Pobieranie i analiza wysięków łyka Arabidopsis przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA

Podsumowanie

Znajomość składu soku łyka, jak również mechanizmu jego ładowania i transportu na duże odległości jest niezbędna do zrozumienia długodystansowej sygnalizacji w rozwoju roślin i odpowiedzi na stres/patogen oraz transportu asymilacyjnego. Niniejszy manuskrypt opisuje pobieranie wysięków łyka przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA.

Streszczenie

Łyko roślinne jest niezbędne do transportu na duże odległości asymilatów (foto)jak również sygnałów przenoszących stres biotyczny lub abiotyczny. Zawiera cukry, aminokwasy, białka, RNA, lipidy i inne metabolity. Chociaż istnieje duże zainteresowanie zrozumieniem składu i funkcji łyka, rola wielu z tych cząsteczek, a tym samym ich znaczenie w rozwoju roślin i reakcji na stres, nie została jeszcze określona. Jedną z barier w analizie łyka jest fakt, że łyko uszczelnia się po zranieniu. W rezultacie liczba roślin, z których można uzyskać sok z łyka, jest ograniczona. Jedną z metod, która umożliwia zbieranie wysięków łyka z kilku gatunków roślin bez dodatkowego sprzętu, jest opisane tutaj zbieranie wysięku łyka z wykorzystaniem EDTA. Chociaż jest łatwy w użyciu, prowadzi do zranienia komórek i należy zachować ostrożność, aby usunąć zawartość uszkodzonych komórek. Ponadto konieczne jest przeprowadzenie kilku kontroli w celu udowodnienia czystości wysięku. Ponieważ jest to wysięk, a nie bezpośrednie zebranie soku z łyka (co nie jest możliwe u wielu gatunków), może nastąpić tylko względna kwantyfikacja jego zawartości. Przewagą tej metody nad innymi jest to, że może być stosowana w wielu gatunkach roślin zielnych lub drzewiastych (pachnotka, rzodkiewnik, topola itp.) i wymaga minimalnego sprzętu i treningu. Prowadzi to do powstania dość dużych ilości wysięków, które można wykorzystać do późniejszej analizy białek, cukrów, lipidów, RNA, wirusów i metabolitów. Jest na tyle prosty, że może być używany zarówno w badaniach, jak i w laboratorium dydaktycznym.

Wprowadzenie

Rośliny nie mogą się poruszać, aby uniknąć niekorzystnych warunków. W związku z tym musieli opracować mechanizmy wykrywania stresów środowiskowych, wywoływania i przesyłania odpowiedniego sygnału w całym zakładzie oraz odpowiedniego dostosowania rozwoju. Istnieją dwa systemy transportu do dystrybucji wody, składników odżywczych i innych związków (sygnalizacyjnych). Pierwszym z nich jest ksylem; który zazwyczaj transportuje wodę i minerały pobierane przez korzenie w całej roślinie. Drugi to łyko. Widok łyka zmienił się z prostego systemu transportu asymilacyjnego na kanał dla RNA, białka, wirusów, lipidów i innych małych cząsteczek. Odgrywa ważną rolę w przyswajaniu i transporcie składników odżywczych, odpowiedzi na stres biotyczny i abiotyczny, a także we wzroście i rozwoju roślin. Obecnie nazywa się ją "informacyjną autostradą" elektrowni¹⁸.

Łyko składa się z kilku typów komórek: miąższu łyka, a także wyspecjalizowanych komórek towarzyszących i elementów sita. Element sitowy jest miejscem ruchu na duże odległości. Aby umożliwić niezakłócony przepływ wzdłużny, w elementach sita brakuje większości organelli, a także jąder i uważa się, że zawierają w najlepszym razie ograniczoną maszynerię translacyjną^{21, 33}. Uważa się, że komórki towarzyszące syntetyzują białka i inne związki, które przemieszczają się w strumieniu łyka. Związki te są następnie transportowane do elementu sitowego za pośrednictwem plazmodesmatów i mogą funkcjonować jako sygnały na duże odległości ^4,16.

