Pobieranie i analiza wysięków łyka Arabidopsis przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA

Podsumowanie

Znajomość składu soku łyka, jak również mechanizmu jego ładowania i transportu na duże odległości jest niezbędna do zrozumienia długodystansowej sygnalizacji w rozwoju roślin i odpowiedzi na stres/patogen oraz transportu asymilacyjnego. Niniejszy manuskrypt opisuje pobieranie wysięków łyka przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA.

Streszczenie

Łyko roślinne jest niezbędne do transportu na duże odległości asymilatów (foto)jak również sygnałów przenoszących stres biotyczny lub abiotyczny. Zawiera cukry, aminokwasy, białka, RNA, lipidy i inne metabolity. Chociaż istnieje duże zainteresowanie zrozumieniem składu i funkcji łyka, rola wielu z tych cząsteczek, a tym samym ich znaczenie w rozwoju roślin i reakcji na stres, nie została jeszcze określona. Jedną z barier w analizie łyka jest fakt, że łyko uszczelnia się po zranieniu. W rezultacie liczba roślin, z których można uzyskać sok z łyka, jest ograniczona. Jedną z metod, która umożliwia zbieranie wysięków łyka z kilku gatunków roślin bez dodatkowego sprzętu, jest opisane tutaj zbieranie wysięku łyka z wykorzystaniem EDTA. Chociaż jest łatwy w użyciu, prowadzi do zranienia komórek i należy zachować ostrożność, aby usunąć zawartość uszkodzonych komórek. Ponadto konieczne jest przeprowadzenie kilku kontroli w celu udowodnienia czystości wysięku. Ponieważ jest to wysięk, a nie bezpośrednie zebranie soku z łyka (co nie jest możliwe u wielu gatunków), może nastąpić tylko względna kwantyfikacja jego zawartości. Przewagą tej metody nad innymi jest to, że może być stosowana w wielu gatunkach roślin zielnych lub drzewiastych (pachnotka, rzodkiewnik, topola itp.) i wymaga minimalnego sprzętu i treningu. Prowadzi to do powstania dość dużych ilości wysięków, które można wykorzystać do późniejszej analizy białek, cukrów, lipidów, RNA, wirusów i metabolitów. Jest na tyle prosty, że może być używany zarówno w badaniach, jak i w laboratorium dydaktycznym.

Wprowadzenie

Rośliny nie mogą się poruszać, aby uniknąć niekorzystnych warunków. W związku z tym musieli opracować mechanizmy wykrywania stresów środowiskowych, wywoływania i przesyłania odpowiedniego sygnału w całym zakładzie oraz odpowiedniego dostosowania rozwoju. Istnieją dwa systemy transportu do dystrybucji wody, składników odżywczych i innych związków (sygnalizacyjnych). Pierwszym z nich jest ksylem; który zazwyczaj transportuje wodę i minerały pobierane przez korzenie w całej roślinie. Drugi to łyko. Widok łyka zmienił się z prostego systemu transportu asymilacyjnego na kanał dla RNA, białka, wirusów, lipidów i innych małych cząsteczek. Odgrywa ważną rolę w przyswajaniu i transporcie składników odżywczych, odpowiedzi na stres biotyczny i abiotyczny, a także we wzroście i rozwoju roślin. Obecnie nazywa się ją "informacyjną autostradą" elektrowni¹⁸.

Łyko składa się z kilku typów komórek: miąższu łyka, a także wyspecjalizowanych komórek towarzyszących i elementów sita. Element sitowy jest miejscem ruchu na duże odległości. Aby umożliwić niezakłócony przepływ wzdłużny, w elementach sita brakuje większości organelli, a także jąder i uważa się, że zawierają w najlepszym razie ograniczoną maszynerię translacyjną^{21, 33}. Uważa się, że komórki towarzyszące syntetyzują białka i inne związki, które przemieszczają się w strumieniu łyka. Związki te są następnie transportowane do elementu sitowego za pośrednictwem plazmodesmatów i mogą funkcjonować jako sygnały na duże odległości ^4,16.

