Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Summary

Opisujemy metodę znakowania białka na powierzchni żywych neuronów za pomocą specyficznego poliklonalnego przeciwciała przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym. Białko związane przez przeciwciało na powierzchni komórki, a następnie internalizowane przez endocytozę, można odróżnić od białka pozostającego na powierzchni lub transportowanego na powierzchnię podczas inkubacji.

Abstract

Aby zademonstrować lokalizację domniemanego receptora transbłonowego na powierzchni komórki w hodowanych neuronach, oznaczyliśmy białko na powierzchni żywych neuronów specyficznym pierwotnym przeciwciałem podniesionym przeciwko zewnątrzkomórkowej części białka. Biorąc pod uwagę, że receptory są transportowane do i z powierzchni, jeśli komórki są przepuszczalne po utrwaleniu, zarówno białko powierzchniowe, jak i wewnętrzne zostaną wykryte przez to samo znakowane przeciwciało drugorzędowe. W tym przypadku dostosowaliśmy metodę stosowaną do badania transportu białek ("karmienia przeciwciałami") w celu różnicowego znakowania białka, które zostało zinternalizowane przez endocytozę na etapie inkubacji przeciwciał i białka, które albo pozostało na powierzchni komórki, albo zostało przetransportowane na powierzchnię w tym okresie. Zdolność do rozróżnienia tych dwóch pul białek była możliwa dzięki włączeniu nocnego etapu blokowania z wysoce skoncentrowanym nieznakowanym przeciwciałem drugorzędowym po początkowej inkubacji nieprzepuszczalnych neuronów z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym. Po etapie blokowania, przepuszczalność neuronów pozwoliła na wykrycie zinternalizowanej puli za pomocą fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego znakowanego innym fluoroforem. Korzystając z tej techniki, byliśmy w stanie uzyskać ważne informacje na temat subkomórkowej lokalizacji tego domniemanego receptora, ujawniając, że rzeczywiście był on transportowany na powierzchnię komórki w neuronach. Technika ta ma szerokie zastosowanie do wielu typów komórek i białek powierzchniowych komórek, zapewniając odpowiednie przeciwciało przeciwko epitopowi zewnątrzkomórkowemu.

Introduction

W ustalaniu funkcji nowo zidentyfikowanych białek, badanie subkomórkowej lokalizacji i transportu białka, o którym mowa, może dostarczyć ważnych wskazówek na temat prawdopodobnej roli/ról białka^1,2. Analiza bioinformatyczna transkryptomu rozwijającej się kory nowej³ dostarczyła nam listy genów wykazujących zmienioną ekspresję podczas kortykogenezy mózgu myszy. Następnie przyjęliśmy podejście oparte na nokaucie genów, aby upewnić się, że białko kodowane przez jeden z tych genów, sez6, odgrywa kluczową rolę w rozwoju neuronów. Zaobserwowaliśmy, że białko genu 6 lub Sez6 związanego z napadami padaczkowymi znajduje się w rozwijających się de....

Protocol

1. Zdysocjowana hodowla neuronów hipokampa

1. Przygotuj szkiełka nakrywkowe (szkło borokrzemianowe):
   1. Prać w 100% etanolu.
   2. Suszyć na powietrzu w promieniowaniu UV.
   3. Pokryć poli-D-lizyną (0,5 mg/ml w 0,15 M buforze boranowym, przez noc w temperaturze 4 °C).
   4. Następnego dnia (dzień hodowli) przemyć 3x w PBS, a następnie pokryć lamininą (2,5 μg/ml, naturalna laminina mysie) + 5% v/v inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (FCS) rozcieńczonej w PBS przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
2. Rozbioruj hipokampy szczurów z dnia 18 (E18) i zbierz je do PBS zawierającego wapń i magnez, schłodzon....

Results

Przedstawiona tutaj technika barwienia immunologicznego dwukolorowej fluorescencji jest przydatna do oznaczania domen zewnątrzkomórkowych białek transbłonowych w żywych komórkach (pokazanych schematycznie na rysunku 1). W okresie inkubacji immunoglobuliny wiążą dostępne epitopy, a część populacji cząsteczek białka wraz ze związanym przeciwciałem jest endocytozyzowana. Ponadto nowo zsyntetyzowane białko może dotrzeć do powierzchni komórki poprzez transport do przodu, a cząsteczki białka z recyklingu mogą .......

Discussion

Opisana tutaj technika jest komplementarna do biotynylacji na powierzchni komórki (recenzowana przez Arancibia-Càrcamo i wsp.)¹² i jest to metoda z wyboru do zachowania informacji o subkomórkowej lokalizacji zinternalizowanego białka, pod warunkiem, że dostępne jest odpowiednie pierwotne przeciwciało przeciwko epitopowi zewnątrzkomórkowemu. Ponadto można przeprowadzić ilościowe określenie transportu/internalizacji białek w czasie (poprzez utrwalanie szkiełek nakrywkowych w różnych momentach inkubacji .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS z Ca i Mg	Invitrogen	14040182
Podłoże neurobazalne	Suplement Invitrogen	21103-049
B27	Invitrogen	17504-044
L-glutamina	Invitrogen	25030-081
System dysocjacji papainy	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Surowica bydlęca Albumina	Sigma Aldrich Australia	A9418
Hank' s zbilansowany roztwór soli bez wapnia, magnezu, czerwieni fenolowej	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lizyna	Sigma Aldrich Australia	P0899
Naturalna laminina mysia	Invitrogen	23017-015	Rozmrozić na lodzie przed zrobieniem podwielokrotności
Płodowa surowica bydlęca HyClone	Thermo Fisher
Fluorodeoksyurydyna	Sigma Aldrich Australia	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm Szkiełka nakrywkowe okrągłe	Menzel Glä ser	CB00180RA1
wodne medium montażowe VECTASHIELD	Vector Laboratories	H1400
Osioł anty-królik Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Kozia anty-królik 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - uchwyt w dygestoriach
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488-sprzężony osioł anty-królik 2° przeciwciało	Invitrogen - Sondy molekularne	A21206