Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Podsumowanie

Rozwój danio pręgowanego można obserwować przez wiele dni za pomocą mikroskopii z lekkim arkuszem, gdy zarodki są umieszczane w optycznie przezroczystych rurkach polimerowych z agarozą o niskim stężeniu.

Streszczenie

Mikroskopia z użyciem lekkich arkuszy jest idealną techniką obrazowania do badania rozwoju embrionalnego danio pręgowanego. Ze względu na minimalną fototoksyczność i wybielanie, nadaje się szczególnie do długotrwałego obrazowania poklatkowego przez wiele godzin do kilku dni. Potrzebna jest jednak odpowiednia strategia mocowania próbki, która zapewnia zarówno uwięzienie, jak i normalny rozwój próbki. Montaż wielowarstwowy, nowa technika osadzania wykorzystująca agarozę o niskim stężeniu w optycznie przezroczystych probówkach, pokonuje teraz to ograniczenie i uwalnia pełny potencjał mikroskopii arkuszowej światła w biologii rozwoju w czasie rzeczywistym.

Wprowadzenie

Aby zrozumieć złożone zdarzenia i interakcje zachodzące podczas embriogenezy, badania w biologii rozwoju coraz częściej przechodzą od mikroskopii pojedynczych komórek i organów do obrazowania in vivo całych organizmów. Tradycyjne techniki mikroskopowe zazwyczaj nie zapewniają rozdzielczości przestrzennej i czasowej niezbędnej do śledzenia szybkich zdarzeń przez długi czas, a często powodują blaknięcie (bleaching) lub efekty fototoksyczne w próbce¹. My oraz inni badacze uznaliśmy mikroskopię arkusza światła (Rycina 1) za idealną technikę do obrazowania in vivo danio pręgowanego^2-4. Oświetlenie próbki cienkim arkuszem światła laserowego, prostopadłym do osi detekcji, zapewnia szybkie sekcjonowanie optyczne z wysoką rozdzielczością przestrzenną oraz zminimalizowaną fototoksycznością⁵. Jednocześnie, ze względu na ten unikalny układ optyczny, tradycyjne techniki montowania próbek z wykorzystaniem szalek Petriego lub komór hodowlanych nie są odpowiednie. W typowym mikroskopie arkusza światła trzy silniki translacyjne i jeden silnik obrotowy utrzymują próbkę w taki sposób, aby można ją było precyzyjnie ustawić, obrócić i oglądać z dowolnego kierunku. W przeszłości preparaty do mikroskopii arkusza światła często zatapiano w 1-2% agarozie wewnątrz szklanej kapilary^6,7. W takim przypadku stwardniały cylinder agarozy z zatopionym preparatem jest wysuwany z kapilary szklanej do komory z próbką wypełnionej medium zbliżonym do wody w celu obrazowania. Agaroza ma współczynnik załamania światła zbliżony do wody, przez co doskonale nadaje się do mikroskopii arkusza światła in vivo, co ułatwia zastosowanie optyki oświetleniowej i detekcyjnej korygowanej do wody. Próbka jest unieruchomiona w sztywnej agarozie i może być dobrze obrazowana przez krótki czas, jednak zmiany morfogenetyczne i wzrost zarodka są silnie upośledzone podczas obrazowania trwającego kilka godzin^7,8. Chociaż opracowano rozwiązania dla innych zastosowań⁹, potencjał mikroskopii arkusza światła w zakresie nieinwazyjnego, długoterminowego obrazowania time-lapse danio pręgowanego nie może zostać w pełni wykorzystany przy zastosowaniu konwencjonalnego zatapiania w 1,5% agarozie.

Opracowaliśmy zatem nową strategię montażu dla mikroskopii arkusza światła in vivo embrionów ryb danio¹⁰. Próbkę montuje się w 0,1% agarozie z 200 mg/L trikainy wewnątrz rurki wykonanej z optycznie przezroczystego polimeru – perfluor乙ylenu propylenu (FEP). Osadzony embrion rozwija się prawidłowo dzięki niskiej lepkości medium. Jednocześnie rurka FEP ogranicza medium i próbkę przez cały czas trwania eksperymentu. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegółowy protokół nowej techniki montażu oraz prezentujemy dane odzwierciedlające jej zalety w porównaniu z konwencjonalnym protokołem. Wykazujemy, że dzięki naszej metodzie rozwój ryb danio może być obrazowany w sposób ciągły z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przez okres ponad dwóch dni.