W wysiękach łyka można znaleźć kilka grup związków:

• Cukry są często produktami fotosyntezy i są transportowane jako cząsteczki "przenoszące energię" do innych części rośliny w celu magazynowania lub jako elementy budulcowe. Mogą jednak również działać jako środek przeciw zamarzaniu lub jako związki sygnalizacyjne.
• Białka można również znaleźć w wysiękach łyka. Obejmują one enzymy metaboliczne, ale pełnią również funkcję sygnalizacyjną. Jednym z przykładów białka, które służy jako sygnał rozwojowy, jest białko locus T kwitnienia, które sygnalizuje indukcję kwitnienia, a także sezonowe odcięcie liści u roślin. ⁶
• Kwasy nukleinowe są obecne w wysiękach łyka w postaci mRNA, małych i mikro RNA oraz wirusowych RNA. Wydaje się, że są one w dużej mierze zaangażowane w sygnalizację ^{27, 28, 39}. W tym samym czasie zaobserwowano rRNA i tRNA dla prawie wszystkich aminokwasów w soku łykowym dyniowatych⁴². Wydaje się, że są one selektywnie przenoszone do systemu rurek sitowych. TRNA wykazują modyfikacje niezbędne do przenoszenia aminokwasów do aparatu translacyjnego. Jednak zamiast uczestniczyć w tłumaczeniu, wydają się hamować ten proces. Alternatywnie mogą służyć jako źródło cytokininy lub sygnalizować stan metaboliczny rośliny⁴².
• Kwasy tłuszczowe, oksylipiny i inne lipidy znaleziono również w wysiękach łyka ^{3, 13, 14, 23}. Kwas jasmonowy, oksylipina, przemieszcza się przez łyko w ramach odpowiedzi na zakażenie patogenem^{22, 29, 31, 32}. Chociaż rola większości lipidów łyka jest nadal niejasna, niektóre z nich prawdopodobnie pełnią funkcję sygnalizacyjną⁴.

Wyzwanie w pracy z łykiem roślinnym polega na jego zdolności do uszczelniania się po zranieniu. Istnieją cztery główne metody stosowane do zbierania wysięków łyka, ale działają one tylko u wybranych gatunków:

1) U dyniowatych możliwe jest uzyskanie rozsądnych ilości wysięku łyka poprzez nacięcia ogonka liściowego. Po usunięciu początkowej kropli z zanieczyszczeniem uszkodzonych komórek możliwe jest uzyskanie rozsądnie dużych ilości czystego soku łyka ^{1, 15}. Jednak wraz z wydłużaniem się czasu zbierania, wysięk ten gęstnieje, co czyni go coraz mniej odpowiednim do metod chromatografii cieczowej (niepublikowanych). Ostatnie publikacje sugerują, że w zależności od gatunku, ten sok łyka pochodzi z łyka pęczkowego (FP) lub pozapęczkowego (EP) i że chociaż zawiera "ruchomy" sok łyka z elementów sita (FP), jest również podatny na zanieczyszczenie innymi typami komórek, w tym ksylemem^{40, 41}.

2) Drugim podejściem jest uzyskanie soku z łyka poprzez płytkie nacięcia lub nakłucia w łodydze lub ogonku liściowym. Metoda ta jest z powodzeniem stosowana w łubinie ^{17, 25}, dyniowatych³⁶ i Brassica napus¹². Tutaj zanieczyszczenie uszkodzonymi komórkami jest minimalne, a wysięk jest bardzo czysty. Jednak rośliny muszą być zdrowe i dobrze nawodnione, ponieważ selektywne nakłuwanie samych elementów sita jest bardzo trudne. Jeśli naczynia ksylemu zostaną nacięte, cały wysięk jest wciągany do strumienia ksylemu. To sprawia, że metoda nie jest odpowiednia dla roślin o bardzo kruchych lub silnie zdrewniałych ogonkach lub łodygach.