W wysiękach łyka można znaleźć kilka grup związków:

• Cukry są często produktami fotosyntezy i są transportowane jako cząsteczki "przenoszące energię" do innych części rośliny w celu magazynowania lub jako elementy budulcowe. Mogą jednak również działać jako środek przeciw zamarzaniu lub jako związki sygnalizacyjne.
• Białka można również znaleźć w wysiękach łyka. Obejmują one enzymy metaboliczne, ale pełnią również funkcję sygnalizacyjną. Jednym z przykładów białka, które służy jako sygnał rozwojowy, jest białko locus T kwitnienia, które sygnalizuje indukcję kwitnienia, a także sezonowe odcięcie liści u roślin. ⁶
• Kwasy nukleinowe są obecne w wysiękach łyka w postaci mRNA, małych i mikro RNA oraz wirusowych RNA. Wydaje się, że są one w dużej mierze zaangażowane w sygnalizację ^{27, 28, 39}. W tym samym czasie zaobserwowano rRNA i tRNA dla prawie wszystkich aminokwasów w soku łykowym dyniowatych⁴². Wydaje się, że są one selektywnie przenoszone do systemu rurek sitowych. TRNA wykazują modyfikacje niezbędne do przenoszenia aminokwasów do aparatu translacyjnego. Jednak zamiast uczestniczyć w tłumaczeniu, wydają się hamować ten proces. Alternatywnie mogą służyć jako źródło cytokininy lub sygnalizować stan metaboliczny rośliny⁴².
• Kwasy tłuszczowe, oksylipiny i inne lipidy znaleziono również w wysiękach łyka ^{3, 13, 14, 23}. Kwas jasmonowy, oksylipina, przemieszcza się przez łyko w ramach odpowiedzi na zakażenie patogenem^{22, 29, 31, 32}. Chociaż rola większości lipidów łyka jest nadal niejasna, niektóre z nich prawdopodobnie pełnią funkcję sygnalizacyjną⁴.

Wyzwanie w pracy z łykiem roślinnym polega na jego zdolności do uszczelniania się po zranieniu. Istnieją cztery główne metody stosowane do zbierania wysięków łyka, ale działają one tylko u wybranych gatunków:

1) U dyniowatych możliwe jest uzyskanie rozsądnych ilości wysięku łyka poprzez nacięcia ogonka liściowego. Po usunięciu początkowej kropli z zanieczyszczeniem uszkodzonych komórek możliwe jest uzyskanie rozsądnie dużych ilości czystego soku łyka ^{1, 15}. Jednak wraz z wydłużaniem się czasu zbierania, wysięk ten gęstnieje, co czyni go coraz mniej odpowiednim do metod chromatografii cieczowej (niepublikowanych). Ostatnie publikacje sugerują, że w zależności od gatunku, ten sok łyka pochodzi z łyka pęczkowego (FP) lub pozapęczkowego (EP) i że chociaż zawiera "ruchomy" sok łyka z elementów sita (FP), jest również podatny na zanieczyszczenie innymi typami komórek, w tym ksylemem^{40, 41}.

2) Drugim podejściem jest uzyskanie soku z łyka poprzez płytkie nacięcia lub nakłucia w łodydze lub ogonku liściowym. Metoda ta jest z powodzeniem stosowana w łubinie ^{17, 25}, dyniowatych³⁶ i Brassica napus¹². Tutaj zanieczyszczenie uszkodzonymi komórkami jest minimalne, a wysięk jest bardzo czysty. Jednak rośliny muszą być zdrowe i dobrze nawodnione, ponieważ selektywne nakłuwanie samych elementów sita jest bardzo trudne. Jeśli naczynia ksylemu zostaną nacięte, cały wysięk jest wciągany do strumienia ksylemu. To sprawia, że metoda nie jest odpowiednia dla roślin o bardzo kruchych lub silnie zdrewniałych ogonkach lub łodygach.

