Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Summary

Opisujemy metodę znakowania białka na powierzchni żywych neuronów za pomocą specyficznego poliklonalnego przeciwciała przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym. Białko związane przez przeciwciało na powierzchni komórki, a następnie internalizowane przez endocytozę, można odróżnić od białka pozostającego na powierzchni lub transportowanego na powierzchnię podczas inkubacji.

Abstract

Aby zademonstrować lokalizację domniemanego receptora transbłonowego na powierzchni komórki w hodowanych neuronach, oznaczyliśmy białko na powierzchni żywych neuronów specyficznym pierwotnym przeciwciałem podniesionym przeciwko zewnątrzkomórkowej części białka. Biorąc pod uwagę, że receptory są transportowane do i z powierzchni, jeśli komórki są przepuszczalne po utrwaleniu, zarówno białko powierzchniowe, jak i wewnętrzne zostaną wykryte przez to samo znakowane przeciwciało drugorzędowe. W tym przypadku dostosowaliśmy metodę stosowaną do badania transportu białek ("karmienia przeciwciałami") w celu różnicowego znakowania białka, które zostało zinternalizowane przez endocytozę na etapie inkubacji przeciwciał i białka, które albo pozostało na powierzchni komórki, albo zostało przetransportowane na powierzchnię w tym okresie. Zdolność do rozróżnienia tych dwóch pul białek była możliwa dzięki włączeniu nocnego etapu blokowania z wysoce skoncentrowanym nieznakowanym przeciwciałem drugorzędowym po początkowej inkubacji nieprzepuszczalnych neuronów z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym. Po etapie blokowania, przepuszczalność neuronów pozwoliła na wykrycie zinternalizowanej puli za pomocą fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego znakowanego innym fluoroforem. Korzystając z tej techniki, byliśmy w stanie uzyskać ważne informacje na temat subkomórkowej lokalizacji tego domniemanego receptora, ujawniając, że rzeczywiście był on transportowany na powierzchnię komórki w neuronach. Technika ta ma szerokie zastosowanie do wielu typów komórek i białek powierzchniowych komórek, zapewniając odpowiednie przeciwciało przeciwko epitopowi zewnątrzkomórkowemu.

Introduction

W ustalaniu funkcji nowo zidentyfikowanych białek, badanie subkomórkowej lokalizacji i transportu białka, o którym mowa, może dostarczyć ważnych wskazówek na temat prawdopodobnej roli/ról białka^1,2. Analiza bioinformatyczna transkryptomu rozwijającej się kory nowej³ dostarczyła nam listy genów wykazujących zmienioną ekspresję podczas kortykogenezy mózgu myszy. Następnie przyjęliśmy podejście oparte na nokaucie genów, aby upewnić się, że białko kodowane przez jeden z tych genów, sez6, odgrywa kluczową rolę w rozwoju neuronów. Zaobserwowaliśmy, że białko genu 6 lub Sez6 związanego z napadami padaczkowymi znajduje się w rozwijających się dendrytach i jest również obecne w kolcach dendrytycznych, wyspecjalizowanych strukturach na dendrytach, które odbierają i integrują sygnały pobudzające. Co więcej, gdy brakuje tego białka, dendryty i synapsy pobudzające nie tworzą się^prawidłowo4. Prawdopodobna dominująca izoforma białka ma cechy receptora transbłonowego, chociaż gdy subkomórkowa dystrybucja białka znakowanego immunologicznie została zbadana za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii immunoelektronowej, większość, jeśli nie całość, sygnału wydawała się związana z małymi pęcherzykami w kompartmencie somatodendrytycznym z niewielką ilością lub bez białka znakowanego na błonie plazmatycznej na powierzchni komórki.