3) Stylektomia mszyc pozwala mszycom na wprowadzenie swojego styliku do elementów sita, a następnie usunięcie mszycy za pomocą lasera. Sok z łyka jest wydzielany przez pozostały sztylet^{2, 9, 10, 35, 38}. Teoretycznie do tego podejścia można użyć każdej rośliny, która może zostać zainfekowana przez mszyce. Jednak większość osób zarządzających szklarniami lub komorami wzrostu nie poprze stosowania patogenu. Ponadto mszyce wprowadzają kilka białek do łyka wraz ze śliną ^{19, 33}. Prowadzi to do ograniczonego przeprogramowania transkrypcji ³⁰ i może potencjalnie zmienić skład łyka²⁶.

4) Opisana tutaj metoda to wspomagany przez EDTA wysięk z łyka. Ta metoda wykorzystuje EDTA, aby zapobiec uszczelnieniu łyka²⁰. EDTA chelatuje jony Ca²⁺, które w przeciwnym razie uczestniczyłyby w procesach uszczelniających łyko. Podczas gdy EDTA może prowadzić do uszkodzenia komórek³⁰, kilka grup stosowało tę metodę i nie zaobserwowało niekorzystnego wpływu stężeń EDTA od 10 mM do 20 mM na ultrastrukturę komórki lub na ładowanie i transport łyka^{5, 24}. Aby zmniejszyć szkodliwy wpływ, a także interferencję EDTA z chromatografią i elektroforezą żelową, rośliny przenosi się do wody po 1 godzinie i wykorzystuje się tylko późniejszą część wysięku¹⁴. Tak więc, zamiast wysięku do EDTA, łyko jest wysiękiwane do wody (wysięk ułatwiony przez EDTA). Jest to prosta, tania i niezaawansowana technologicznie metoda zbierania wysięków z łyka. Otrzymany w ten sposób sok łykowy może być stosowany do analizy białek, małych cząsteczek, lipidów i RNA i jest z powodzeniem stosowany w wielu roślinach. Chociaż przeprowadzono ograniczoną liczbę eksperymentów na roślinach jednoliściennych¹¹, metoda wydaje się być bardziej odpowiednia dla roślin dwuliściennych (Perilla^{17, 20}, Arabidopsis^{8, 13, 14}, Topola⁷). Zbieranie wysięków musi odbywać się w wilgotnym środowisku, aby uniknąć utraty wysięku w wyniku transpiracji. W zależności od rośliny, inkubacja w EDTA przez jedną do dwóch godzin jest wystarczająca, aby zapobiec uszczelnieniu elementów łyka/sita. Zbieranie może wtedy nastąpić do wody. Ma to tę zaletę, że zapobiega negatywnemu wpływowi EDTA na strukturę i stabilność komórki. Eliminuje również interferencję EDTA z metodami takimi jak HPLC lub SDS-Page. Jest to pokazane tak, jak w przypadku Arabidopsis. W przypadku większych roślin inkubacja w kolekcjach EDTA i wysięku musi być zwiększona i przeprowadzana w zlewkach, a nie w probówkach reakcyjnych o pojemności 1,7 ml.

Protokół

1. Przygotowanie roślin

1. Nasiona rzodkiewnika mogą kiełkować bezpośrednio na glebie lub na płytkach MS. Uprawiaj rośliny przez cztery do sześciu tygodni w komorach wzrostowych z 12-godzinnym fotoperiodem (22 °C w dzień, 15 °C w nocy¹⁴). Podlewaj rośliny raz do dwóch razy w tygodniu. Użyj dolnej tacy do podlewania; nie podlewaj roślin od góry; Pozostaw tace do wyschnięcia przed ponownym podlaniem. Upewnij się, że rośliny są dobrze nawodnione w czasie zbiorów.