3) Stylektomia mszyc pozwala mszycom na wprowadzenie swojego styliku do elementów sita, a następnie usunięcie mszycy za pomocą lasera. Sok z łyka jest wydzielany przez pozostały sztylet^{2, 9, 10, 35, 38}. Teoretycznie do tego podejścia można użyć każdej rośliny, która może zostać zainfekowana przez mszyce. Jednak większość osób zarządzających szklarniami lub komorami wzrostu nie poprze stosowania patogenu. Ponadto mszyce wprowadzają kilka białek do łyka wraz ze śliną ^{19, 33}. Prowadzi to do ograniczonego przeprogramowania transkrypcji ³⁰ i może potencjalnie zmienić skład łyka²⁶.

4) Opisana tutaj metoda to wspomagany przez EDTA wysięk z łyka. Ta metoda wykorzystuje EDTA, aby zapobiec uszczelnieniu łyka²⁰. EDTA chelatuje jony Ca²⁺, które w przeciwnym razie uczestniczyłyby w procesach uszczelniających łyko. Podczas gdy EDTA może prowadzić do uszkodzenia komórek³⁰, kilka grup stosowało tę metodę i nie zaobserwowało niekorzystnego wpływu stężeń EDTA od 10 mM do 20 mM na ultrastrukturę komórki lub na ładowanie i transport łyka^{5, 24}. Aby zmniejszyć szkodliwy wpływ, a także interferencję EDTA z chromatografią i elektroforezą żelową, rośliny przenosi się do wody po 1 godzinie i wykorzystuje się tylko późniejszą część wysięku¹⁴. Tak więc, zamiast wysięku do EDTA, łyko jest wysiękiwane do wody (wysięk ułatwiony przez EDTA). Jest to prosta, tania i niezaawansowana technologicznie metoda zbierania wysięków z łyka. Otrzymany w ten sposób sok łykowy może być stosowany do analizy białek, małych cząsteczek, lipidów i RNA i jest z powodzeniem stosowany w wielu roślinach. Chociaż przeprowadzono ograniczoną liczbę eksperymentów na roślinach jednoliściennych¹¹, metoda wydaje się być bardziej odpowiednia dla roślin dwuliściennych (Perilla^{17, 20}, Arabidopsis^{8, 13, 14}, Topola⁷). Zbieranie wysięków musi odbywać się w wilgotnym środowisku, aby uniknąć utraty wysięku w wyniku transpiracji. W zależności od rośliny, inkubacja w EDTA przez jedną do dwóch godzin jest wystarczająca, aby zapobiec uszczelnieniu elementów łyka/sita. Zbieranie może wtedy nastąpić do wody. Ma to tę zaletę, że zapobiega negatywnemu wpływowi EDTA na strukturę i stabilność komórki. Eliminuje również interferencję EDTA z metodami takimi jak HPLC lub SDS-Page. Jest to pokazane tak, jak w przypadku Arabidopsis. W przypadku większych roślin inkubacja w kolekcjach EDTA i wysięku musi być zwiększona i przeprowadzana w zlewkach, a nie w probówkach reakcyjnych o pojemności 1,7 ml.

Protokół

1. Przygotowanie roślin

1. Nasiona rzodkiewnika mogą kiełkować bezpośrednio na glebie lub na płytkach MS. Uprawiaj rośliny przez cztery do sześciu tygodni w komorach wzrostowych z 12-godzinnym fotoperiodem (22 °C w dzień, 15 °C w nocy¹⁴). Podlewaj rośliny raz do dwóch razy w tygodniu. Użyj dolnej tacy do podlewania; nie podlewaj roślin od góry; Pozostaw tace do wyschnięcia przed ponownym podlaniem. Upewnij się, że rośliny są dobrze nawodnione w czasie zbiorów.

