przymocowując krótki kawałek (około 3 mm) rurki PE-50 do końcówki adaptera Luer-stub 23 G. Podgrzej końcówkę rurki, aby utworzyć wargę, nad którą zostanie umieszczona aorta.

4. Izolacja kardiomiocytów

1. Wstrzyknąć myszowi 0,2 ml roztworu heparyny (1 000 j.m./ml) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
2. Po 5 minutach znieczulij mysz izofluoranem. Po całkowitym znieczuleniu (brak reakcji na silne uszczypnięcie stopy), spryskaj klatkę piersiową 70% EtOH. Otwórz klatkę piersiową, szybko wyciąć serce, uważając, aby nie uszkodzić aorty, i umieść w buforze perfuzyjnym o temperaturze 4 °C. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby chwycić i podnieść pod sercem. Stwarza to miejsce do przycinania nasadek za sercem za pomocą cienkich nożyczek.
3. Wykonaj kankaniulację serca, delikatnie chwytając krawędź aorty dwiema parami cienkich kleszczy i ostrożnie przeciągając otwór aorty nad wargą kaniuli. Upewnij się, że końcówka kaniuli nie przechodzi przez zastawkę aortalną i nie wchodzi do komory, ponieważ zahamuje to perfuzję serca przez tętnice wieńcowe.
4. Przymocuj aortę do kaniuli, zawiązując pętlę jedwabnego szwu 5-0 wokół aorty bezpośrednio nad krawędzią kaniuli.
5. Uwaga: Kroki od 4.2 do 4.4 należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby uzyskać najlepszą jakość trawienia.
6. Uwaga: Serce można zawiesić bezpośrednio na kaniuli już podłączonej do aparatu Langendorffa z przepływającym buforem perfuzyjnym. Jednak zawieszenie serca na kaniuli przymocowanej do małej strzykawki z buforem perfuzyjnym pod mikroskopem preparacyjnym okazało się najbardziej skuteczne. Pozwala to na przepchnięcie niewielkiej ilości buforu perfuzyjnego, obserwując oczyszczenie tętnic wieńcowych i upewniając się, że serce jest bezpiecznie przymocowane do kaniuli. Kaniula jest następnie zawieszana na Langendorffie z uruchomionym buforem perfuzyjnym.
7. Perfuzja serca za pomocą wolnego buforu perfuzyjnego Ca²⁺ o przepływie 3 ml/min przez 2-3 min.
8. Przełącz się na bufor trawienia enzymatycznego i perfuzję na 7-10 minut, serce stanie się bardziej miękkie i jaśniejsze.
9. Uwaga: Czas trawienia można dostosować w zależności od aktywności enzymu i wielkości serca.
10. Gdy serce jest wyczuwalnie wiotkie, wyjmij je z kaniuli i umieść w sterylnym naczyniu p60 z buforem A (bufor do swobodnego przenoszenia^Ca2+).
11. Usuń przedsionki i wielkie naczynia. W razie potrzeby usuń prawą komorę. Za pomocą kleszczy podziel komorę na małe kawałki. Kilkakrotnie odpipetować sterylną pipetą transferową o pojemności 5 ml w celu dalszego rozproszenia komórek.
12. Przefiltrować zawiesinę komórek do stożkowej rurki o pojemności 50 ml przez nylonowy filtr siatkowy o średnicy 250 μm.
13. Pozostawić zawiesinę do osadzenia się na około 10 minut.
14. Przenieść osad do roztworu 0,06 mM Ca²⁺. Pozostaw komórki do osadzania się na 10 minut. Zdrowe komórki będą się osadzać, podczas gdy większość martwych komórek będzie unosić się na wodzie.
15. Odessać supernatant i przenieść osad do roztworu 0,24 mM Ca²⁺.
16. Powtórz 10-minutową inkubację, aspirację i przenoszenie przez pozostałe dwa roztwory Ca²⁺, aż komórki znajdą się w roztworze 1,2 mM. W tym momencie większość komórek powinna być miocytami w kształcie pręcików.