2. Przygotowanie roztworów i potraw

1. Roztwór K_2-EDTA: Przygotować 100 mM roztwór podstawowy roztworu_{K 2-EDTA}, który można przechowywać w lodówce. W dniu pobrania rozcieńczyć roztwór od 1 do 5 (jedna część roztworu EDTA, cztery części wody), aby otrzymać roztwór₂₀ mM K 2-EDTA.
2. Napełnij szklankę lub szalkę Petriego (średnica 7-15 cm) do połowy roztworem₂₀ mM K 2-EDTA. W przypadku pobierania próbek z różnych zabiegów (na przykład roślin kontrolnych i narażonych na zasolenie lub różnych genotypów), przygotuj osobne potrawy dla każdego zabiegu.
3. Napełnij żądaną liczbę probówek reakcyjnych o pojemności 1,7 ml 1,4 ml roztworu 20 mM K_2-EDTA. Napełnij równą liczbę probówek reakcyjnych 1,4 ml autoklawowanej wody dejonizowanej lub miliporowej.
4. Połóż ręczniki papierowe na ławce, aby posadzić na niej rośliny; weź jedną nową żyletkę i załóż rękawiczki.

3. Zbiór wysięków łyka (przedstawiony na schemacie blokowym na rysunku 1)

1. Zbierz liście rozety z roślin w wieku od czterech do sześciu tygodni, przecinając je żyletką u podstawy ogonka liściowego blisko środka rozety.
2. Natychmiast umieść liście w naczyniach zawierających 20 mM K_2-EDTA. Upewnij się, że odcięty koniec ogonka liściowego jest zanurzony w roztworze (ryc. 2).
3. Po zebraniu 15 liści (ok. trzech do czterech roślin) delikatnie ułóż liście jeden na drugim tak, aby pocięte ogonki były wyrównane ze sobą. Ponownie przeciąć podstawę ogonków liściowych (ok. 1 mm) i natychmiast przenieść liście do jednej z probówek reakcyjnych z roztworem 20 mM K 2-EDTA. Liście pasują najłatwiej, jeśli są lekko zwinięte. Unikaj ściskania liści, ponieważ może to spowodować uszkodzenie komórek, a tym samym prowadzić do gromadzenia się komórek liściowych.
4. Jeśli potrzeba więcej materiału, delikatnie przykryj próbki mokrym ręcznikiem papierowym. Użyj nowego zestawu szalek, jeśli do pobierania próbek z różnych zabiegów lub genotypów.
5. Po umieszczeniu wszystkich próbek w probówkach reakcyjnych należy zebrać wysięk w ciemności lub w świetle.
6. Do zbierania w ciemności wyłóż podłogę dużego płytkiego naczynia mokrymi ręcznikami papierowymi. Umieść ruszt z rurkami reakcyjnymi wypełnionymi liśćmi w naczyniu i przykryj mokrymi ręcznikami papierowymi lub włóż do czarnego plastikowego tyłu ze szczelinami do napowietrzenia. Umieść cały zestaw w szafce lub ciemnym pomieszczeniu.
7. Aby zebrać w świetle, wyłóż dno przezroczystego pojemnika z pleksi mokrymi ręcznikami papierowymi. Umieść stojak z rurkami reakcyjnymi wypełnionymi liśćmi w pojemniku i zamknij go.
8. Po 1 godzinie delikatnie wyjmij liście z pojemnika i probówek reakcyjnych i dokładnie umyj wodą destylowaną, dejonizowaną lub Millipore w celu usunięcia całego EDTA. Ten krok służy trzem celom: (1) usuwa EDTA w celu zminimalizowania uszkodzeń komórek, (2) eliminuje interferencję EDTA z SDS-PAGE i chromatografią oraz (3) usuwa wszelkie związki, które nagromadziły się z pociętych/uszkodzonych komórek. Natychmiast przenieść do przygotowanych probówek reakcyjnych zawierających autoklawowaną wodę i powrócić do nawilżonych pojemników zbiorczych w celu zebrania wysięku. W tym momencie dodaj inhibitor RNazy, jeśli wysięk musi być użyty do ekstrakcji RNA. Opcjonalnie: inhibitor proteinazy może być dodany, jeśli pożądana jest analiza białka.
9. Po zamierzonym czasie zbioru wyciągnąć i wyrzucić liście, a wysięk łyka zamrozić w płynie_N2 do dalszego wykorzystania. Jeśli konieczne jest dłuższe przechowywanie, należy liofilizować próbki i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
10. W przypadku rzodkiewnika metabolity można wykryć już po pobraniu wysięku przez 1 godzinę. Jednak zbieranie przez 5-8 godzin jest wskazane, jeśli planowana jest analiza mniej obfitych składników. W przypadku większych roślin, takich jak pachnotka, zalecany jest dłuższy czas zbioru (8 godzin).
    Wysięk zebrany z 15 liści zwykle wystarcza na jeden pas na żelu SDS-PAGE (białka), do ekstrakcji mRNA, GC-MS (cukry i metabolity). W przypadku analizy lipidów zaleca się zebranie 2-3 próbek (wysięk z 30-45 liści), co prowadzi do wyraźniejszych wyników.