2. Przygotowanie roztworów i potraw

1. Roztwór K_2-EDTA: Przygotować 100 mM roztwór podstawowy roztworu_{K 2-EDTA}, który można przechowywać w lodówce. W dniu pobrania rozcieńczyć roztwór od 1 do 5 (jedna część roztworu EDTA, cztery części wody), aby otrzymać roztwór₂₀ mM K 2-EDTA.
2. Napełnij szklankę lub szalkę Petriego (średnica 7-15 cm) do połowy roztworem₂₀ mM K 2-EDTA. W przypadku pobierania próbek z różnych zabiegów (na przykład roślin kontrolnych i narażonych na zasolenie lub różnych genotypów), przygotuj osobne potrawy dla każdego zabiegu.
3. Napełnij żądaną liczbę probówek reakcyjnych o pojemności 1,7 ml 1,4 ml roztworu 20 mM K_2-EDTA. Napełnij równą liczbę probówek reakcyjnych 1,4 ml autoklawowanej wody dejonizowanej lub miliporowej.
4. Połóż ręczniki papierowe na ławce, aby posadzić na niej rośliny; weź jedną nową żyletkę i załóż rękawiczki.

3. Zbiór wysięków łyka (przedstawiony na schemacie blokowym na rysunku 1)

1. Zbierz liście rozety z roślin w wieku od czterech do sześciu tygodni, przecinając je żyletką u podstawy ogonka liściowego blisko środka rozety.
2. Natychmiast umieść liście w naczyniach zawierających 20 mM K_2-EDTA. Upewnij się, że odcięty koniec ogonka liściowego jest zanurzony w roztworze (ryc. 2).
3. Po zebraniu 15 liści (ok. trzech do czterech roślin) delikatnie ułóż liście jeden na drugim tak, aby pocięte ogonki były wyrównane ze sobą. Ponownie przeciąć podstawę ogonków liściowych (ok. 1 mm) i natychmiast przenieść liście do jednej z probówek reakcyjnych z roztworem 20 mM K 2-EDTA. Liście pasują najłatwiej, jeśli są lekko zwinięte. Unikaj ściskania liści, ponieważ może to spowodować uszkodzenie komórek, a tym samym prowadzić do gromadzenia się komórek liściowych.
4. Jeśli potrzeba więcej materiału, delikatnie przykryj próbki mokrym ręcznikiem papierowym. Użyj nowego zestawu szalek, jeśli do pobierania próbek z różnych zabiegów lub genotypów.
5. Po umieszczeniu wszystkich próbek w probówkach reakcyjnych należy zebrać wysięk w ciemności lub w świetle.
6. Do zbierania w ciemności wyłóż podłogę dużego płytkiego naczynia mokrymi ręcznikami papierowymi. Umieść ruszt z rurkami reakcyjnymi wypełnionymi liśćmi w naczyniu i przykryj mokrymi ręcznikami papierowymi lub włóż do czarnego plastikowego tyłu ze szczelinami do napowietrzenia. Umieść cały zestaw w szafce lub ciemnym pomieszczeniu.
7. Aby zebrać w świetle, wyłóż dno przezroczystego pojemnika z pleksi mokrymi ręcznikami papierowymi. Umieść stojak z rurkami reakcyjnymi wypełnionymi liśćmi w pojemniku i zamknij go.
8. Po 1 godzinie delikatnie wyjmij liście z pojemnika i probówek reakcyjnych i dokładnie umyj wodą destylowaną, dejonizowaną lub Millipore w celu usunięcia całego EDTA. Ten krok służy trzem celom: (1) usuwa EDTA w celu zminimalizowania uszkodzeń komórek, (2) eliminuje interferencję EDTA z SDS-PAGE i chromatografią oraz (3) usuwa wszelkie związki, które nagromadziły się z pociętych/uszkodzonych komórek. Natychmiast przenieść do przygotowanych probówek reakcyjnych zawierających autoklawowaną wodę i powrócić do nawilżonych pojemników zbiorczych w celu zebrania wysięku. W tym momencie dodaj inhibitor RNazy, jeśli wysięk musi być użyty do ekstrakcji RNA. Opcjonalnie: inhibitor proteinazy może być dodany, jeśli pożądana jest analiza białka.
9. Po zamierzonym czasie zbioru wyciągnąć i wyrzucić liście, a wysięk łyka zamrozić w płynie_N2 do dalszego wykorzystania. Jeśli konieczne jest dłuższe przechowywanie, należy liofilizować próbki i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
10. W przypadku rzodkiewnika metabolity można wykryć już po pobraniu wysięku przez 1 godzinę. Jednak zbieranie przez 5-8 godzin jest wskazane, jeśli planowana jest analiza mniej obfitych składników. W przypadku większych roślin, takich jak pachnotka, zalecany jest dłuższy czas zbioru (8 godzin).
    Wysięk zebrany z 15 liści zwykle wystarcza na jeden pas na żelu SDS-PAGE (białka), do ekstrakcji mRNA, GC-MS (cukry i metabolity). W przypadku analizy lipidów zaleca się zebranie 2-3 próbek (wysięk z 30-45 liści), co prowadzi do wyraźniejszych wyników.

