Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

17K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51116

⸱

21 kwietnia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence

W tym artykule

Podsumowanie

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Streszczenie

Kardiomiocyty z chorych serc są poddawane złożonym procesom przebudowy, obejmującym zmiany w strukturze komórki, sprzężenie skurczu wzbudzenia i prądy jonów błonowych. Zmiany te mogą być odpowiedzialne za zwiększone ryzyko arytmogennej i zmian skurczowych prowadzących do dysfunkcji skurczowej i rozkurczowej u pacjentów kardiologicznych. Jednak większość informacji na temat zmian funkcji miocytów w chorobach serca pochodzi z modeli zwierzęcych.

Tutaj opisujemy i zatwierdzamy protokół izolacji żywotnych miocytów z małych próbek chirurgicznych mięśnia sercowego komorowego od pacjentów poddawanych operacjom kardiochirurgicznym. Protokół jest szczegółowo opisany. Przedstawiono elektrofizjologiczne i wewnątrzkomórkowe pomiary wapnia w celu wykazania wykonalności szeregu pomiarów pojedynczych komórek w ludzkich kardiomiocytach komorowych uzyskanych tą metodą.

Opisany tutaj protokół może być przydatny do przyszłych badań nad komórkowymi i molekularnymi podstawami funkcjonalnych zmian ludzkiego serca w obecności różnych chorób serca. Co więcej, metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji nowych celów terapeutycznych na poziomie komórkowym oraz do testowania skuteczności nowych związków na ludzkich kardiomiocytach o bezpośredniej wartości translacyjnej.

Wprowadzenie

Analiza właściwości elektrofizjologicznych mięśnia sercowego znacznie się rozwinęła po opracowaniu technik izolacji pojedynczych miocytów serca. Niedawne postępy w zrozumieniu sprzężenia skurczowego pobudzenia serca (EC-Coupling) stały się również możliwe dzięki możliwości izolowania żywotnych pojedynczych kardiomiocytów, które zachowują wszystkie fizjologiczne właściwości nienaruszonej tkanki. Metody zacisków krosowych są rutynowo stosowane do badania funkcji i farmakologicznej modulacji prądów jonowych sarkolemmalnych serca. Zapisy wewnątrzkomórkowej dynamiki wapnia z barwnikami wrażliwymi na Ca2 + są również regularnie wykonywane na pojedynczych miocytach serca z różnych zdrowych i chorych modeli, dostarczając istotnych danych na temat fizjologii sprzężenia EC, a także na temat patologicznych zmian wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca2 + prowadzących do upośledzenia mechanicznego i zwiększonego obciążenia arytmogennego w chorobach serca. Informacje z tych badań mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia elektrofizjologicznych i mechanicznych skutków leków w warunkach klinicznych. Istnieją jednak specyficzne dla gatunku różnice w prądach transbłonowych i białkach sprzęgających EC, które odpowiadają za specyficzne cechy potencjału czynnościowego serca i mechaniki serca. Tak więc, podczas gdy badania miocytów wyizolowanych od ssaków innych niż ludzie wyjaśniły właściwości biofizyczne i fizjologiczne role określonych transbłonowych kanałów jonowych i białek sprzęgających EC, niekoniecznie dostarczają odpowiednich modeli ludzkich miocytów sercowych. Izolacja żywotnych miocytów z ludzkiego mięśnia sercowego jest zatem niezbędna, aby w pełni zrozumieć patofizjologię chorób serca i zweryfikować nowatorskie podejścia terapeutyczne.

Ludzka tkanka przedsionkowa jest łatwo dostępna, ponieważ przydatki przedsionkowe są często odrzucane podczas zabiegów chirurgicznych. We wstępnych badaniach ilościowych potencjałów czynnościowych serca i prądów jonowych dorosłego człowieka wykorzystano enzymatycznie izolowane komórki przedsionkowe1-4. Zapisy potencjałów czynnościowych lub prądów z izolowanych dorosłych ludzkich komórek komorowych zostały następnie zgłoszone3,5-10. W większości tych badań wykorzystano komórki uzyskane z eksplantowanych serc i wykorzystano albo perfuzję kolagenazy odcinka tętnicy wieńcowej, albo ekspozycję stosunkowo dużych ilości wyciętej tkanki na kolagenazę w celu uzyskania izolowanych komórek. Badania te pozwoliły na szczegółową charakterystykę szeregu transbłonowych prądów jonowych z ludzkich kardiomiocytów komorowych ze zdrowych serc oraz od pacjentów z terminalną niewydolnością serca. Zgłoszono zapisy prądu Ca2+ typu L (ICa-L)5-7, przejściowego prądu potasowego wychodzącego (Ido)8, prądu potasowego prostownika wewnętrznego (Iκ1)8, różnych składników opóźnionego prądu potasowego prostownika (Iκ)9. Postępy i udoskonalenie proceduryizolacji10 pozwoliły na jasne scharakteryzowanie jonowych podstaw zwiększonego potencjału arytmogennego w terminalnej niewydolności serca, obejmującego wydłużenie potencjału czynnościowego11, opóźnione po depolaryzacjach12 i zwiększony prąd zabawny13 prowadzące do depolaryzacji rozkurczowej i przedwczesnych uderzeń.