4. Późniejsza analiza (dla wideo pokazujemy tylko 4.4)

1. W celu analizy białek należy ponownie zawiesić próbkę w 15 μl wody i 30 μl buforu Lämmli, podgrzać do 95 °C przez 5 minut, szybko odwirować wszelkie osady i załadować całą próbkę do żelu SDS-PAGE (45 μl kieszeni ładujących). Próbki należy barwić koloidalnymi barwnikami Coomassie lub innymi wrażliwymi barwnikami, ponieważ obfitość białek jest bardzo niska.
2. W przypadku analizy cukrów i małych metabolitów do wysuszonej próbki dodać środki do derywatyzacji, jak opisano w literaturze¹⁴.
3. mRNA można analizować za pomocą RT-PCR, mikromacierzy lub analizy RNA-Seq.
4. Do analizy lipidów natychmiast zebrać dwie do trzech próbek i podzielić na zawartość chloroformu:metanolu (1:1) w dygestorii w następujący sposób: dodać równą ilość chloroformu: metanolu do każdej próbki, wirować przez kilka sekund i wirować przez 4 minuty przy 400 x g. Zebrać dolną (organiczną) fazę do szklanej probówki z teflonową nakrętką i powtórzyć podział z górną fazą jeszcze trzy razy. Wysuszyć połączone fazy organiczne pod strumieniem_N2 i poddać dalszej analizie (chromatografia cienkowarstwowa: TLC^{14, 37}; Chromatografia cieczowa - spektrometria mas: LC-MS¹⁴).

Wyniki

W ciągu ostatnich kilku lat stało się jasne, że złożoność soku łykowego może być odpowiedzią na pytanie o to, w jaki sposób rośliny przesyłają zróżnicowane sygnały rozwojowe i stresowe w celu uzyskania optymalnej odpowiedzi. Zastosowanie eksudacji łyka wspomaganej przez EDTA może zapewnić możliwość analizy wysięków łykowych z roślin, które nie nadają się do innych metod, ale mogą być interesujące pod kątem ekonomicznym lub fizjologicznym.

Metoda ta pozwala na pozyskanie wystarczającej ilości eksudatów łyka do identyfikacji białek zlokalizowanych w łyku oraz wykrywania zmian w ich poziomie w odpowiedzi na rozwój lub stres (Rysunek 3). Jak pokazuje rysunek, białka występują w bardzo niskich stężeniach, jednak ich poziom jest wystarczająco wysoki dla późniejszych eksperymentów proteomicznych z wykorzystaniem LC-MS/MS lub dla analizy Western blot. Wyniki uzyskane dla roślin z rodziny dyniowatych sugerują, że przecięcie łodygi prowadzi do zaburzenia równowagi potencjału wody i w konsekwencji do napływu wody oraz możliwych zanieczyszczeń z apoplastu⁴¹. Niemniej jednak zbieranie eksudatów przez czas od jednej do ośmiu godzin nie wpływa na profil/skład białek łyka u Arabidopsis (zmienia się jedynie bezwzględna ilość, Guelette et al.), natomiast ilość zebranego białka i wzór znalezionych białek różnią się w zależności od gatunku (Arabidopsis: A.t.; Perilla, ścieżka I i NI) oraz zabiegów (Perilla hodowana przy różnej długości dnia, ścieżka I i NI). W rezultacie sygnały białkowe mogą być wizualizowane, identyfikowane i śledzone.