4. Późniejsza analiza (dla wideo pokazujemy tylko 4.4)

1. W celu analizy białek należy ponownie zawiesić próbkę w 15 μl wody i 30 μl buforu Lämmli, podgrzać do 95 °C przez 5 minut, szybko odwirować wszelkie osady i załadować całą próbkę do żelu SDS-PAGE (45 μl kieszeni ładujących). Próbki należy barwić koloidalnymi barwnikami Coomassie lub innymi wrażliwymi barwnikami, ponieważ obfitość białek jest bardzo niska.
2. W przypadku analizy cukrów i małych metabolitów do wysuszonej próbki dodać środki do derywatyzacji, jak opisano w literaturze¹⁴.
3. mRNA można analizować za pomocą RT-PCR, mikromacierzy lub analizy RNA-Seq.
4. Do analizy lipidów natychmiast zebrać dwie do trzech próbek i podzielić na zawartość chloroformu:metanolu (1:1) w dygestorii w następujący sposób: dodać równą ilość chloroformu: metanolu do każdej próbki, wirować przez kilka sekund i wirować przez 4 minuty przy 400 x g. Zebrać dolną (organiczną) fazę do szklanej probówki z teflonową nakrętką i powtórzyć podział z górną fazą jeszcze trzy razy. Wysuszyć połączone fazy organiczne pod strumieniem_N2 i poddać dalszej analizie (chromatografia cienkowarstwowa: TLC^{14, 37}; Chromatografia cieczowa - spektrometria mas: LC-MS¹⁴).

Wyniki

W ciągu ostatnich kilku lat stało się jasne, że złożoność soku z łyka może być odpowiedzią na pytanie, w jaki sposób rośliny wysyłają różne sygnały rozwojowe i stresowe w celu uzyskania optymalnej odpowiedzi. Wykorzystanie wysięku łyka wspomaganego przez EDTA może dać możliwość analizy wysięków łyka z roślin, które nie nadają się do innych podejść, ale mogą mieć znaczenie ekonomiczne lub fizjologiczne.

Ta metoda pozwala na zebranie wystarczającej ilości wysięku łyka, aby zidentyfikować białka zlokalizowane w łyku i wykryć zmiany w ich poziomie w odpowiedzi na rozwój lub stres (Rysunek 3). Jak widać na rysunku, białka występują w bardzo niskiej obfitości, ale ich poziom jest wystarczająco wysoki, aby można było przeprowadzić kolejne eksperymenty proteomiczne z użyciem LC-MS/MS lub do analizy Western blot. Odkrycia u dyniowatych sugerują, że przecięcie łodygi prowadzi do zakłócenia równowagi potencjału wodnego, a następnie do napływu wody i możliwych zanieczyszczeń z apoplastu⁴¹. Jednak pobieranie przez czas od jednej do ośmiu godzin nie wpływa na profil/skład białka łyka u Arabidopsis (tylko ilość bezwzględna różni się Guelette i wsp.), ilość zebranego białka i wzór znalezionych białek różnią się w zależności od gatunku (Arabidopsis: A.t.; Pachnotka, tor I i NI) oraz zabiegi (pachnotka uprawiana o różnej długości dnia, ścieżka I i NI). W rezultacie sygnały białkowe mogą być wizualizowane, identyfikowane i śledzone.