Aby ostatecznie wykazać, że ten domniemany receptor z przewidywaną dużą domeną zewnątrzkomórkową jest transportowany do błony komórkowej, przyjęliśmy podejście oparte na żywych komórkach, używając wygenerowanej przez nas surowicy do zewnątrzkomórkowej części białka, aby oznaczyć białko na powierzchni komórki. Łącząc to podejście "karmienia przeciwciałami" z dwoma zastosowaniami różnie znakowanego przeciwciała drugorzędowego oddzielonego rozległym etapem blokowania i etapem przepuszczalności, byliśmy w stanie zidentyfikować dwie różne pule białek wyróżniające się przez wiązanie z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi o różnych znacznikach fluorescencyjnych. W ten sposób byliśmy w stanie odróżnić białko, które zostało zinternalizowane przez endocytozę podczas etapu inkubacji przeciwciał, od białka, które albo pozostało na powierzchni komórki, albo zostało przetransportowane na powierzchnię w tym okresie. Korzystając z tej metody, ustaliliśmy, że białko będące przedmiotem zainteresowania jest transportowane do i z powierzchni komórki w neuronach. Dlatego ta stosunkowo szybka i prosta technika okazała się bardziej pouczająca niż tradycyjne metody immunocytochemiczne lub wstępna mikroskopia elektronowa immunogold, pomimo faktu, że użyliśmy tej samej poliklonalnej surowicy królika do wszystkich tych technik. Technika ta ma ogólne zastosowanie do każdego białka transbłonowego, pod warunkiem, że dostępne jest dobre przeciwciało rozpoznające epitopy domen zewnątrzkomórkowych. Technika ta była wcześniej stosowana do badania transportu receptora glutaminianu podjednostki⁵ receptora glutaminianu GluR1.

Protocol

1. Zdysocjowana hodowla neuronów hipokampa

1. Przygotuj szkiełka nakrywkowe (szkło borokrzemianowe):
   1. Prać w 100% etanolu.
   2. Suszyć na powietrzu w promieniowaniu UV.
   3. Pokryć poli-D-lizyną (0,5 mg/ml w 0,15 M buforze boranowym, przez noc w temperaturze 4 °C).
   4. Następnego dnia (dzień hodowli) przemyć 3x w PBS, a następnie pokryć lamininą (2,5 μg/ml, naturalna laminina mysie) + 5% v/v inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (FCS) rozcieńczonej w PBS przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
2. Rozbioruj hipokampy szczurów z dnia 18 (E18) i zbierz je do PBS zawierającego wapń i magnez, schłodzonego na lodzie. UWAGA: wszystkie protokoły eksperymentalne z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Melbourne.
3. Przygotuj roztwory papainy i DNazy I z zestawu do dysocjacji papainy zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Dodać 50 μl roztworu DNazy I do 1 ml roztworu papainy.
   2. UWAGA: Po pierwszym przygotowaniu, roztwór papainy i roztwory DNazy I mogą być oddzielnie dozowane do podwielokrotności (0,5 ml i 25 μl porcji odpowiednio dla papainy i DNazy I) i przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
4. Usunąć jak najwięcej PBS i inkubować hipokampy (z jednego miotu zarodków) z 1 ml roztworu papainy/DNazy I w temperaturze 37 °C przez 15-20 minut. Delikatnie przesunąć probówkę, aby wymieszać zawartość dwukrotnie w okresie inkubacji.
5. Delikatnie rozcieraj tkankę hipokampa (unikając tworzenia pęcherzyków) za pomocą polerowanej płomieniowo silikonowanej pipety Pasteura 10-15 razy, aż do uzyskania dyspersji komórek i niewielu, jeśli w ogóle, kawałków niezdysocjowanej tkanki.
6. Ostrożnie nałożyć zawiesinę zdysocjowanych komórek na 3 ml poduszki z 4% w/v albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w zrównoważonym roztworze soli Hanksa z dodatkami (HBSS⁺; patrz sekcja 1.6.1).
   1. Przygotować ten roztwór gradientu etapowego, rozpuszczając BSA w temperaturze pokojowej bez mieszania w HBSS zawierającym 2 mM CaCl₂, 1 mM MgSO₄, 4 mM_NaHCO3 i 40 mM glukozy (HBSS⁺), a następnie sterylnie przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
7. Wirówka, 100 x g, 7 min w wirówce stołowej z odchylanym wirnikiem.
8. Usunąć supernatant, uważając, aby nie zassać osadu komórkowego.
9. Delikatnie zawiesić granulowane komórki za pomocą wypolerowanej płomieniowo (silikonowanej) pipety Pasteura (lub niebieskiej końcówki pipety o pojemności 1 ml) w 1 ml kompletnej pożywki Neurobasel (z 2% B27, 0,5 mM L-glutaminy uzupełnionej 1% FCS).
10. Policz dwie podwielokrotności 10 μl za pomocą hemocytometru (Uwaga: licz tylko komórki o jasności fazowej jako "żywe" komórki).
11. Płytki neuronów pierwotnych na wstępnie przygotowanych szkiełkach nakrywkowych ze szkła powlekanego (0,75-1 x 10⁵/18 mm szkiełko nakrywkowe w płytce 12-dołkowej). Bezpośrednio przed posiewem należy odessać nadmiar roztworu lamininy/surowicy ze szkiełek nakrywkowych i zastąpić je pierwotną pożywką do hodowli neuronów (patrz poniżej). Uwaga Wymaganą liczbę szkiełek nakrywkowych należy określić z wyprzedzeniem, ponieważ przygotowanie szkiełek nakrywkowych rozpoczyna się dzień przed posiewem (patrz krok 1.1).
12. Hodowla pierwotnych neuronów hipokampa E18 szczura przez okres do 21 dni in vitro (DIV) w pożywce neurobazalnej, 2% B27, 0,5 mM L-glutaminy uzupełnionej 1% FCS (inaktywowana termicznie). Wykonaj połowę zmiany podłoża przy 7 DIV, a następnie co tydzień. Antymitotyczną fluorodeoksyurydynę/urydynę dodaje się w 7 DIV; Rozcieńczenie 1:1,000 10 mM każdego nukleozydu), aby zapobiec przerostowi gleju.

