Method Article

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

DOI:

10.3791/51138

⸱

February 5th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatric Neurology, Department of Pediatrics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Neurobiology and Anatomy, University of Utah School of Medicine, 3Interdepartmental Program in Neurosciences, University of Utah School of Medicine, 4Mutation Generation and Detection Core, HSC Core Research Facility, University of Utah School of Medicine, 5Department of Neurology, University of Utah School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany to potężny system modelowania kręgowców do badania rozwoju, modelowania chorób i przeprowadzania badań przesiewowych leków. Ostatnio wprowadzono różnorodne narzędzia genetyczne, w tym wiele strategii wywoływania mutacji i generowania linii transgenicznych. Jednak badania przesiewowe na dużą skalę są ograniczone tradycyjnymi metodami genotypowania, które są czasochłonne i pracochłonne. W tym miejscu opisujemy technikę analizy genotypów danio pręgowanego za pomocą PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA). To podejście jest szybkie, czułe i niedrogie, z mniejszym ryzykiem artefaktów skażenia. Genotypowanie metodą PCR z HRMA może być stosowane w przypadku zarodków lub dorosłych ryb, w tym w wysokoprzepustowych protokołach przesiewowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio rerio) to system modelowania kręgowców szeroko stosowany do badań nad rozwojem i modelowaniem chorób. W ostatnim czasie opracowano liczne technologie transgeniczne i mutacyjne dla danio pręgowanego. Techniki szybkiej transgenezy, zwykle oparte na systemie transpozonów Tol21, zostały połączone z ulepszonymi opcjami klonowania w celu składania wielu fragmentów DNA2. Nukleazy palców cynkowych (ZFN) i nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) zostały wykorzystane do celowania w loci zarówno w komórkach somatycznych, jak i rozrodczych u danio pręgowanego3,4. Techniki te mogą skutecznie generować genetycznie modyfikowane zwierzęta, z powstawaniem mutacji o wysokiej częstotliwości i przenoszeniem w linii zarodkowej3,4.

Pomimo tych postępów, tradycyjne techniki genotypowania u danio pręgowanego ograniczają pełną moc narzędzi do mutagenezy i transgenezy. PCR, po którym następuje elektroforeza żelowa, czasami połączona z trawieniem enzymem restrykcyjnym, jest szeroko stosowana do wykrywania modyfikacji genomu, ale jest czasochłonna i mniej wrażliwa na identyfikację małych insercji lub delecji. Testy sondami TaqMan wiążą się z wysokimi kosztami początkowymi i wymagają starannej optymalizacji. Sekwencjonowanie produktów PCR może trwać kilka dni i nie jest praktyczne w przypadku badań przesiewowych na dużą skalę. Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) może dyskryminować SNP wpływające tylko na ograniczony zakres miejsc rozpoznawania enzymów restrykcyjnych.

Analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA), metoda analizy post-PCR w zamkniętej probówce, to niedawno opracowana metoda, która jest szybka, czuła, tania i podatna na badania przesiewowe dużej liczby próbek. HRMA może być używana do wykrywania SNP, mutacji i transgenów5-7. HRMA opiera się na denaturacji termicznej dwuniciowych DNA, a każdy amplikon PCR ma unikalną charakterystykę dysocjacji (stopienia)5. Próbki można rozróżnić ze względu na ich różny skład nukleotydowy, zawartość GC lub długość, zwykle w połączeniu z barwnikiem fluorescencyjnym, który wiąże tylko dwuniciowe DNA8. W ten sposób HRMA może rozróżniać różne genotypy w oparciu o różne charakterystyki krzywej topnienia. Ponieważ HRMA wykorzystuje tanie odczynniki i jest jednoetapowym procesem post-PCR, może być stosowany w strategiach o wysokiej przepustowości. HRMA jest nieniszczący, więc po analizie amplikony PCR mogą być wykorzystane do innych zastosowań. HRMA została zastosowana w wielu organizmach i systemach, w tym na liniach komórkowych, myszach i ludziach9-11. Jego zastosowanie zostało niedawno opisane u danio pręgowanego do wykrywania mutacji indukowanych przez nukleazy palca cynkowego (ZFN) iTALENy 6,12,13.