mRNA i mikro RNA można również zidentyfikować w wysiękach łyka za pomocą tej metody. Jednak leczenie inhibitorem RNAzy jest konieczne, aby zapobiec degradacji mRNA podczas wydłużonego czasu wysięku. Ponieważ elementy sita nie zawierają funkcjonalnych chloroplastów, małe lub duże podjednostki Rubisco (odpowiednio RbcS lub RbcL) mRNA mogą być używane jako kontrole negatywne, podczas gdy znane mRNA zlokalizowane w łyku, takie jak enzym sprzęgający ubikwitynę, mogą być używane jako kontrola pozytywna (Figura 4).

Podobnie, cukry lub małe metabolity mogą być analizowane za pomocą GC-MS lub LC-MS. W tym miejscu należy wspomnieć, że wysięki łyka zawierają dużą liczbę funkcjonalnych enzymów, w tym prawie cały szlak glikolityczny¹². W związku z tym użycie kilku punktów czasowych może ujawnić procesy metaboliczne podczas pobierania wysięku. Przykład pokazano na rycinie 5: We wszystkich wysiękach sacharoza jest najobficiej występującym metabolitem; Jest to najbardziej oczywiste po zbiorze przez 1 godzinę. Jednak po pięciu godzinach stosunek sacharozy do fruktozy nieznacznie się zmniejsza. Jeśli ten sam wysięk zostanie pobrany na godzinę i pozostawiony na stole na następne cztery godziny, stosunek sacharozy do fruktozy zmniejszy się w znacznie większym stopniu, co sugeruje, że aktywne enzymy w wysiękach łyka prowadzą do degradacji sacharozy w temperaturze pokojowej (więcej interpretacji pików znajduje się w ¹⁴). Jest to zgodne z ustaleniami, że ładowanie łyka i transport cząsteczek z komórek towarzyszących do elementów sita może być kontynuowany podczas wysięku, dopóki system nie straci swojej żywotności³⁴.

Lipidy w wysiękach łyka, a co za tym idzie, sygnalizacja lipidowa na duże odległości to stosunkowo nowe pole zainteresowania w nauce o roślinach. Ze względu na swój hydrofobowy charakter lipidy są obecne tylko w niskich stężeniach i mogą być wiązane z innymi cząsteczkami w celu rozpuszczania. Jednak wysięk wspomagany przez EDTA pozwala na zebranie wystarczającej ilości materiału do wizualizacji (TLC; Rysunek 6) i zidentyfikować (LC-MS; Rysunek 7) lipidy łyka z kilku gatunków roślin. Jak widać na rysunku, możliwe jest zidentyfikowanie i oddzielenie kilku gatunków lipidów. LC-MS pozwala na identyfikację różnych gatunków lipidów i monitorowanie zmian w profilach lipidowych różnych genotypów lub zabiegów. Pozwala to na badanie roli lipidów podczas rozwoju roślin i reakcji na stres.

