Method Article

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

DOI:

10.3791/51116

⸱

April 21st, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiomiocyty z chorych serc są poddawane złożonym procesom przebudowy, obejmującym zmiany w strukturze komórki, sprzężenie skurczu wzbudzenia i prądy jonów błonowych. Zmiany te mogą być odpowiedzialne za zwiększone ryzyko arytmogennej i zmian skurczowych prowadzących do dysfunkcji skurczowej i rozkurczowej u pacjentów kardiologicznych. Jednak większość informacji na temat zmian funkcji miocytów w chorobach serca pochodzi z modeli zwierzęcych.

Tutaj opisujemy i zatwierdzamy protokół izolacji żywotnych miocytów z małych próbek chirurgicznych mięśnia sercowego komorowego od pacjentów poddawanych operacjom kardiochirurgicznym. Protokół jest szczegółowo opisany. Przedstawiono elektrofizjologiczne i wewnątrzkomórkowe pomiary wapnia w celu wykazania wykonalności szeregu pomiarów pojedynczych komórek w ludzkich kardiomiocytach komorowych uzyskanych tą metodą.

Opisany tutaj protokół może być przydatny do przyszłych badań nad komórkowymi i molekularnymi podstawami funkcjonalnych zmian ludzkiego serca w obecności różnych chorób serca. Co więcej, metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji nowych celów terapeutycznych na poziomie komórkowym oraz do testowania skuteczności nowych związków na ludzkich kardiomiocytach o bezpośredniej wartości translacyjnej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza właściwości elektrofizjologicznych mięśnia sercowego znacznie się rozwinęła po opracowaniu technik izolacji pojedynczych miocytów serca. Niedawne postępy w zrozumieniu sprzężenia skurczowego pobudzenia serca (EC-Coupling) stały się również możliwe dzięki możliwości izolowania żywotnych pojedynczych kardiomiocytów, które zachowują wszystkie fizjologiczne właściwości nienaruszonej tkanki. Metody zacisków krosowych są rutynowo stosowane do badania funkcji i farmakologicznej modulacji prądów jonowych sarkolemmalnych serca. Zapisy wewnątrzkomórkowej dynamiki wapnia z barwnikami wrażliwymi na Ca2 + są również regularnie wykonywane na pojedynczych miocytac....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły eksperymentalne na tkance ludzkiej zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Szpitala Uniwersyteckiego Careggi (2006/0024713; odnowione w maju 2009). Każdy pacjent wyraził pisemną świadomą zgodę.

1. Przygotowanie rozwiązań i sprzętu

Rozwiązania są opisane w Tabeli 1. Uproszczony schemat blokowy procedury izolacji komórek znajduje się na rysunku 1.

powiedział:
RozwiązanieCpDbBaza wiedzyTbPSEB1E....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda opisana powyżej została wykorzystana do scharakteryzowania funkcjonalnych nieprawidłowości kardiomiocytów wyizolowanych z przegrody międzykomorowej pacjentów z kardiomiopatią przerostową (HCM), którzy przeszli operację miektomii, w porównaniu z niezawiającymi pacjentami chirurgicznymi bez przerostu21. Wyniki zawarte w tej sekcji pochodzą z tej pracy21 i są pokazane tutaj jako przykład tego, jak ta technika może być wykorzystana do scharakteryzowania zmian funkcji komórek mięśnia sercowego w s.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy i zwalidowaliśmy metodę izolowania żywotnych miocytów z próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Opierając się na wcześniej opisanych protokołach, które z powodzeniem zastosowano do izolacji komórek z przedsionkowych próbek chirurgicznych, opracowano i dopracowano technikę umożliwiającą oddzielenie pojedynczych żywotnych miocytów od chorego mięśnia sercowego komorowego. Wczesne doniesienia wykazały, że izolacja pojedynczych kardiomiocytów z fragmentów tkanki przedsionkowej i komorowej sele.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez E.U. (STREP Project 241577 "BIG HEART", 7th European Framework Program, CP), Menarini International Operations Luxembourg (AM), Telethon GGP07133 (CP) i Gilead Sciences (AM).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791
Siarczan magnezu siedmiowodny(MgSO4*7H2O)Sigma-AldrichM1880
HEPESSigma-AldrichH3375
AdenozynaSigma-AldrichA9251
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG8270
MannitolSigma-AldrichM4125
TaurynaSigma-AldrichT0625
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma-AldrichP5958
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9333
Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichS6297
Wodorowęglan potasu (KHCO3)Sigma-Aldrich237205
Pirogronian soduSigma-AldrichP2256
2,3-Butanodion monoximeSigma-AldrichB0753
Wodorotlenek sodu(NaOH)Sigma-AldrichS8045
L-sól monopotasowa kwasu glutaminowego jednowodnaSigma-Aldrich49601
Kwas pirogronowySigma-Aldrich107360
3-Kwas hydroksymasłowySigma-Aldrich166898
Sól dipotasowa 5&trifosforanu adenozyny dwuwodna (K2-ATP)Sigma-AldrichA8937
KreatynaSigma-AldrichC0780
Kwas bursztynowySigma-AldrichS3674
Bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowy kwas (EGTA)Sigma-AldrichE0396
Albumina z surowicy bydlęcejSigma-AldrichA0281
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Kolagenaza z Clostridium histolyticum, typ VSigma-AldrichC9263
Proteinaza, Bakteryjna, Typ XXIVSigma-AldrichP8038
Roztwór chlorku wapnia, ~1 M w H2OSigma-Aldrich21115
Chlorek wapnia 0,1 M roztwórSigma-Aldrich53704
Metanosulfonian potasuSigma-Aldrich83000
Odczynnik FluoForteEnzo Life SciencesENZ-52015
Koncentrat Powerload, 100XLife TechnologiesP10020
Perfuzja Fast-Step SystemWarnerInstruments VC-77SP
Amfoterycyna B rozpuszczonaSigma-AldrichA9528
Multiclamp 700B wzmacniacz patch-clampmolekularne
Digidata 1440AUrządzenia molekularne
pClamp10.0 molekularnego
NIESTANDARDOWENIESTANDARDOWEUrządzenie jest wykonane na zamówienie w naszym laboratorium przy użyciu plastikowych rurek, odlewanego Sylgarda i silnika; jest szczegółowo opisane na rysunku 1C-1D i na rysunku 7. Na życzenie możemy podać dalsze szczegóły.
Elastomer silikonowy do szczotek urządzenia do mineralizacjiDow CorningSYLGARD® 184
Silnik obrotowy o zmiennej prędkości obrotowej do urządzenia do mineralizacjiCrouzetCrouzet 178-4765
Forma do szczotek odlewniczychnie dotyczyNieForma jest wykonana na zamówienie ze standardowych prętów PTFE o średnicy 2,5 cm.
Urządzenia Urządzenie do trawienia dotyczy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
  2. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Iso....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Ventricular CardiomyocytesCardiomyocyte IsolationVentricular MyocardiumEnzymatic DigestionPatch Clamp RecordingAction Potential MeasurementCalcium Transient AnalysisCardioplegic SolutionStromal Vascular FractionCell Suspension

Related Articles