5. Pomiar kurczliwości i stanów przejściowych wapnia

1. Uwaga: Zarówno kurczliwość, jak i stany przejściowe wapnia mogą być mierzone jednocześnie.
2. Przygotować roztwór Fura-2 AM przez ponowne zawieszenie w bezwodnym DMSO do stężenia 1 μg/μl. Roztwór Fura-2 AM można przechowywać w eksykatorze w temperaturze -20 °C.
3. Załadować 1 ml zawieszonych komórek 1 μl Fura-2 AM. Pozostaw komórki w ciemności przez 10 minut, a następnie odessaj supernatant. Umyj dwukrotnie roztworem Ca²⁺ Tyrode, pozwalając komórkom osadzać się w ciemności przez 10 minut między praniami.
4. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe we wkładce scenicznej, która umożliwia podgrzewaną perfuzję/aspirację i stymulację elektrod za pomocą stymulatora pola miocytów. Umieść wkładkę stolika na odwróconym mikroskopie ustawionym do pomiaru fluorescencji, dodając kroplę oleju do soczewki, jeśli używasz obiektywu zanurzeniowego z olejkiem.
5. Ustawić podgrzaną perfuzję grawitacyjną za pomocą 1,2 mM Ca²⁺ roztworu Tyrode, aby roztwór na scenie osiągnął temperaturę 37 °C. Podłącz aspirację do próżni. Zamocuj elektrody.
6. Włącz system mikroskopu i otwórz oprogramowanie do akwizycji danych fluorescencji ratiometrycznej i wymiarowania komórek.
7. Dodaj kilka kropli komórek naładowanych Fura-2 AM do wkładki etapowej, blokując na chwilę perfuzję, aby umożliwić zdrowym komórkom osiedlenie się.
8. Użyj obiektywu 40X, aby zlokalizować żądaną komórkę. Zdrowa komórka powinna mieć kształt pręcika i nie powinna się spontanicznie kurczyć. Powinien widocznie i równomiernie się kurczyć, gdy ogniwo jest zasilane napięciem 5-20 V.
9. Uwaga: Analiza fizjologiczna wymaga wysokiej jakości trawienia. Możliwe jest posiadanie komórek, które wyglądają zdrowo, ale nie nadają się dobrze do analizy fizjologicznej. Protokół trawienia może wymagać udoskonalenia, aby uzyskać wysokiej jakości, zdrowe miocyty. Dodatkowo, zmutowane lub chore serca mogą wymagać modyfikacji protokołu.
10. Dostosuj obrót obiektywu i zmień przysłonę, aby żądana komórka była wyrównana poziomo na ekranie, a tło nie było widoczne.
11. Dopasuj paski wykrywania krawędzi do każdego końca miocytów i dostosuj próg. Dopasuj wykrywanie sarkomerów do części komórki z jednolitymi sarkomerami. Im dłuższy jest ten pasek, tym dokładniejszy będzie matematyczny model długości sarkomerów, o ile nie znajduje się on na dwóch populacjach sarkomerów.
12. Tempo komórek przy 2 Hz i 5-20 V przez 10-15 sekund przed nagrywaniem.
13. Śledzenie rekordów. Światło otoczenia powinno być zminimalizowane, aby uzyskać najlepsze nagrywanie stanów przejściowych wapnia.

6. Analiza

1. Analizuj ślady za pomocą oprogramowania do akwizycji danych fluorescencji ratiometrycznej i wymiarowania komórek.

7. Dalsze studia

1. Protokół ten zapewnia nadmiar komórek, które można wykorzystać do wielu innych eksperymentów, w tym: utrwalania i barwienia immunologicznego, oceny bezpośrednich skutków leku, krótkoterminowej hodowli i mikroskopii sił atomowych.

Wyniki

Po zebraniu zapisów kurczliwości i przejściowych zmian stężeń wapnia (Rycina 2), dane można łatwo przeanalizować za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Cały zapis lub jego części mogą zostać uśrednione (Rycina 3). Kurczliwość można analizować na różne sposoby. W przypadku funkcji skurczowej można ocenić wielkość skurczu za pomocą skrócenia frakcyjnego lub szybkość skurczu poprzez czas do maksymalnego skrócenia oraz prędkość skurczu. Funkcję rozkurczową można analizować w podobny sposób,...

Dyskusja

Izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów wymaga pewnego poziomu praktyki i optymalizacji. Protokół ten zawiera kluczowe kroki, które mogą znacznie wpłynąć na wynik trawienia. Należy je dokładnie rozważyć podczas wykonywania i rozwiązywania problemów z protokołem. Czas od usunięcia serca do kaniulacji i perfuzji powinien być zminimalizowany, najlepiej krótszy niż pięć minut. Płukanie serca natychmiast w lodowatym buforze perfuzyjnym po wyjęciu od myszy oraz wypreparowanie i kaniulowanie serca w lodowatym buforze również z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl	RPI	S23020
KCl	Sigma	P-3911
MgCl2	Sigma	M-8266
HEPES	EM Science	S320
NaH2PO4	Sigma	S5011
CaCl2· 2H2O	Fisher	C79
D-(+)-Glukoza	Sigma	G7528
2,3-butanodion-monoksymowy (BDM)	Sigma	B-0753
Tauryna	Sigma	T-0625
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	A-7030
Kolagenaza B	Roche Diagnostyka	1-088-823
Kolagenaza D	Roche Diagnostics	1-088-882
Proteaza XIV	Sigma	P-5147
Heparyna	APP Pharmaceuticals, LLC	401586D
Izofluoran	Butler Schein	11695-6776-2
Fura-2 AM	Teflabs	103
DMSO – bezwodna	Sigma	276855
System stymulacji komórek i analizy fluorescencyjnej IonOptix	IonOptix
250 μ m nylonowy filtr siatkowy	Sefar America	Lab Pak 03-250/50
23 G Adapter Luer-stub	Becton Dickinson	1482619E
PE-50 rurka	Becton Dickinson	427410