Rysunek 1. Schemat blokowy zbioru wysięków łyka Arabidopsis lub pachnotki. Różne ścieżki prowadzą do różnych produktów końcowych, które są oznaczone kolorem niebieskim. W celu przygotowania RNA inhibitor RNAzy (100 U/ml, Roche) dodaje się do wody, do której zbiera się wysięk łyka.
Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 2. Przygotowanie materiałów do zbierania wysięku z łyka. Ustawienia wyświetlają wszystkie materiały potrzebne do kroków protokołu 3.1-3.4.
Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 3. Białka znajdujące się w wysiękach łyka dwóch różnych gatunków roślin, Arabidopsis (A.t.) i Perilla (I i NI; różna długość dnia); MW: marker masy cząsteczkowej (tor 2). Białka rozdzielono za pomocą 10-20% gradientu SDS-PAGE.
Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 4. Analiza obecności mRNA dla małej i dużej podjednostki Rubisco (odpowiednio RbcS i RbcL) oraz enzymu sprzężonego z ubikwityną (UBC). mRNA pobrano z liści rzodkiewnika (L), ogonków liściowych (P) i wysięków łyka (Ph), odwrotnie transkrybowanych i specyficznych transkryptów wizualizowanych za pomocą PCR. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie Guelette et al.¹⁴.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 5. Profil GC-MS wysięków łyka zbieranych różną ilość razy. Zauważ, jak zmienia się względna ilość sacharozy od 1 godziny zbioru (A) do 5 godzin czasu zbierania (B). Profil wysięku po pobraniu przez 1 godzinę, a następnie "inkubacja" w temperaturze pokojowej (RT) przez cztery godziny (C). Profil metabolitów liściowych (D).
Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 6. Chromatogram cienkowarstwowy porównujący lipidy z liści pachnotki (po lewej) i Arabidopsis (po prawej) oraz wysięków łyka. Gwiazdki wskazują lipidy specyficzne dla wysięku łyka. DGDG: digalaktozylogililoglicerol; PG: fosfatydyloglicerol; MGDG: monogalaktozylodiacyglicerol; Część rysunku przedstawiająca lipidy Arabidopsis została zmodyfikowana z Guelette et al.¹⁴.
Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 7. Profil lipidowy wysięków łyka rzodkiewnika (faza chloroformowa) w trybie LC-MS / jonów ujemnych. Wykresy na górze (mutant, A) i na dole (typ dziki, B) pokazują różnice w profilach lipidowych między dwoma różnymi genotypami (oznaczonymi strzałkami).
Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Dyskusja

Zbieranie wysięków łyka wspomagane przez EDTA jest bardzo proste, wymaga minimalnego sprzętu i ma zastosowanie do większości roślin. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta rozszerza możliwość analizy wysięków łyka z większej liczby gatunków. Chociaż wysięk jest rozcieńczony, łatwo jest zebrać wiele różnych próbek lub z wielu roślin, aby zwiększyć skalę do dużej ilości materiału. Pozwala to na wykrycie nowych związków, które występują w bardzo małej ilości i w przeciwnym razie zostałyby przeoczone.

Metoda ta może być stosowana w odniesieniu do wielu gatunków roślin i prac zgodnie z opisem dla tych wymienionych w tym manuskrypcie. Jeśli badane są nowe gatunki, dwa aspekty, które mogą wymagać modyfikacji, to liczba użytych liści i czas wysięku. W większości przypadków odpowiedni powinien być wysięk trwający od pięciu do ośmiu godzin. Aby potwierdzić zastosowanie tej metody w odniesieniu do nowego gatunku roślin, należy pobrać wysięk i przeprowadzić jedną lub więcej późniejszych analiz, jak opisano w części 4 protokołu. W zależności od intensywności obserwowanego sygnału może być konieczne zwiększenie objętości zbierania. Ogólnie rzecz biorąc, analiza lipidów i białek będzie wymagała więcej materiału niż analiza cukrów i metabolitów, ponieważ te pierwsze są mniej obfite w wysięki łyka.