mRNA i mikroRNA można również zidentyfikować w eksudatach łyka za pomocą tej metody. Jednakże, aby zapobiec degradacji mRNA podczas wydłużonego czasu eksudacji, konieczne jest zastosowanie inhibitora RNAzy. Ponieważ elementy sitowe nie zawierają funkcjonalnych chloroplastów, mRNA małej lub dużej podjednostki Rubisco (odpowiednio RbcS lub RbcL) mogą służyć jako kontrole negatywne, natomiast znane mRNA zlokalizowane w łyku, takie jak enzym konjugujący ubikwitynę, mogą być wykorzystane jako kontrola pozytywna (Rysunek 4).

Podobnie cukry lub małe metabolity można analizować za pomocą GC-MS lub LC-MS. Należy tutaj wspomnieć, że wysięki łyka zawierają dużą liczbę aktywnych enzymów, w tym niemal cały szlak glikolityczny¹². W związku z tym zastosowanie kilku punktów czasowych może ujawnić procesy metaboliczne zachodzące podczas pobierania wysięku. Przykład przedstawiono na rysunku 5: we wszystkich wysiękach najliczniejszym metabolitem jest sacharoza; jest to najbardziej widoczne po 1 godzinie pobierania. Jednak po pięciu godzinach stosunek sacharozy do fruktozy jest nieco zmniejszony. Jeśli ten sam wysięk jest pobierany przez jedną godzinę, a następnie pozostawiony na blacie przez kolejne cztery godziny, stosunek sacharozy do fruktozy ulega znacznie większej redukcji, co sugeruje, że aktywne enzymy w wysiękach łyka prowadzą do degradacji sacharozy w temperaturze pokojowej (więcej interpretacji pików patrz w ¹⁴). Jest to zgodne z ustaleniami, według których załadunek do łyka i transport cząsteczek z komórek towarzyszących do rurek sitowych mogą trwać podczas wysiękania aż do momentu utraty żywotności układu³⁴.

Lipidy w eksudatach łyka, a co za tym idzie, dalekosiężna sygnalizacja lipidowa, stanowią stosunkowo nową dziedzinę zainteresowań w naukach o roślinach. Ze względu na swoją hydrofobową naturę lipidy występują jedynie w niskich stężeniach i mogą być związane z innymi cząsteczkami w celu ich solubilizacji. Niemniej jednak eksudacja wspomagana przez EDTA umożliwia zebranie wystarczającej ilości materiału do wizualizacji (TLC; Rysunek 6) i identyfikacji (LC-MS; Rysunek 7) lipidów łyka z kilku gatunków roślin. Jak pokazuje rysunek, możliwe jest zidentyfikowanie i rozdzielenie kilku rodzajów lipidów. LC-MS pozwala na identyfikację różnych gatunków lipidów oraz monitorowanie zmian w profilach lipidowych różnych genotypów lub w zależności od zastosowanych zabiegów. Umożliwia to badanie roli lipidów podczas rozwoju roślin i reakcji na stres.