W tym artykule opisujemy, jak przeprowadzić HRMA na podstawie PCR u embrionalnego i dorosłego danio pręgowanego (Rysunek 1). Protokół ten jest odpowiedni do wykrywania SNP, transgenów i mutacji, w tym zmian pojedynczej pary zasad, insercji lub delecji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie DNA

  1. Przygotuj bufor do lizy DNA: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Dodać świeżą proteinazę K do końcowego stężenia 1 mg/ml w dniu użycia12.
  2. Pobieranie tkanek:
    1. Dla klipsa na płetwy dorosłej ryby:
      1. Znieczulenie ryby: Umieść rybę w 0,004% roztworze MS-222 (trikainy). Poczekaj, aż ruch skrzeli zwolni.
      2. Połóż rybę na stosie 5-10 chusteczek Kimwipes i odetnij mały kawałek płetwy ogonowej, około 2-3 mm, sterylną żyletką.
      3. Szybko umieść rybę w oznakowanym zbiorniku ze świeżą wodą w celu odzyskania zdrowia; ostrożnie oznacz zarówno zbiornik, jak i odpowiednią rurkę, która będzie zawierać klips płetwowy. Zmieniaj wodę i karm ryby co drugi dzień.
      4. Podnieś zacisk płetwy ze sterylną końcówką pipety i przenieś go do probówki wypełnionej 100 μl buforu do lizy DNA.
      5. Wyrzuć końcówkę pipety, a żyletkę wyrzuć do pojemnika na ostre przedmioty.
    2. W przypadku klipsa na ogon zarodka:
      1. Umieścić zarodki w 0,004% roztworze MS-222 (trikainy). Poczekaj 2 min.
      2. Wytnij kawałek ogona kleszczami pod mikroskopem preparacyjnym.
      3. Umieść ogon w oznakowanej probówce wypełnionej 30 μl buforem do lizy DNA.
      4. Szybko umieść zarodek w probówce zawierającej 100 μl 4% paraformaldehydu.
      5. Oznaczyć probówki z zarodkami i odpowiadającymi im rurkami ogonowymi.
      6. Probówki z zarodkami przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia.
      7. Oczyść kleszcze za pomocą wody Milli-Q i chusteczek Kimwipes między każdym zarodkiem, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
    3. Dla całych zarodków:
      1. Umieścić zarodki w 0,004% roztworze MS-222 (trikainy). Poczekaj 2 min.
      2. Umieść 1-5 zarodków w probówce wypełnionej 100 μl buforu do lizy DNA. Dechorionacja nie jest konieczna.
  3. Trawienie DNA
    Inkubować probówki z tkankami (klipsami do płetw lub ogona lub zarodków) w temperaturze 55 °C przez 4 godziny do nocy12.
  4. Dezaktywuj proteinazę K
    Podgrzewaj rurki do 95 °C przez 15 min12. DNA należy natychmiast wykorzystać do PCR lub przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.

2. PCR

  1. Projektuj podkłady ręcznie lub za pomocą oprogramowania do projektowania podkładów (np. Lightscanner Primer Design Software - Biofire). Produkty PCR dla HRMA mają zwykle 50-200 pz; Produkty PCR do wykrywania SNP powinny być mniejsze, zwykle 50-80 pz.
  2. Metoda PCR
    1. Przeprowadź reakcję PCR na płytce 96-dołkowej lub 384-dołkowej.
    2. Użyj 10 μl całkowitej objętości: 4 μl MasterScanner master mix (0,1 U polimerazy Taq-AB na gorąco, bufor, 0,2 mM dNTP, 2 mM chlorku magnezu i 1x fluorescencyjny dwuniciowy barwnik wiążący DNA); 5 pmol każdy starter i 1 μl genomowego DNA matrycy wyekstrahowanej z dorosłej płetwy ogonowej lub 3 μl genomowego DNA z embrionalnego ogona13.
    3. Przykryj próbki 30 μl oleju mineralnego.
    4. Przykryj płytkę optycznie przezroczystą uszczelką samoprzylepną.
    5. Zoptymalizuj warunki cykliczne PCR - typowe warunki to 95 °C przez 5 minut i 30 cykli po 10 sekund w temperaturze 95 °C, 25 sekund w temperaturze 60 °C, 30 sekund w temperaturze 72 °C, kończące się 95 °C przez 30 sekund i schłodzone do 15 °C.
    6. Przechowywać płytki PCR w temperaturze 4 °C lub kontynuować bezpośrednio do HRMA.
    7. Potwierdź nasz produkt PCR poprzez analizę jego wielkości za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym podczas wstępnej optymalizacji PCR; a jeśli jest to wskazane, przez sekwencjonowanie produktu PCR.