Dorosłe miocyty serca są zwykle izolowane od małych zwierząt poprzez wsteczną perfuzję całego serca za pomocą różnych mieszanin enzymów, technika, która daje wysoką wydajność komórek tolerujących Ca2+ 14. Izolacja miocytów serca z fragmentów tkanki jest z natury mniej skuteczna, prawdopodobnie ze względu na ograniczony dostęp enzymów do poszczególnych miocytów w porównaniu z tym, który osiąga się przez perfuzję tętnic wieńcowych. Ze względu na bardzo ograniczoną dostępność niewykorzystanych serc dawców, jedynym praktycznym sposobem na regularne uzyskiwanie normalnych ludzkich komórek komorowych jest trawienie enzymatyczne często bardzo małych fragmentów tkanek wycinanych podczas planowych zabiegów chirurgicznych. Jedynym modelem choroby ludzkiej, który został dokładnie scharakteryzowany na poziomie komórkowym, jest nieuleczalna niewydolność serca, ze względu na dostępność do przeszczepionych serc. Jednak nieuleczalna niewydolność serca występuje u mniejszości pacjentów i często wiąże się z powszechną ścieżką ciężkiej przebudowy komórek mięśnia sercowego, która jest stosunkowo niezależna od podstawowej przyczyny15. Zdolność do oceny funkcji pojedynczych kardiomiocytów od pacjentów we wcześniejszym, niezawiłym stadium choroby ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia specyficznej patofizjologii różnych chorób dziedzicznych lub nabytych. Kardiomiopatia przerostowa (HCM) jest wymownym przykładem. HCM jest powszechną (1/500 osób) dziedziczną chorobą serca charakteryzującą się przerostem mięśnia sercowego, zwiększonym ryzykiem arytmogenności i zmianami skurczowymi spowodowanymi niedrożnością dróg odpływu i dysfunkcją rozkurczową16. Kardiomiocyty z serc HCM przechodzą złożone procesy przebudowy obejmujące zmiany w strukturze komórkowej (przerost, nieład miofibrylarny) i sprzężenie EC17. Jednak większość informacji na temat dysfunkcji miocytów w HCM pochodzi z transgenicznych modeli zwierzęcych. Ponieważ tylko mniejszość pacjentów z HCM ewoluuje w kierunku nieuleczalnej niewydolności serca i wymaga przeszczepu serca, serca HCM są bardzo rzadko dostępne do izolacji komórek standardowymi metodami. Jednak u co najmniej 30% pacjentów z HCM rozwijają się objawy obturacyjne z powodu masywnego przerostu przegrody zmieniającego przepływ krwi w drogach odpływu podczas skurczu (HCM)18. Najskuteczniejszą dostępną opcją terapeutyczną w celu złagodzenia niedrożności w HCM jest chirurgiczna miektomia przegrody nosowej: podczas tego zabiegu chirurgicznego część górnej przegrody jest usuwana o zmiennej wielkości z dostępu przezaortalnego. Ta część przerośniętej przegrody jest zatem dostępna do izolacji komórek ze świeżej tkanki.

Metoda izolacji ludzkich miocytów komorowych z pojedynczych, małych próbek z przezżylnej biopsji endomięśnia sercowego została wcześniej opracowana i opublikowana19. Wdrożyliśmy metodę izolacji pojedynczych miocytów przegrody od próbek mięśnia sercowego komorowego od pacjentów poddawanych zabiegom kardiochirurgicznym, w tym pacjentów z HCM poddawanych miektomii przegrody oraz pacjentów poddawanych zabiegom wymiany zastawki. Oprócz szczegółowego opisu protokołu izolacji przedstawiono reprezentatywne pomiary elektrofizjologiczne i fluorescencjiCa2+, wykazujące żywotność izolowanych miocytów komorowych człowieka oraz wykonalność badań patch clamp i wewnątrzkomórkowych Ca2+.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły eksperymentalne na tkance ludzkiej zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Szpitala Uniwersyteckiego Careggi (2006/0024713; odnowione w maju 2009). Każdy pacjent wyraził pisemną świadomą zgodę.