Rysunek 1. Zasada działania mikroskopii arkusza światła. Danio pręgowany umieszczony w probówce wykonanej z fluorowanego etylenu propylenu (FEP) może być przesuwany i obracany w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu detekcyjnego. Cienka warstwa światła laserowego (arkusz światła) jest rzutowana przez obiektyw oświetlający w płaszczyznę ogniskową obiektywu detekcyjnego, oświetlając jedynie cienki przekrój optyczny preparatu. Emitowany sygnał fluorescencyjny jest zbierany przez obiektyw detekcyjny i rejestrowany na matrycy kamery.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów

1. Przygotowanie rurek FEP
   1. Oczyść rurkę FEP (Rysunek 2A), przepłukując ją cieczami (zgodnie z poniższymi krokami) za pomocą strzykawki z przymocowaną kaniulą tępą (Rysunek 2B). Uwaga 1: Przez cały czas trwania procedury należy używać rękawiczek. Uwaga 2: Zaleca się pocięcie rurki na odcinki o długości ok. 1 m i ich równoległe czyszczenie.
      1. Najpierw kilkakrotnie przepłucz rurkę 1 M NaOH. Następnie przenieś rurkę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej 0,5 M NaOH i poddaj działaniu ultradźwięków przez 10 min.
      2. Przenieś polimerową rurkę do małej kuwetki z ddH₂O. Przepłucz rurkę najpierw ddH₂O, a następnie 70% EtOH.
      3. Następnie przenieś rurkę FEP do nowej probówki wirówkowej z 70% EtOH. Ponownie poddaj tę probówkę działaniu ultradźwięków przez 10 min.
   2. Potnij oczyszczoną rurkę FEP na kawałki o długości około 3 cm (typowa długość stosowana do montażu i obrazowania danio pręgowanego) i w razie potrzeby je wyprostuj. Przechowuj oczyszczone rurki FEP w nowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej ddH₂O (Rysunek 2C).
2. Przygotowanie roztworu zapasowego trikainy
   1. Przygotuj 0,4% roztwór zapasowy trikainy, rozpuszczając 400 mg trikainy (MS-222) w 97,9 ml ddH₂O. Po całkowitym rozpuszczeniu proszku dostosuj pH do wartości 7,0, używając 2,1 ml 1 M Tris (pH 9,0). Chronić roztwór przed światłem. Alikwoty przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Przygotowanie 3% metylocelulozy
   1. Przygotuj 3% roztwór metylocelulozy do powlekania wewnętrznej rurek FEP zgodnie z poniższym opisem. Podgrzej E3¹¹ w szklanej butelce do temperatury około 60-70 °C i dodaj odpowiednią ilość proszku metylocelulozy. Dodaj mieszadło magnetyczne i mieszaj w temperaturze 4 °C. Gdy tylko roztwór ochłodzi się poniżej 30 °C, dodaj roztwór trikainy do stężenia końcowego 100 mg/L. Mieszać w temperaturze 4 °C przez noc.
4. Przygotowanie 1,5% i 0,1% agarozy w E3
   1. Rozpuść odpowiednią ilość agarozy niskotopliwej w określonej objętości E3 w kolbie szklanej. Podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej i od czasu do czasu wstrząsaj, aż roztwór agarozy stanie się jednorodny i nie będzie w nim widocznych kryształów.
   2. Przygotuj alikwoty 1 ml 0,1% roztworu agarozy w probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml. Alikwoty można przechowywać w temperaturze 4 °C.
   3. Użyj 1,5% roztworu do powlekania plastikowej szalki Petriego. Grubość warstwy agarozy powinna wynosić ok. 2 mm. Po zestaleniu agarozy dodaj na wierzch warstwy medium E3, aby zapobiec jej wysychaniu. Powleczoną szalkę można przechowywać w temperaturze 4 °C.
5. Przygotowanie danio pręgowanego
   1. Dorosłe osobniki i embriony danio pręgowanego (Danio rerio) utrzymuj w temperaturze 28,5 °C i traktuj zgodnie z ustalonymi protokołami^11,12.
   2. Po południu umieść ryby płci męskiej i żeńskiej w jednym zbiorniku i oddziel je przegrodą. Usuń przegrodę następnego ranka, aby kontrolować czas tarła ryb.
   3. Zbierz embriony do szalki wypełnionej E3 i obejrzyj je pod stereomikroskopem.
   4. W 24 hpf (lub w interesującym Cię stadium rozwoju) wybierz embriony danio pręgowanego wykazujące ekspresję fluorescencyjną i przenieś osobniki pozytywne do nowej szalki ze świeżym E3.
   5. Ostrożnie usuń otoczkę jaj z embrionów za pomocą dwóch ostrych pęset (Rysunki 2D i 2E). Pierwszą pęsetą chwyć i przytrzymaj otoczkę, a drugą rozetnij ją i oderwij. Uwaga 1: Krok ten należy wykonać przy użyciu stereomikroskopu.