3. HRMA

  1. Płyty grzewcze
    1. Umieść płytkę w systemie analizy stopu.
    2. Otwórz oprogramowanie (LightScanner Software Call-IT 2.0).
    3. Płyty grzewcze od 60-95 °C.
    4. Utwórz nowy plik przechowywania danych.
  2. Analizuj dane HRMA (rysunek 2).
    Możliwych jest wiele etapów analizy. Pokazujemy najczęściej używany zestaw manipulacji danymi.
    1. Ustawienie podzbioru
      Kliknij kartę Podzestaw. Wybierz studzienki z próbkami.
    2. normalizacja
      1. Wybierz kartę Normalizuj w lewym panelu. Aby wyeliminować wariancję fluorescencji, należy ręcznie ustawić równoległą podwójną linię w obszarach przed (początkowym) i po (końcowym) stopieniu, jak pokazano (rysunek 2C, groty strzałek) i znormalizować sygnały fluorescencji przed i po stopieniu wszystkich próbek odpowiednio do 1 i 0,14.
      2. Dostosuj położenie linii tak, aby obszar stopienia znajdował się w obszarze między liniami przed i po stopieniu, ale nie był zaznaczony. Ogólnie rzecz biorąc, linie temperatury Dolne Min i Dolne Max (oraz Górne Min i Górne Max) powinny być oddalone od siebie o około 1 °C.
      3. Wybierz pozycje temperatury do normalizacji w taki sposób, aby wszystkie próbki miały maksymalną lub pełną (100%) fluorescencję dla obszaru przed topnieniem i minimalną lub żadną (0%) fluorescencję dla obszaru po stopieniu (tak dobrze, jak to możliwe). Normalizacja powinna skutkować linią bliską poziomej przy maksymalnej fluorescencji 1, która rozciąga się do punktu topnienia, a następnie linią bliską poziomej od punktu topnienia przy minimalnej fluorescencji 0; nie powinno być poziomów fluorescencji powyżej 1 lub poniżej 0. Na przykład na rysunku 2C znormalizuj krzywe topnienia wstępnego, stosując zakresy temperatur 79-80 °C.
    3. Grupowanie/Grupowanie
      Rozróżniaj genotypy na podstawie ich temperatury topnienia (rysunek 2C, zielona ramka). Wybierz opcję Grupowanie.
      1. Wybierz opcję Autogrupuj z listy wyboru Standardy w sekcji Grupowanie.
      2. Wybierz opcję Normalna lub Wysoka dla profili topnienia z pojedynczymi przejściami lub wieloma przejściami odpowiednio z listy wyboru Czułość w sekcji Grupowanie.
      3. Wybierz pozycję Grupy obliczeniowe w sekcji Grupowanie.
      4. Przejdź do menu Plik i kliknij Zapisz, aby zapisać wyniki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół może być wykonany w ciągu jednego dnia lub podzielony na etapy przez kilka dni (diagram przepływu pracy jest pokazany na rysunku 1). Po ekstrakcji DNA następuje stopienie i analiza amplikonów PCR. Temperatury stopionego amplikonu zależą od wielkości i zawartości GC, ale generalnie odpowiednie są temperatury początkowe i końcowe 50 °C i 95 °C (rysunki 2A i 2B). Po przeprowadzeniu stopu analiza krzywych fluorescencji topnienia zazwyczaj wymaga normalizacji zmienno...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PCR w połączeniu z HRMA to potężna technologia genotypowania danio pręgowanego. Zaletami tego podejścia są jego szybkość, solidność i czułość w wykrywaniu mutacji nawet punktowych. Cały protokół, od klipsa do analizy krzywej topnienia, może być wykonany w czasie krótszym niż osiem godzin przez jedną osobę. Ponadto technika ta nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych; nie wymaga stosowania bromku etydyny; i jest uszczelniony dla wszystkich etapów PCR i analizy, co pomaga zminimalizować problemy z zanieczyszcz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratoriów Blaschke, Grunwald i Wittwer za rady i pomoc techniczną. Praca ta jest wspierana przez Fundację PCMC, NIH R01 MH092256 i DP2 MH100008 oraz grant badawczy Fundacji March of Dimes #1-FY13-425 dla JLB.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 Reaction LightScanner Master MixBioFireHRLS-ASY-0002www.biofiredx.com
96-dołkowe płytki BLK/WHT do PCR z twardą skorupąBio-Rad LaboratoriesHSP9665www.bio-rad.com
Mikrouszczelki samoprzylepne "B"Bio-Rad LaboratoriesMSB1001
www.bio-rad.com 96-dołkowy przyrząd LightScannerBioFireLSCN-ASY-0040www.biofiredx.com
Oprogramowanie LightScanner z Call-IT 2.0BioFirewww.biofiredx.com
Analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości 2.0BioFirewww.biofiredx.com
Oprogramowanie do projektowania podkładówLightScanner BioFirewww.biofiredx.com
Vector NTI SoftwareInvitrogenwww.invitrogen.com
Tricaine
Paraformaldehyd

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  2. Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  3. Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  4. Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
  5. Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
  6. Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
  7. Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
  8. Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
  9. Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
  10. Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
  11. Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
  12. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  13. Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
  14. Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
  15. Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
  16. Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
  17. Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
  18. Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish GenotypingPCR AnalysisHigh resolution MeltDNA ExtractionMelt Curve AnalysisGenotyping ProtocolFluorescent ProbePCR CyclingTemperature NormalizationGenotype Detection

Related Articles