2. Inkubacja przeciwciał z żywymi neuronami

1. W pierwszym tygodniu hodowli neurony rozwijają altany dendrytyczne, a do 2-3 tygodnia neurony dojrzewają na tyle, aby ulegać synaptogenezie^6,7.
   1. W wybranych eksperymentalnych punktach czasowych nanieść przeciwciało pierwotne do trzykrotnego powiększenia studzienek zawierających pierwotne neurony embrionalne na szkiełkach nakrywkowych. Dodać podwielokrotność przeciwciała bezpośrednio do pożywki hodowlanej pierwotnych neuronów do pożądanego końcowego rozcieńczenia Uwaga: W naszym przykładzie poliklonalną surowicę królika wyhodowaną przeciwko rekombinowanej wydzielanej formie białka rozcieńczono w stosunku 1/500 przez dodanie 2 μl do 1 ml pożywki hodowlanej w studzience; przed pobraniem podwielokrotności przeciwciała można włączyć wirowanie przez 10 minut, 13 000 x g, RT, ponieważ usunie to wszelkie cząstki stałe i może pomóc w redukcji tła.
   2. W przypadku kontroli surowicy przedimmunologicznej dodać równoważną ilość surowicy przedimmunologicznej (do tego samego końcowego rozcieńczenia). Jeśli surowica przedimmunologiczna nie jest dostępna, należy dodać równoważną objętość pożywki neuropodstawowej lub PBS (brak kontroli przeciwciał pierwotnych). Alternatywnie, jeśli dostępne jest odpowiednie przeciwciało pierwszorzędowe, które rozpoznaje wewnątrzkomórkowy region/regiony białka, przeciwciało to można dodać do studzienki kontrolnej w celu zbadania swoistości barwienia powierzchni.
   3. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze hodowlanym na 1-4 godziny (ten okres inkubacji można określić empirycznie). W naszych eksperymentach przeciwciało było obecne przez cały okres, chociaż projekt eksperymentalny mógł obejmować impuls przeciwciała, po którym następował dalszy okres inkubacji po wypłukaniu (eksperyment z pogonią za impulsem) w celu oceny przebiegu internalizacji w czasie.
      KROK OPCJONALNY: Tę inkubację można przeprowadzić w temperaturze pokojowej lub nawet na lodzie, aby w razie potrzeby spowolnić tempo internalizacji białka podstawowego. W przypadku wykonywania w środowisku niekontrolowanym przez CO₂ należy zmienić pożywkę na taką, która nie jest buforowana wodorowęglanem przed dodaniem przeciwciała/surowicy. UWAGA: Dojrzałe hodowle neuronów (>14 dni, a zwłaszcza hodowane neurony embrionalne myszy) nie tolerują dobrze pełnych zmian w pożywce.
2. Zastosowaliśmy czasy inkubacji dla tego pierwotnego etapu internalizacji przeciwciał wynoszące 1 godzinę, 2 godziny i 4 godziny z dobrymi wynikami, chociaż optymalny czas będzie zależał od obfitości białka będącego przedmiotem zainteresowania, a także od dynamiki transportu białka w badanych komórkach.
   UWAGA: Dwukolorowe obrazy pokazane w Reprezentatywnych Wynikach uzyskano przy inkubacji trwającej 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych.
3. Po inkubacji przez pożądany okres odessać pożywkę zawierającą przeciwciała. Umyj studzienki delikatnie, ale szybko, raz za pomocą PBS w temperaturze pokojowej.