1. Przygotowanie rozwiązań i sprzętu

Rozwiązania są opisane w Tabeli 1. Uproszczony schemat blokowy procedury izolacji komórek znajduje się na rysunku 1.

powiedział: powiedział: Rozdział szt. szt. Rozdział T szt. szt.
RozwiązanieCpDbBaza wiedzyTbPSEB1EB2
Odczynnik (mM)KH2PO450
MgSO48Rozdział 1.25Rozdział 1.2Rozdział 1.2
HEPESY101010
adenozyna5
glukoza1401020101010
Mannitol100
tauryna102052020
Zawartość NaClRozdział 113136Rozdział 113Rozdział 113
KclRozdział 4.7Rozdział 855.425Rozdział 4.7Rozdział 4.7
MgCl2Rozdział 1.25
KH2PO40,6Rozdział 300,60,6
Na2HPO40,60,60,6
NaHCO3121212
KHCO3101010
Na-pirogronian444
BDM powiedział:101010
BHBA (Język BHBA)5
kwas bursztynowy5
EGTA (EGTA)0,5
K2-ATPcyfra arabska
kwas pirogronowy5
kreatyna5
KMES (Organizacja ZarządzaniaRozdział 115
Enzymy (U/ml)Kolagenaza typu VZ kolei 250Z kolei 250
Proteaza typu XXIV4
ph7,4 KOH7.3 NaOH7,1 KOH7.35 NaOH7,2 KOH7.3 NaOH7.3 NaOH

Tabela 1. Roztwory stosowane do pobierania próbek, izolacji komórek i charakterystyki funkcjonalnej miocytów. CP = roztwór kardioplegyczny; DB = bufor dysocjacyjny; KB = roztwór Krafta-Bruhe'a; TB = bufor tyrodowy; PS=roztwór do pipet; EB1 = bufor enzymatyczny 1; EB2 = bufor enzymatyczny 2.

  1. Przygotuj roztwór kardioplegiczny (CP). Roztwór CP można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
  2. Przygotować bufor dysocjacyjny (DB) wolny odCa2+. Roztwór ten należy zużyć w ciągu jednego dnia.
  3. Przygotuj roztwór Krafta-Bruhe'a (KB). Roztwór KB można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
  4. Przygotuj bufor tyrolski (TB) wolny od Ca2+. Roztwór ten należy zużyć w ciągu jednego dnia.
  5. Przed użyciem przefiltrować wszystkie roztwory za pomocą filtrów strzykawkowych.
  6. Przygotować urządzenie do wytrawiania (rysunek 2), pojemnik do skrobania wykonany z dwóch szczotek z elastomeru silikonowego, z których jedna obraca się za pomocą silnika elektrycznego. Urządzenie do wytrawiania jest wykonane na zamówienie. Szczegółowe informacje na temat urządzenia do wytrawiania znajdują się na rysunku 8; zdjęcia urządzenia znajdują się na rysunkach 2C i 2D. Umyj komorę na chusteczki 70% etanolem i wodą.

2. Pobieranie i przetwarzanie próbek mięśnia sercowego

  1. Wlać 40 ml roztworu kardiplegicznego (CP) do probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w lodzie w celu transportu próbki z sali operacyjnej do laboratorium izolacji komórek.
  2. Natychmiast po wycięciu należy pobrać próbkę mięśnia sercowego z sali operacyjnej, przemyć ją lodowatym roztworem CP i przechowywać w probówce. Użyć próbek wsierdzia wyciętych z górnej przegrody międzykomorowej podczas operacji na otwartym sercu, o wadze >100 mg.
  3. Szybko przenieś próbkę do obszaru laboratoryjnego; rozpocznij przetwarzanie próbki w ciągu 10 minut od wycięcia próbki.
  4. Trzymając próbkę w lodowatym buforze CP, ostrożnie usuń warstwę zwłóknienia wsierdzia za pomocą cienkich nożyczek pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie pokrój tkankę mięśnia sercowego na małe kawałki (o długości 2-3 mm). W zależności od wielkości próbki tkanki, należy wyciąć całkowitą ilość mięśnia sercowego komory od 100 mg do 1 g na każdą izolację.
  5. Po zakończeniu mielenia tkanek przenieś kawałki mięśnia sercowego do urządzenia do trawienia za pomocą czystego, lodowatego roztworu CP. Unikaj wypełniania całej objętości między dwiema silikonowymi szczoteczkami (3-4 ml) kawałkami mięśnia sercowego, używając nie więcej niż 1 g całkowitej tkanki.