Ze względu na to, że pobieranie wysięku za pomocą EDTA obejmuje powierzchnie cięcia, a także potencjalnie szkodliwe działanie EDTA, należy wziąć pod uwagę kilka punktów: (1) po godzinnej inkubacji z EDTA, ogonki liściowe muszą zostać dokładnie umyte. Usuwa to wszelkie związki uzyskane z uszkodzonych komórek, a także samo EDTA, które mogłyby uszkodzić komórki lub zakłócić ekstrakcję. (2) Należy uwzględnić kontrole dodatnie i ujemne w celu zapewnienia, że uzyskane dane pochodzą z soku łyka, a nie z uszkodzonych komórek (patrz kluczowe etapy poniżej). (3) Sok z łyka zawiera kilka enzymów, które mogą być aktywne podczas zbierania wysięku. Dlatego w niektórych przypadkach może być przydatne zbieranie przez różne okresy czasu. (4) Ponieważ metoda obejmowała wysięk do wody, nie jest możliwe bezwzględne określenie ilościowe związków.

Kroki krytyczne: Kluczem do skutecznego zastosowania tej metody jest zachowanie ostrożności podczas obchodzenia się z próbką, aby nie uszkodzić żadnych komórek, a także zastosowanie odpowiednich kontroli (patrz odnośnik ¹⁴). Jedną z odpowiednich kontroli jest pobieranie wysięków łyka bez wcześniejszego leczenia EDTA. W takim przypadku łyko uszczelni się i nie będzie można zebrać wysięku. W tym miejscu zostaną wykryte wszelkie związki zanieczyszczające pochodzące z uszkodzonych komórek. Drugą kontrolą byłaby analiza cukrów w wysięku. U rzodkiewnika sacharoza powinna być dominującym metabolitem w soku łyka, ze stosunkiem fruktozy do sacharozy między 1:4 a 1:8 (ref ^{8, 14}).

Do ekstrakcji RNA konieczne jest użycie inhibitora RNAzy. Ponadto pozytywna kontrola wcześniej opisanego mRNA zlokalizowanego w łyku (UBC9: Ubikwityna sprzęgająca enzym 9, At4g27960; ^{8, 14}) i wskazana jest negatywna kontrola np. mRNA chloroplastu (Rubisco LSU).

Ponieważ wysięk zawiera aktywne enzymy, zaleca się przebieg w czasie, aby upewnić się, że zmiany w profilu łyka nie są spowodowane po prostu zmianami w czasie zbierania. W niektórych przypadkach korzystne może być stosowanie inhibitorów proteinazy. Badacze muszą jednak pamiętać, że zebrany wysięk będzie skoncentrowany, a wszelkie dodane związki będą w dużej mierze skoncentrowane. Drugim krytycznym krokiem w ramach protokołu jest ponowne przecięcie ogonka liściowego w ramach EDTA. Ten etap służy dwóm celom: po pierwsze, usuwa wszelkie uszczelnione płytki sitowe, zapobiegając tworzeniu się nowych korków, umożliwiając w ten sposób swobodny przepływ soku łyka. Po drugie, usuwa pęcherzyki kawitacyjne w ksylemie powstające podczas cięcia, a tym samym umożliwia transport ksylemu. Wielkość drugiego cięcia zależy od użytych roślin. U roślin o większych ogonkach liściowych powinno to być kilka milimetrów (do 1 cm) powyżej pierwszego cięcia, u roślin takich jak Arabidopsis wystarczy 1-2 mm.

Zastosowanie tej metody może prowadzić do odkrycia nowych związków w wysiękach łyka, które mogą mieć implikacje sygnalizacyjne, rozwojowe lub biomedyczne. Skłoniło to do bardziej dogłębnego przyjrzenia się sygnalizacji lipidowej na duże odległości, która była mało zbadaną dziedziną w naukach o roślinach ze względu na brak dostępu do łyka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
K2-EDTA	Sigma-Aldrich	ED2P-500G
Płytka szklana lub plastikowa szalka Petriego (7-15 cm)	PYREX lub Corning		Każde czyste, płytkie naczynie będzie działać
Chloroform	EMD	CX1054-1	Tylko otwarte pojemniki w dygestoriach
	Metanol J.T.Baker	9070-03
Rurki z nakrętką	VWR International	53283-800
Rurki z nakrętką	Sun Sri	13-425
Rurki Eppendorf	Denville	C2170