3. Wtórne zastosowanie przeciwciał do stałych, nieprzepuszczalnych komórek

1. Utrwalić neurony za pomocą 4% paraformaldehydu w buforze fosforanowym o pH 7,2, 5 min w temperaturze pokojowej Uwaga: aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj świeżo przygotowanego utrwalacza; alternatywnie użyj fixu, który był przechowywany w temperaturze -20 °C i całkowicie rozmrożony, aby nie było widoczne wytrącony paraformaldehyd. UWAGA: Utrwalacz paraformaldehydu należy przygotować i obchodzić się z nim pod wyciągiem.
2. Usunąć płyn ze studzienek (przenieść do pojemnika na odpady płynne w dygestorium) i spłukać 3x PBS.
   1. KROK OPCJONALNY: W razie potrzeby, aby zaoszczędzić na odczynnikach przeciwciał, szkiełka nakrywkowe można ostrożnie usunąć z płytki 12-dołkowej za pomocą kleszczyków i umieścić komórką do góry na arkuszu Parafilmu ułożonym na podstawie jednorazowej płytki hodowlanej.
   2. Roztwory można następnie delikatnie pipetować na szkiełka nakrywkowe, tak aby były całkowicie pokryte, bez wylewania roztworu przez krawędź szkiełka nakrywkowego na Parafilm.
   3. Technika ta jest odpowiednia do krótkotrwałych inkubacji (1-2 godziny), jednak dłuższe inkubacje (np. przez noc) należy przeprowadzać w wilgotnej komorze. Alternatywnie, szkiełka nakrywkowe można umieścić z powrotem w dołkach płytki 12-dołkowej w celu inkubacji przez noc i dodać wystarczającą objętość, aby zapewnić, że szkiełka nakrywkowe nie wyschną.
3. Blokuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej z 5% BSA w PBS (Uwaga: Na tym etapie nie dodawaj detergentu do roztworu blokującego, ponieważ ważne jest, aby komórki nie były przepuszczalne).
4. W celu znakowania białka powierzchniowego przed przystąpieniem do wykrywania białka zinternalizowanego, należy zastosować pierwsze wybrane przeciwciało 2° znakowane fluorescencyjnie.
   Uwaga: W opisanym tutaj przykładzie pierwszorzędowa surowica została wyhodowana w króliku (przeciwciało wewnętrzne) do rekombinowanej wydzielanej izoformy⁴. Tak więc, aby uzyskać pierwsze przeciwciało wtórne, które wykryło zewnątrzkomórkowy region izoformy transbłonowej na powierzchni nieprzepuszczalnych neuronów, użyliśmy anty-królika Dylight 649 (1/200 rozcieńczonego w PBS zawierającym 5% BSA). Zaleca się odwirowanie rozcieńczonych roztworów przeciwciał drugorzędowych (10 min, 13 000 x g, RT) przed użyciem.
5. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
6. Szkiełka nakrywkowe myć (w studzienkach), 2x 5 min za pomocą PBS.

4. Blokowanie za pomocą nadmiaru nieoznakowanego przeciwciała 2°

1. Zablokuj nieprzepuszczalne neurony wysokim stężeniem (>0,1 mg/ml) nieznakowanego przeciwciała 2°.
   1. Nieznakowane przeciwciało 2° powinno być hodowane przeciwko gatunkowi, u którego wyhodowano przeciwciało pierwszorzędowe (w tym przypadku królik) przez inkubację przez noc w temperaturze pokojowej.
   2. W tym protokole zastosowano AffiniPure F_ab fragment kozioł anty-króliczy IgG (H+L) w stężeniu 0,13 mg/ml.
      UWAGA: Stwierdzono, że inkubacja przez noc jest kluczowa, ponieważ krótszy okres inkubacji (2 godziny) był niewystarczający do całkowitego zablokowania przeciwciała pierwszorzędowego, które nie było w pełni związane przez znakowane przeciwciało drugorzędowe.
2. Szkiełka nakrywkowe myć (w studzienkach), 2x 5 min za pomocą PBS.
3. Po tym etapie blokowania należy utrwalić komórki 4% paraformaldehydem w buforze fosforanowym o pH 7,2, 5 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać PBS (2x) po usunięciu utrwalacza (przenieść utrwalacz do pojemnika na odpady płynne w dygestorium).