3. Mycie i trawienie kawałków mięśnia sercowego

  1. Po przeniesieniu kawałków do komory skrobania urządzenia do wytrawiania, należy wymienić bufor CP w komorze na zimny bufor dysocjacyjny wolny od Ca2+ (DB).
  2. Umieść urządzenie do wytrawiania w łaźni termostatycznej, tak aby komora miała kontakt z podgrzaną wodą w kąpieli (rysunek 1). Ustawić kąpiel na 37,5 °C i włączyć ją, aby powoli podnosić temperaturę komory na chusteczki. Włącz silnik urządzenia do wytrawiania, ustawiając prędkość obrotową na 1 obrót/sekundę.
  3. Wykonaj 3 cykle płukania z DB, zmieniając roztwór w komorze z czystym DB co 8 minut. DB jest podgrzewany (37 °C) i nasycany tlenem przed kontaktem z fragmentami mięśnia sercowego.
  4. Przygotować bufor enzymatyczny 1 (EB1), dodając 250 U/ml kolagenazy typu V i 4 U/ml proteazy typu XXIV do roztworu DB. Przygotować bufor enzymatyczny 2 (EB2), dodając 250 j./ml kolagenazy typu V do roztworu DB. Rozgrzać (37 °C) i natlenić EB1 i EB2.
  5. Wykonać dwa 12-minutowe cykle wytrawiania w obrotowym urządzeniu do wytrawiania ze 100% natlenionym EB1 (w temperaturze 37 °C). W każdym cyklu należy użyć ~3 ml EB1. Usunąć roztwór przez aspirację pipetą i wyrzucić go po każdym cyklu.
  6. Przygotować 6 probówek o pojemności 15 ml do zbierania komórek i ~80 ml zimnego (4 °C) roztworu KB do elucji.
  7. Wykonać pierwszy 15-minutowy cykl trawienia z 3 ml 100% natlenionego EB2 w temperaturze 37 °C. Po cyklu trawienia zebrać roztwór zawierający pierwsze zdysocjowane miocyty w probówce o pojemności 15 ml i rozcieńczyć zawiesinę komórkową 12 ml zimnego roztworu KB. Przechowywać probówkę płasko w temperaturze pokojowej.
  8. Rozcieńczyć pozostały roztwór EB2 równą ilością DB w celu zmniejszenia o połowę stężenia kolagenazy V w następnych cyklach trawienia.
  9. Wykonać pozostałe 5 12-minutowych cykli trawienia z 3 ml EB2 w temperaturze 37 °C; po każdym z nich zebrać bufor zawierający miocyty w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i rozcieńczyć go 12 ml roztworu KB. Przechowuj probówki zawierające 6 ogniw w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

4. Ponowne zawieszenie komórek i readaptacja Ca2+

  1. Dodać 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 20 ml buforu tyrolskiego (TB) wolnego odCa2+. Przefiltruj roztwór.
  2. Odwirować sześć miocytów zawierających stożkowe rurki o masie 100 x g przez 5 minut, aby zmusić miocyty do osiadania. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w każdej probówce zmienną ilością (1-3 ml, w zależności od wydajności) BSA zawierającej gruźlicę w temperaturze pokojowej.
  3. Stopniowo zwiększaj stężenieCa2+ w komórce zawierającej bufor, dodając małe podwielokrotności 100 mmol/L roztworu CaCl2. W pierwszym i drugim etapie stężenie Ca2+ podnosi się odpowiednio do 50 μmol/L i 100 μmol/L. Następujące etapy dodawania Ca2+ wykonuje się co 5 minut, a stężenie zwiększa się o 100 μmol/L na każdym etapie do końcowego stężenia 0,9 mmol/L.
  4. Oceń wydajność procedury izolacji. Przenieść 0,5 ml roztworu zawierającego miocyty na szklaną dolną komorę mikroskopu. Oceń 15 pól mikroskopowych przy 10-krotnym powiększeniu obiektywu i oblicz procent zdrowych miocytów (np. komórki w kształcie pręcików z wyraźnymi prążkami i bez znaczących inkluzji, ryc. 2). Oczekiwany plon wynosi około 20 %.