2. Montowanie wielowarstwowe

1. Powlekanie rurki FEP
   1. Przymocuj kaniulę z tępym końcem do strzykawki. Ostrożnie wprowadź kaniulę na głębokość około 3 mm do jednego końca oczyszczonego i dociętego fragmentu rurki FEP (Rycina 2F oraz 2G). Uwaga 1: Należy używać rękawiczek i unikać zginania lub ściskania rurki.
   2. Zanurz wolny koniec rurki FEP w 3% metylocelulozie i wypełnij rurkę roztworem.
   3. Powoli usuń metylocelulozę, naciskając tłok strzykawki. Roztwór należy zutylizować.
   4. Powtórz kroki 2.1.2 i 2.1.3, używając E3. Uwaga 1: Powlekane rurki należy wykorzystać do montażu natychmiast.
2. Przenoszenie danio pręgowanego do agarozy
   1. Podgrzej jedną porcję 0,1% agarozy do 70°C w bloku grzewczym. Krótko wymieszaj probówkę reakcyjną w wirówce typu vortex i przenieś ją do bloku grzewczego ustawionego na 38 °C (Rycina 2H).
   2. Wyjmij probówkę reakcyjną z bloku grzewczego i pozostaw ją na chwilę do schłodzenia. Dodaj trikainę do stężenia końcowego 133-200 mg/L i ponownie wymieszaj w vortexie (Rycina 2I).
   3. Wybierz jeden z zdechorionowanych embrionów danio pręgowanego i za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś go do probówki reakcyjnej z podgrzaną 0,1% agarozą (Ryciny 2J oraz 2K). Uwaga 1: Staraj się przenieść jak najmniejszą ilość dodatkowego E3.
3. Montaż danio pręgowanego
   1. Pobierz embrion za pomocą rurki FEP przymocowanej do strzykawki (Rycina 2L). Rurka powinna być całkowicie wypełniona 0,1% agarozą, a embrion powinien znajdować się blisko jednego z końców rurki, z głową skierowaną w stronę otworu rurki. Uwaga 1: Pamiętaj, aby pobrać trochę agarozy przed pobraniem ryby. Uwaga 2: Ciągnij tłok strzykawki bardzo delikatnie, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Uwaga 3: Trzymaj rurkę w orientacji poziomej, aby uniknąć wycieku jej zawartości (Ryciny 2M oraz 2N).
4. Zatykanie rurki
   
   
   Rycina 2. Wielowarstwowy montaż embrionów danio pręgowanego. A) Rurki z fluoetylenopolipropylenu (FEP) na szpuli przed przygotowaniem. B) Strzykawka z przymocowaną kaniulą z tępym końcem. C) Oczyszczona i docięta rurka FEP. D, E) Dechorionacja embrionów danio pręgowanego w 24 hpf. F) Mocowanie rurki do kaniuli z tępym końcem. G) Strzykawka z przymocowaną kaniulą i rurką. H) Porcja 0,1% agarozy w probówce reakcyjnej podczas przenoszenia do bloku grzewczego. I) Mieszanie roztopionej agarozy w vortexie. J) Pobieranie zdechorionowanego embrionu za pomocą szklanej pipety. K) Przenoszenie embrionu do roztopionej agarozy. L) Pobieranie embrionu wraz z otaczającą go agarozą do rurki FEP. M, N) Embrion danio pręgowanego wewnątrz rurki FEP. O) Odcinanie rurki pomiędzy preparatem a kaniulą. P) Zatykanie rurki za pomocą szalki powlekanej agarozą. Q) Embrion wewnątrz zatkanej rurki. R) Końcowe przygotowanie próbki w uchwycie metalowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony obraz.
   