5. Permeabilizacja i zastosowanie drugiego fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała 2°

1. Przepuszczać i blokować komórki za pomocą 5% BSA w PBS zawierającym 0,1% Triton-X-100 w temperaturze pokojowej przez 30 min.
2. Usuń roztwór blokujący (uważając, aby szkiełka nakrywkowe nie wyschły). Dodać drugie fluorescencyjnie sprzężone przeciwciało 2° oznaczone innym fluoroforem.
   1. UWAGA: Musi istnieć możliwość odróżnienia tego znacznika fluoroforowego od poprzednio używanego, w zależności od dostępnych filtrów wzbudzenia/emisji w mikroskopie konfokalnym (patrz poniżej).
   2. W przykładzie przedstawionym w tym protokole użyto sprzężonego z Alexa Fluor 488 przeciwciała anty-króliczego 2° osła (1/200 w PBS, 5% BSA i 0,1% Triton-X-100). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć roztwór przeciwciał o temperaturze 2°.
3. Szkiełka nakrywkowe myć 3x 5 min PBS, a na koniec krótko umyć wodą dejonizowaną.

6. Montaż i obrazowanie

1. Szkiełka nakrywkowe zamontować na szkiełkach podstawowych z wodnym medium mocującym zapobiegającym blaknięciu (np. VECTASHIELD) i pozostawić do wyschnięcia. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C w celu optymalnego zachowania intensywności sygnału fluorescencyjnego.
2. Obraz komórek barwionych immunologicznie pod mikroskopem konfokalnym.
   1. Muszą być dostępne odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji do wykrywania dwóch sygnałów fluoroforowych.
   2. Jeżeli mają być porównane różne warunki eksperymentalne (na przykład szybkość internalizacji w zdepolaryzowanych^8,9 lub warunki kontrolne), należy upewnić się, że wszystkie powtórzone szkiełka nakrywkowe z różnych warunków są obrazowane z tymi samymi parametrami akwizycji obrazu. Zintegrowana gęstość standardowych obszarów zainteresowania lub atrybuty puncta (np. liczba, rozmiar) z wynikowych obrazów mogą być następnie mierzone za pomocą standardowego oprogramowania do analizy obrazów (np. Fiji/ImageJ, Metamorph).

Results

Przedstawiona tutaj technika barwienia immunologicznego dwukolorowej fluorescencji jest przydatna do oznaczania domen zewnątrzkomórkowych białek transbłonowych w żywych komórkach (pokazanych schematycznie na rysunku 1). W okresie inkubacji immunoglobuliny wiążą dostępne epitopy, a część populacji cząsteczek białka wraz ze związanym przeciwciałem jest endocytozyzowana. Ponadto nowo zsyntetyzowane białko może dotrzeć do powierzchni komórki poprzez transport do przodu, a cząsteczki białka z recyklingu mogą ...

Discussion

Opisana tutaj technika jest komplementarna do biotynylacji na powierzchni komórki (recenzowana przez Arancibia-Càrcamo i wsp.)¹² i jest to metoda z wyboru do zachowania informacji o subkomórkowej lokalizacji zinternalizowanego białka, pod warunkiem, że dostępne jest odpowiednie pierwotne przeciwciało przeciwko epitopowi zewnątrzkomórkowemu. Ponadto można przeprowadzić ilościowe określenie transportu/internalizacji białek w czasie (poprzez utrwalanie szkiełek nakrywkowych w różnych momentach inkubacji ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS z Ca i Mg	Invitrogen	14040182
Podłoże neurobazalne	Suplement Invitrogen	21103-049
B27	Invitrogen	17504-044
L-glutamina	Invitrogen	25030-081
System dysocjacji papainy	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Surowica bydlęca Albumina	Sigma Aldrich Australia	A9418
Hank' s zbilansowany roztwór soli bez wapnia, magnezu, czerwieni fenolowej	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lizyna	Sigma Aldrich Australia	P0899
Naturalna laminina mysia	Invitrogen	23017-015	Rozmrozić na lodzie przed zrobieniem podwielokrotności
Płodowa surowica bydlęca HyClone	Thermo Fisher
Fluorodeoksyurydyna	Sigma Aldrich Australia	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm Szkiełka nakrywkowe okrągłe	Menzel Glä ser	CB00180RA1
wodne medium montażowe VECTASHIELD	Vector Laboratories	H1400
Osioł anty-królik Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Kozia anty-królik 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - uchwyt w dygestoriach
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488-sprzężony osioł anty-królik 2° przeciwciało	Invitrogen - Sondy molekularne	A21206