5. Ocena funkcjonalna izolowanych kardiomiocytów.

Poniższy protokół jest przykładem oceny funkcjonalnej ludzkich kardiomiocytów, w tym jednoczesnych zapisów potencjałów czynnościowych i wewnątrzkomórkowych strumieni Ca2+.

  1. Przygotuj roztwór pipet (PS) do eksperymentów z zaciskiem krosowym w konfiguracji z perforowaną łatą. Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.
  2. Dodać 1,8 mmol/L CaCl2 do Ca2+-free Tyrode buffer (TB). Użyj tego roztworu do superfuzji kardiomiocytów podczas eksperymentów z klamrą łatową/fluorescencyjną.
  3. Przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 10 μmol/l Fluoforte i 10 μl koncentratu Powerload. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ustawić probówkę w pozycji pionowej i pozostawić komórkę na 5 minut, aby się uspokoiła; ponownie zawiesić komórki w Ca2+ zawierających gruźlicę.
  4. Przenieść 0,25 ml zawiesiny komórek do małej (0,5 ml), zamontowanej pod mikroskopem komory rejestracyjnej o kontrolowanej temperaturze, przelanej grawitacyjnie za pomocą podgrzewanego systemu mikroperfuzorów o natężeniu przepływu 0,3 ml/min (temperatura: 37 ± 0,5 °C).
  5. Za pomocą ściągacza do mikropipet przygotuj pipety typu patch clamp o średnicy końcówki od 3 do 5 μm i rezystancji od 3 do 4,5 m po napełnieniu PS.
  6. Dodać amfoterycynę B do partii PS (250 μg/ml) i użyć jej do wypełnienia elektrod.
  7. Wybierz komórkę w kształcie pręta z wyraźnymi prążkami, pozbawioną inkluzji, uformuj giga seal i odczekaj od 5 do 10 minut, aż rezystancja dostępu spadnie poniżej 20 MΩ.
  8. Uwolnij potencjały czynnościowe w aktualnym trybie cęgowym za pomocą krótkich impulsów (< 3 ms) przy różnych częstotliwościach stymulacji (0,2 Hz, 0,5 Hz i 1 Hz, 1 min przy każdej częstotliwości). Podczas fazy nagrywania włącz oświetlenie jasnego pola przy 492 ± 3 nm i wykryj fluorescencję Fluoforte przy 505-520 nm. Pozyskiwanie sygnałów fluorescencji i potencjału błonowego za pomocą oprogramowania Digidata 1440A i pClamp 10.0. W razie potrzeby powtórz sekwencję nagrywania wiele razy; Należy jednak utrzymać całkowity czas nagrywania poniżej 15 minut dla każdej komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisana powyżej metoda została zastosowana do charakterystyki nieprawidłowości funkcjonalnych kardiomiocytów wyizolowanych z przegrody międzykomorowej pacjentów z przerostową kardiomiopatią (HCM), którzy zostali poddani operacji miektomii, w porównaniu z pacjentami operacyjnymi bez niewydolności i przerostu serca21. Wyniki zawarte w tej sekcji pochodzą z tej pracy21 i są tu przedstawione jako przykład wykorzystania tej techniki do charakterystyki zmian w funkcji komórek mięśnia sercowego w stanach c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisaliśmy i zwalidowaliśmy metodę izolowania żywotnych miocytów z próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Opierając się na wcześniej opisanych protokołach, które z powodzeniem zastosowano do izolacji komórek z przedsionkowych próbek chirurgicznych, opracowano i dopracowano technikę umożliwiającą oddzielenie pojedynczych żywotnych miocytów od chorego mięśnia sercowego komorowego. Wczesne doniesienia wykazały, że izolacja pojedynczych kardiomiocytów z fragmentów tkanki przedsionkowej i komorowej sele...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez E.U. (STREP Project 241577 "BIG HEART", 7th European Framework Program, CP), Menarini International Operations Luxembourg (AM), Telethon GGP07133 (CP) i Gilead Sciences (AM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791
Siarczan magnezu siedmiowodny(MgSO4*7H2O)Sigma-AldrichM1880
HEPESSigma-AldrichH3375
AdenozynaSigma-AldrichA9251
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG8270
MannitolSigma-AldrichM4125
TaurynaSigma-AldrichT0625
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma-AldrichP5958
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9333
Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichS6297
Wodorowęglan potasu (KHCO3)Sigma-Aldrich237205
Pirogronian soduSigma-AldrichP2256
2,3-Butanodion monoximeSigma-AldrichB0753
Wodorotlenek sodu(NaOH)Sigma-AldrichS8045
L-sól monopotasowa kwasu glutaminowego jednowodnaSigma-Aldrich49601
Kwas pirogronowySigma-Aldrich107360
3-Kwas hydroksymasłowySigma-Aldrich166898
Sól dipotasowa 5&trifosforanu adenozyny dwuwodna (K2-ATP)Sigma-AldrichA8937
KreatynaSigma-AldrichC0780
Kwas bursztynowySigma-AldrichS3674
Bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowy kwas (EGTA)Sigma-AldrichE0396
Albumina z surowicy bydlęcejSigma-AldrichA0281
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Kolagenaza z Clostridium histolyticum, typ VSigma-AldrichC9263
Proteinaza, Bakteryjna, Typ XXIVSigma-AldrichP8038
Roztwór chlorku wapnia, ~1 M w H2OSigma-Aldrich21115
Chlorek wapnia 0,1 M roztwórSigma-Aldrich53704
Metanosulfonian potasuSigma-Aldrich83000
Odczynnik FluoForteEnzo Life SciencesENZ-52015
Koncentrat Powerload, 100XLife TechnologiesP10020
Perfuzja Fast-Step SystemWarnerInstruments VC-77SP
Amfoterycyna B rozpuszczonaSigma-AldrichA9528
Multiclamp 700B wzmacniacz patch-clampmolekularne
Digidata 1440AUrządzenia molekularne
pClamp10.0 molekularnego
NIESTANDARDOWENIESTANDARDOWEUrządzenie jest wykonane na zamówienie w naszym laboratorium przy użyciu plastikowych rurek, odlewanego Sylgarda i silnika; jest szczegółowo opisane na rysunku 1C-1D i na rysunku 7. Na życzenie możemy podać dalsze szczegóły.
Elastomer silikonowy do szczotek urządzenia do mineralizacjiDow CorningSYLGARD® 184
Silnik obrotowy o zmiennej prędkości obrotowej do urządzenia do mineralizacjiCrouzetCrouzet 178-4765
Forma do szczotek odlewniczychnie dotyczyNieForma jest wykonana na zamówienie ze standardowych prętów PTFE o średnicy 2,5 cm.
Urządzenia Urządzenie do trawienia dotyczy