   1. Użyj żyletki, aby odciąć rurkę od kaniuli (Rycina 2O).
   2. Powoli wsuń koniec rurki zawierający rybę przez całą warstwę 1,5% agarozy w plastikowej szalce, aby zatkać rurkę (Rycina 2P). Uwaga 1: Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza i staraj się uzyskać prostą powierzchnię korka, trzymając rurkę dokładnie prostopadle do powierzchni agarozy. Uwaga 2: Lekko obróć rurkę, aby uzyskać szczelny korek.
   3. Przechowuj zamontowany preparat w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml z E3, aby zapobiec wysychaniu. Próbka jest teraz gotowa do obrazowania. Przed obrazowaniem sprawdź, czy ryba znajduje się bezpośrednio nad korkiem (Ryciny 2Q oraz 2R). Pamiętaj, aby dodać trikainę do medium w komorze obrazującej w tym samym stężeniu, co w medium montażowym.

Wyniki

Wielodniowe obrazowanie rozwoju układu naczyniowego danio pręgowanego

Wykorzystujemy 1-dniowe (1 dpf) danio pręgowane Tg(kdrl:GFP)¹³, aby zademonstrować zalety strategii montażu wielowarstwowego w długoterminowej mikroskopii arkusza światła. Celem jest obrazowanie rozwoju naczyń krwionośnych w całym organizmie danio pręgowanego w ciągu 2 dni. Zarodek danio pręgowanego zamocowano w 0,1% agarozie wewnątrz polimerowej rurki powleczonej metylocelulozą. W tym układzie danio pręgowany nie jest ograniczany przez medium montażowe i może rozwijać się normalnie. Głowa unosi się, ogon wydłuża, a kiełkowanie naczyń krwionośnych przebiega bez przeszkód (Rycina 3).

Rycina 3. Wielodniowe obrazowanie rozwoju układu naczyniowego danio pręgowanego. Układ naczyniowy danio pręgowanego linii Tg(kdrl:GFP) ¹³ w wieku 1 dpf, zamontowanego w wielowarstwowym preparacie, rozwija się bez zakłóceń w mikroskopie arkusza światła w ciągu dwóch dni. Fluorescencja była wzbudzana arkuszem światła lasera o długości fali 488 nm, a sygnał wykrywano za pomocą obiektywu 10X/0.3 W i kamery EMCCD. Serie obrazów Z (Z-stacks) pozyskiwano w czterech sąsiednich pozycjach co 10 min, a następnie łączono za pomocą oprogramowania Fiji ¹⁵. Przedstawiono projekcje maksymalnej intensywności dla wybranych punktów czasowych. Pasek skali: 500 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Obrazowanie wczesnego embrionogenezy danio pręgowanego

W niniejszej pracy demonstrujemy możliwość wykorzystania probówek z FEP jako podłoża montażowego w mikroskopii arkusza światła do badania wczesnej embriogenezy danio pręgowanego w ciągu pierwszej doby po zapłodnieniu. Zarodek danio pręgowanego Tg(H2A:GFP)¹⁴ w 8 hpf zamontowano wraz z nienaruszoną otoczką w probówce wypełnionej medium E3 o średnicy wewnętrznej 1 mm. Powoduje to niewielki ucisk otoczki. Wszystkie procesy rozwojowe podczas embriogenezy nie są zaburzone przez sposób montażu i mogą być optymalnie wizualizowane za pomocą mikroskopii arkusza światła. W tym przykładzie obrazowano preparat przez okres 12 h (Rycina 4). Typowe zmiany kształtu podczas wczesnej embriogenezy, takie jak zwiększone wydłużenie żółtka i pogrubienie tkanki wzdłuż linii środkowej, zostałyby stłumione przy zastosowaniu tradycyjnego montażu bez otoczki w 1,5% agarozie.