Rycina 1. Schemat blokowy zbierania eksudatów łyka Arabidopsis lub Perilla. Różne ścieżki prowadzą do różnych produktów końcowych, które zaznaczono na niebiesko. Do przygotowania RNA do wody, do której zbierany jest eksudat łyka, dodaje się inhibitor RNAzy (100 U/ml, Roche).
Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rycina 2. Przygotowanie materiałów do pobierania eksudatów łyka. Zestaw zawiera wszystkie materiały niezbędne do wykonania kroków protokołu od 3.1 do 3.4.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 3. Białka występujące w eksudatach łyka dwóch różnych gatunków roślin, Arabidopsis (A.t.) i Perilla (I i NI; różne długości dnia); MW: marker masy cząsteczkowej (ścieżka 2). Białka rozdzielono przy użyciu gradientowego żelu SDS-PAGE 10-20%.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 4. Analiza obecności mRNA dla małej i dużej podjednostki Rubisco (odpowiednio RbcS i RbcL) oraz enzymu konjugującego ubikwitynę (UBC). mRNA pobrano z liści (L), ogonków liściowych (P) i eksudatów łyka (Ph) Arabidopsis, poddano odwrotnej transkrypcji, a specyficzne transkrypty zwizualizowano za pomocą PCR. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Guelette et al.¹⁴.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 5. Profil GC-MS eksudatów łyka zbieranych przez różne przedziały czasu. Zwróć uwagę, jak zmienia się względna ilość sacharozy od 1 godziny zbierania (A) do 5 godzin czasu zbierania (B). Profil eksudatu po zbieraniu przez 1 godzinę, a następnie „inkubacji” w temperaturze pokojowej (RT) przez cztery godziny (C). Profil metabolitów liścia (D).
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 6. Chromatogram cienkowarstwowy porównujący lipidy z liści i wysięków łyka Perilla (lewo) oraz Arabidopsis (prawo). Gwiazdki wskazują lipidy specyficzne dla wysięków łyka. DGDG: digalaktosylodiacyloglicerol; PG: fosfatydyloglicerol; MGDG: monogalaktosylodiacyloglicerol; Część ryciny przedstawiająca lipidy Arabidopsis została zmodyfikowana na podstawie pracy Guelette et al.¹⁴.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 7. Profil lipidowy wysięków łyka Arabidopsis (faza chloroformowa) z wykorzystaniem LC-MS/ w trybie jonów ujemnych. Wykresy u góry (mutant, A) i na dole (typ dziki, B) pokazują różnice w profilach lipidowych między dwoma różnymi genotypami (wskazane strzałkami).
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

Zbieranie wysięków łyka wspomagane przez EDTA jest bardzo proste, wymaga minimalnego sprzętu i ma zastosowanie do większości roślin. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta rozszerza możliwość analizy wysięków łyka z większej liczby gatunków. Chociaż wysięk jest rozcieńczony, łatwo jest zebrać wiele różnych próbek lub z wielu roślin, aby zwiększyć skalę do dużej ilości materiału. Pozwala to na wykrycie nowych związków, które występują w bardzo małej ilości i w przeciwnym razie zostałyby przeoczone.

Metoda ta może być stosowana w odniesieniu do wielu gatunków roślin i prac zgodnie z opisem dla tych wymienionych w tym manuskrypcie. Jeśli badane są nowe gatunki, dwa aspekty, które mogą wymagać modyfikacji, to liczba użytych liści i czas wysięku. W większości przypadków odpowiedni powinien być wysięk trwający od pięciu do ośmiu godzin. Aby potwierdzić zastosowanie tej metody w odniesieniu do nowego gatunku roślin, należy pobrać wysięk i przeprowadzić jedną lub więcej późniejszych analiz, jak opisano w części 4 protokołu. W zależności od intensywności obserwowanego sygnału może być konieczne zwiększenie objętości zbierania. Ogólnie rzecz biorąc, analiza lipidów i białek będzie wymagała więcej materiału niż analiza cukrów i metabolitów, ponieważ te pierwsze są mniej obfite w wysięki łyka.