Bibliografia

  1. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
  2. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells. Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).
  3. Harding, S. E., et al. Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes. Cardioscience. 1, 49-53 (1990).
  4. Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).
  5. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).
  6. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  7. Cohen, N. M., Lederer, W. J. Calcium current in single human cardiac myocytes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).
  8. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation Research. 73, 379-385 (1993).
  9. Virag, L., et al. The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes. Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).
  10. Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note. Cardioscience. 4, 111-116 (1993).
  11. Benitah, J. P., et al. Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).
  12. Verkerk, A. O., et al. Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts. Circulation. 104, 2728-2733 (2001).
  13. Cerbai, E., et al. Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart. Circulation. 95, 568-571 (1997).
  14. Kohncke, C., et al. Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
  15. Tomaselli, G. F., Marban, E. Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).
  16. Maron, B. J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).
  17. Olivotto, I., et al. The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).
  18. Maron, M. S., et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction. Circulation. 114, 2232-2239 (2006).
  19. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  20. Lippiat, J. D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).
  21. Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127, 575-584 (2013).
  22. Kuusisto, J., et al. Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 98, 1007-1013 (2012).
  23. Yan, G. X., et al. Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall. Circulation. 103, 2851-2856 (2001).
  24. Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods. The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).
  25. Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes. Circulation research. 78, 689-696 (1996).
  26. Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study. Circulation. 99, 2466-2474 (1999).
  27. Volders, P. G., et al. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation. 107, 2753-2760 (2003).
  28. Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action. Circulation Research. 68, 77-84 (1991).
  29. Coppini, R., et al. A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine. Circulation. 125, 1(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kardiomiocyt wmi sie sercowy kom rtrawienie enzymatycznerejestracja metod patch clamppomiar potencja u czynno ciowegoanaliza przej ciowego wzrostu st enia wapniaroztw r kardioplegicznyfrakcja naczyniowo stromalnazawiesina kom rkowa

Powiązane artykuły