Rycina 4. Obrazowanie wczesnej embriogenezy danio pręgowanego. Ryba danio pręgowany Tg(H2A:GFP)¹⁴ przechodzi przez wczesną embriogenezę. Arkusz światła lasera 488 nm wzbudzał GFP, a sygnał fluorescencyjny był wykrywany za pomocą obiektywu 10X/0,3 W i kamery EMCCD. Serie obrazów Z (Z-stacks) pod dwoma kątami były pozyskiwane co 3 min przez okres 12 hr. Przedstawiono znormalizowane maksymalne projekcje intensywności dla wybranego fragmentu sekwencji time-lapse. Widoczne rozmycie ruchu w 19 hpf wynika z drgań embrionu podczas akwizycji, ponieważ nie stosowano środków znieczulających. Pasek skali: 150 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

Zaawansowane techniki mikroskopowe, takie jak mikroskopia arkuszowa światła, umożliwiają nam rejestrowanie danych obrazowych z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w ciągu kilku dni, ale wymagają również poprawy technik mocowania próbek. Przedstawiamy szczegółowy protokół wielowarstwowego montażu do mikroskopii arkuszowej światła rozwoju danio pręgowanego. Metoda jest prosta do wdrożenia i używamy jej w naszym laboratorium na co dzień.

Rury FEP

Kluczowym elementem naszej strategii montażu są rury wykonane z polimeru Fluorowany Etylen Propylen (FEP). Zdecydowaliśmy się na użycie FEP przede wszystkim ze względu na jego współczynnik załamania światła wynoszący 1,338, który jest podobny do wody i dlatego idealnie nadaje się do lekkiej mikroskopii arkuszowej z obiektywami zanurzającymi w wodzie i próbkami wymagającymi mediów wodnych. Rurki o średnicy wewnętrznej 0,8 mm i grubości ścianki 0,4 mm bardzo dobrze pasują do rozwijającego się danio pręgowanego, mogą być używane z typowymi uchwytami na próbki przystosowanymi do kapilar 1,6 mm i są naszym pierwszym wyborem dla prezentowanej metody montażu. Przetestowaliśmy je dokładnie w naszych domowych konfiguracjach, a także w komercyjnym systemie "Lightsheet Z.1" firmy Carl Zeiss Microscopy i stwierdziliśmy, że lampy FEP zapewniają długoterminową stabilność, mają tylko minimalny wpływ na wydajność optyczną i są niefluorescencyjne¹⁰. Nie nadają się jednak do zastosowań z próbkami, które wymagają innego współczynnika załamania światła, np. oczyszczoną próbką.

Tuby i folie wykonane z FEP są dostępne w różnych średnicach i grubościach. Ponadto FEP może być topiony w temperaturze 260 °C, co daje praktycznie nieskończone możliwości montażu niestandardowych podpór do próbek. Rurki polimerowe są zwykle dostarczane w stanie niesterylnym, dlatego protokół czyszczenia obejmuje kilka kroków w celu zapewnienia najlepszej jakości optycznej. Powłoka metylocelulozą zapewnia, że żadna część rosnącego zarodka danio pręgowanego nie przykleja się do polimeru.

Medium montażowe

Decyzja o zastosowaniu 0,1% agarozy opiera się na szeroko zakrojonych testach tempa wzrostu i bezruchu w różnych stężeniach agarozy i metylocelulozy¹⁰. Stężenia agarozy powyżej 0,1% wykazały już poważny wpływ na tempo wzrostu danio pręgowanego o wartości 24 hpf. Dodatkowo stosujemy niskie dawki leku znieczulającego Trikaina. Trikaina blokuje potencjały czynnościowe, hamując w ten sposób przekazywanie sygnałów między mózgiem a mięśniami i hamując skurcze mięśni¹⁶. Stężenie 133-200 mg/L zapewnia wystarczające unieruchomienie danio pręgowanego w zakresie 24-72 hpf. Jednak Trikaina i inne testowane przez nas leki znieczulające wykazują skutki uboczne zależne od dawki, takie jak obrzęk serca. Dodatkowo wymagana dawka Trikainy różni się w zależności od etapu rozwoju zarodka. Dlatego zalecamy zmniejszenie stężenia trikainy do ilości potrzebnej do zobrazowanych etapów rozwojowych. W celu zapewnienia najlepszej wydajności i zapobieżenia tworzeniu się toksycznych produktów ubocznych należy stosować świeżo przygotowany lub rozmrożony roztwór podstawowy trikainy, chroniony przed światłem i nie podgrzewany powyżej 30 °C.