Ze względu na to, że pobieranie wysięku za pomocą EDTA obejmuje powierzchnie cięcia, a także potencjalnie szkodliwe działanie EDTA, należy wziąć pod uwagę kilka punktów: (1) po godzinnej inkubacji z EDTA, ogonki liściowe muszą zostać dokładnie umyte. Usuwa to wszelkie związki uzyskane z uszkodzonych komórek, a także samo EDTA, które mogłyby uszkodzić komórki lub zakłócić ekstrakcję. (2) Należy uwzględnić kontrole dodatnie i ujemne w celu zapewnienia, że uzyskane dane pochodzą z soku łyka, a nie z uszkodzonych komórek (patrz kluczowe etapy poniżej). (3) Sok z łyka zawiera kilka enzymów, które mogą być aktywne podczas zbierania wysięku. Dlatego w niektórych przypadkach może być przydatne zbieranie przez różne okresy czasu. (4) Ponieważ metoda obejmowała wysięk do wody, nie jest możliwe bezwzględne określenie ilościowe związków.

Kroki krytyczne: Kluczem do skutecznego zastosowania tej metody jest zachowanie ostrożności podczas obchodzenia się z próbką, aby nie uszkodzić żadnych komórek, a także zastosowanie odpowiednich kontroli (patrz odnośnik ¹⁴). Jedną z odpowiednich kontroli jest pobieranie wysięków łyka bez wcześniejszego leczenia EDTA. W takim przypadku łyko uszczelni się i nie będzie można zebrać wysięku. W tym miejscu zostaną wykryte wszelkie związki zanieczyszczające pochodzące z uszkodzonych komórek. Drugą kontrolą byłaby analiza cukrów w wysięku. U rzodkiewnika sacharoza powinna być dominującym metabolitem w soku łyka, ze stosunkiem fruktozy do sacharozy między 1:4 a 1:8 (ref ^{8, 14}).

Do ekstrakcji RNA konieczne jest użycie inhibitora RNAzy. Ponadto pozytywna kontrola wcześniej opisanego mRNA zlokalizowanego w łyku (UBC9: Ubikwityna sprzęgająca enzym 9, At4g27960; ^{8, 14}) i wskazana jest negatywna kontrola np. mRNA chloroplastu (Rubisco LSU).

Ponieważ wysięk zawiera aktywne enzymy, zaleca się przebieg w czasie, aby upewnić się, że zmiany w profilu łyka nie są spowodowane po prostu zmianami w czasie zbierania. W niektórych przypadkach korzystne może być stosowanie inhibitorów proteinazy. Badacze muszą jednak pamiętać, że zebrany wysięk będzie skoncentrowany, a wszelkie dodane związki będą w dużej mierze skoncentrowane. Drugim krytycznym krokiem w ramach protokołu jest ponowne przecięcie ogonka liściowego w ramach EDTA. Ten etap służy dwóm celom: po pierwsze, usuwa wszelkie uszczelnione płytki sitowe, zapobiegając tworzeniu się nowych korków, umożliwiając w ten sposób swobodny przepływ soku łyka. Po drugie, usuwa pęcherzyki kawitacyjne w ksylemie powstające podczas cięcia, a tym samym umożliwia transport ksylemu. Wielkość drugiego cięcia zależy od użytych roślin. U roślin o większych ogonkach liściowych powinno to być kilka milimetrów (do 1 cm) powyżej pierwszego cięcia, u roślin takich jak Arabidopsis wystarczy 1-2 mm.

Zastosowanie tej metody może prowadzić do odkrycia nowych związków w wysiękach łyka, które mogą mieć implikacje sygnalizacyjne, rozwojowe lub biomedyczne. Skłoniło to do bardziej dogłębnego przyjrzenia się sygnalizacji lipidowej na duże odległości, która była mało zbadaną dziedziną w naukach o roślinach ze względu na brak dostępu do łyka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
K2-EDTA	Sigma-Aldrich	ED2P-500G
Płytka szklana lub plastikowa szalka Petriego (7-15 cm)	PYREX lub Corning		Każde czyste, płytkie naczynie będzie działać
Chloroform	EMD	CX1054-1	Tylko otwarte pojemniki w dygestoriach
	Metanol J.T.Baker	9070-03
Rurki z nakrętką	VWR International	53283-800
Rurki z nakrętką	Sun Sri	13-425
Rurki Eppendorf	Denville	C2170