Osadzenie w rurach FEP pozwala również na łatwą modyfikację medium montażowego w celu uwzględnienia konkretnych potrzeb. Do obrazowania poklatkowego serca zalecamy użycie 3% metylocelulozy i 100 mg/L trikainy zamiast 0,1% agarozy i 200 mg/L do montażu. Metyloceluloza jest bardziej lepka niż 0,1% agarozy, dzięki czemu sama w sobie zapewnia większy unieruchomienie i potrzeba mniej trikainy, aby zapewnić uwięzienie zarodka.

Trikaina jest wrażliwa na temperatury powyżej 30 °C i może być również rozcieńczana przez pożywkę w komorze obrazowania, co prowadzi do zmniejszenia wydajności i możliwego drgania zarodka. Dlatego należy upewnić się, że Trikaine jest używana również w podłożu obrazowym, w którym zanurzona jest zamontowana próbka. Jeśli twoje eksperymenty wymagają użycia wyższych temperatur, zalecamy ciągłą wymianę pożywki w komorze obrazowania za pomocą systemu perfuzyjnego lub ręcznie za pomocą rurki i strzykawki między dwoma punktami czasowymi.

Kroki krytyczne

Krytycznymi etapami procesu mocowania próbki jest wprowadzenie próbki do probówki i włożenie korka agarozowego. Wlot określa początkową pozycję zarodka, której późniejsza zmiana jest kłopotliwa. Powinno być dostępnych wiele próbek do zamontowania, a jakość montażu powinna być monitorowana za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Jeśli orientacja próbki nie jest zadowalająca, pomocna może być zmiana szybkości pobierania próbki i unikanie kolejnych ruchów tłoka, ponieważ często powoduje to skręcenie zarodka. Korek 1,5% agarozy jest niezbędny, aby uniknąć wycieku 0,1% agarozy. Powierzchnia korka wewnątrz rurki powinna być płaska, aby nie wpływać na orientację próbki podczas wywoływania. Aby uzyskać dobrą powierzchnię, należy przetestować różne grubości warstw agarozy, a rurkę należy umieścić w agarozie normalnie do powierzchni. Obracając nieco rurkę i wyciągając rurkę, ostrożnie wyjmuje się korek z naczynia. Jakość montażu należy sprawdzić za pomocą mikroskopu stereoskopowego przed obrazowaniem.

Obrazowanie wielowidokowe

Jedną z głównych zalet mikroskopii arkuszy świetlnych jest obrazowanie wielowidokowe, możliwość obracania próbki, pozyskiwania stosów z wielu kątów, a następnie ich rejestracji i łączenia. Uznaną metodą rejestracji stosów z w przestrzeni 3D jest rejestracja oparta na koralikach przy użyciu koralików fluorescencyjnych otaczających próbkę jako znaczników powierniczych ¹⁷. Metoda ta opiera się jednak na solidnym medium mocującym, takim jak 1,5% agarozy, a zatem wydaje się być niekompatybilna z przedstawionym tutaj mocowaniem wielowarstwowym. Ale kilka alternatywnych rozwiązań działa w zależności od aplikacji. Po pierwsze, koraliki fluorescencyjne mogą zostać włączone do korka agarozowego, który musi znajdować się w polu widzenia podczas akwizycji. Po drugie, pozycje stolika można skalibrować przed właściwymi eksperymentami za pomocą 1,5% kolumny agarozowej z koralikami fluorescencyjnymi. Po trzecie, alternatywne markery, takie jak jądra fluorescencyjne, mogą być używane do identyfikacji położenia stosów z względem siebie.

Parowanie

Typowe zestawy mikroskopii arkuszowej wykorzystują otwartą komorę na próbkę, co nieuchronnie prowadzi do odparowania pożywki. Ponieważ podłoże ma zasadnicze znaczenie dla przetrwania próbki, ograniczenia parowania medium montażowego i prawidłowego współczynnika załamania światła między optyką a próbką, zalecamy podjęcie co najmniej jednego z poniższych środków w celu zapobieżenia parowaniu. Po pierwsze, medium w komorze może być stale wymieniane przez system perfuzyjny. Po drugie, podłoże można ponownie napełnić ręcznie. Po trzecie, komorę można przykryć pokrywką lub elastyczną folią.

Zaopatrzenie w tlen

Polimer FEP został opracowany tak, aby był odporny na wiele różnych chemikaliów, a zatem jest wytrzymały, chemicznie obojętny i nieprzepuszczalny dla gazów. W przypadku montażu wielowarstwowego tlen może przenikać tylko przez korek agarozowy i granicę faz agaroza-powietrze, ale pozostaje do pokazania, czy dopływ tlenu w montażu wielowarstwowym jest znacznie niższy w porównaniu z montażem w 1,5% agarozie bez podtrzymującej rurki polimerowej. Jednakże, ponieważ montaż w 1,5% agarozie może być używany tylko przez około dwie godziny, zanim morfologia danio pręgowanego zostanie naruszona, montaż wielowarstwowy wydaje się być ogólnie lepszym rozwiązaniem dla długoterminowego obrazowania.

Obrazowanie na wcześniejszych etapach rozwoju

Montaż wielowarstwowy stał się obecnie naszą standardową techniką osadzania w poklatkowej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego o mocy powyżej 24 hpf. Oprócz tego używamy również probówek polimerowych do obrazowania zarodków we wczesnym stadium rozwoju. Zarodki pozostają w swoich kosmówkach i są umieszczane w probówce FEP o średnicy wewnętrznej 1 mm i wypełnione E3. Danio pręgowany może swobodnie rozwijać się wewnątrz kosmówki i nadal może być dobrze zobrazowany za pomocą mikroskopii świetlnej.

Programu outlook

Prezentowane wielowarstwowe mocowanie próbek uwalnia pełny potencjał mikroskopii arkuszowej światła do biologii rozwojowej danio pręgowanego w czasie rzeczywistym. Można go łatwo zastosować w innych technikach mikroskopowych, takich jak optyczna tomografia projekcyjna (OPT) i inne organizmy. Wierzymy, że tuby FEP o standardowych rozmiarach to dopiero pierwszy krok w kierunku przykładowych technik montażu dostosowanych do konkretnych potrzeb.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurki z fluorowanym etylenem i propylenem (FEP)	Bola	S 1815-04	0,8/1,6 mm średnica wewnętrzna/zewnętrzna, dostępne inne rozmiary
Strzykawka Omnifix-F Solo 1 ml	B. Jednorazowa kaniula Braun Melsungen AG	9161406 V
Sterican,	B. Braun Melsungen AG	9180109	0,8 mm x 22 mm, dostępne inne rozmiary, średnica zewnętrzna kaniuli musi pasować do wewnętrznej średnicy rurki
FEP50 ml Polipropylenowa probówka wirówkowa	Corning	430829
1 M NaOH
0,5 M NaOH
70% EtOH
Metyloceluloza	Sigma	M0387	dostarczana w postaci proszku
Pożywka E3 (dla zarodków danio pręgowanego)
1,5 ml Probówka reakcyjna	Eppendorf	3810X
Agaroza, niska temperatura żelowania	Sigma	A9414	dostarczana w postaci proszku
Szalka	PetriegoGreiner	633180	tworzywo sztuczne, 94 mm x 16 mm
Tricaine	Sigma	E10521	synonimy:  3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian, MS-222, TS 222, metanosulfonian trikainy
Obiektyw mikroskopowy 10x/0,3 W Leica		HCX APO L
EMCCD Kamera	Andor Technology	iXon 885 EMCCD