Artykuł metodologiczny

In situ Obciążenie kompresyjne i korelacyjne nieinwazyjne obrazowanie stawu włóknistego kość-więzadło przyzębia-ząb

DOI:

10.3791/51147

⸱

7 marca 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biomaterials and Bioengineering, Department of Preventive and Restorative Dental Sciences, University of California San Francisco, 2Department of Radiology and Biomedical Imaging, University of California San Francisco, 3Xradia Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu omówione zostanie użycie urządzenia do ładowania in situ w połączeniu z mikro-rentgenowską tomografią komputerową do biomechaniki stawów włóknistych. Odczyty doświadczalne identyfikujące się z ogólną zmianą biomechaniki stawów będą obejmowały: 1) siłę reakcyjną w funkcji przemieszczenia, tj. przemieszczenie zęba w obrębie zębodołu i jego reakcję reakcyjną na obciążenie, 2) trójwymiarową (3D) konfigurację przestrzenną i morfometrię, tj. zależność geometryczną zęba względem zębodołu oraz 3) zmiany odczytów 1 i 2 na skutek zmiany osi obciążenia, tj. obciążenia koncentryczne lub mimośrodowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie demonstruje nowy protokół testowania biomechaniki. Zaletą tego protokołu jest zastosowanie urządzenia ładującego in situ sprzężonego z mikroskopem rentgenowskim o wysokiej rozdzielczości, umożliwiając w ten sposób wizualizację wewnętrznych elementów strukturalnych w symulowanych obciążeniach fizjologicznych i wilgotnych warunkach. Próbki eksperymentalne będą obejmowały nienaruszone stawy włókniste kość-więzadło przyzębia (PDL)-zęb. Wyniki zilustrują trzy ważne cechy protokołu, które można zastosować do biomechaniki na poziomie narządów: 1) siła reakcyjna a przemieszczenie: przemieszczenie zęba w zębodole i jego reakcja reakcyjna na obciążenie, 2) trójwymiarowa (3D) konfiguracja przestrzenna i morfometria: geometryczna zależność zęba od zębodołu oraz 3) zmiany odczytów 1 i 2 spowodowane zmianą osi obciążenia, tj. od obciążeń koncentrycznych do mimośrodowych. Skuteczność proponowanego protokołu zostanie oceniona poprzez sprzężenie odczytów testów mechanicznych z morfometrią 3D i ogólną biomechaniką stawu. Ponadto technika ta będzie kładła nacisk na potrzebę zrównoważenia warunków eksperymentalnych, w szczególności obciążeń reakcyjnych przed uzyskaniem tomogramów stawów włóknistych. Należy zauważyć, że proponowany protokół ogranicza się do badania próbek w warunkach ex vivo, a stosowanie środków kontrastowych do wizualizacji reakcji mechanicznej tkanek miękkich może prowadzić do błędnych wniosków dotyczących biomechaniki na poziomie tkanek i narządów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka metod eksperymentalnych jest nadal używanych do badania biomechaniki stawów biegunowych i włóknistych. Metody specyficzne dla biomechaniki narządów zęba obejmują użycie tensometrów1-3, metod fotoelastyczności 4,5, interferometrii mory 6,7, interferometrii elektronowej plamki8 oraz cyfrowej korelacji obrazu (DIC)9-14. W tym badaniu innowacyjne podejście obejmuje nieinwazyjne obrazowanie z wykorzystaniem promieni rentgenowskich w celu odsłonięcia wewnętrznych struktur stawu włóknistego (zmineralizowanych tkanek i ich interfejsów składających się z bardziej miękkich stref oraz tkanek współpracujących, takich jak więzadła) przy obciążeniach równoważnych warunkom in vivo. Zostanie użyte urządzenie ładujące in situ sprzężone z mikroskopem mikrorentgenowskim. Krzywe czasu obciążenia i obciążenia-przemieszczenia będą zbierane w miarę ładowania zęba trzonowego będącego przedmiotem zainteresowania w świeżo pobranej półżuchwie szczura. Głównym celem podejścia przedstawionego w niniejszej pracy jest podkreślenie wpływu trójwymiarowej morfologii zęba-kości poprzez porównanie warunków w: 1) bez obciążenia i przy obciążeniu oraz gdy 2) obciążonym koncentrycznie i mimośrodowo. Wyeliminowanie konieczności wycinania próbek i przeprowadzania eksperymentów na całych nienaruszonych narządach w wilgotnych warunkach pozwoli na maksymalne zachowanie stanu naprężeń 3D. Otwiera to nowy obszar badań w zrozumieniu dynamicznych procesów kompleksu w różnych scenariuszach obciążenia.

W tym badaniu szczegółowo omówione zostaną metody testowania biomechaniki PDL w nienaruszonym włóknistym stawie szczura Sprague Dawley, stawie uważanym za optymalny system modelowy bioinżynierii. Eksperymenty będą obejmowały symulację obciążeń żucia w warunkach nawodnienia, aby podkreślić trzy ważne cechy stawu w odniesieniu do biomechaniki na poziomie narządów. Trzy punkty będą obejmować: 1) siłę reakcyjną w funkcji przemieszczenia: przemieszczenie zęba w zębodole zębodołowym i jego reakcję reakcyjną na obciążenie, 2) trójwymiarową (3D) konfigurację przestrzenną i morfometrię: zależność geometryczną zęba względem zębodołu oraz 3) zmiany odczytów 1 i 2 spowodowane zmianą osi obciążenia, tj. od obciążeń koncentrycznych do mimośrodowych. Trzy podstawowe odczyty proponowanej techniki mogą być zastosowane do zbadania adaptacyjnego charakteru stawów u kręgowców z powodu zmian w wymaganiach funkcjonalnych i/lub choroby. Zmiany w wyżej wymienionych odczytach, w szczególności korelacja między obciążeniami reakcyjnymi a przemieszczeniem oraz wynikające z nich krzywe czasu obciążenia reakcyjnego i obciążenia-przemieszczenia przy różnych prędkościach obciążenia, mogą być zastosowane w celu podkreślenia ogólnych zmian w biomechanice stawów. Skuteczność proponowanego protokołu zostanie oceniona poprzez sprzężenie odczytów testów mechanicznych z morfometrią 3D i ogólną biomechaniką stawu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla zwierząt i eutanazja: Wszystkie zwierzęta użyte w tej demonstracji były trzymane w warunkach wolnych od patogenów, zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) oraz Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH).

Zaopatrz zwierzęta w standardową karmę dla szczurów z twardym granulem i wodę ad lib. Eutanazja zwierząt za pomocą dwuetapowej metody uduszenia dwutlenkiem węgla, obustronna torakotomia zgodnie ze standardowym protokołem UCSF zatwierdzonym przez IACUC. Wykonaj badania biomechaniczne w ciągu 24 godzin od uśmiercenia zwierząt, aby uniknąć degradacji tkanek.

1. Przygotowanie i rozbiór żuchwy lub szczęki szczura

  1. Usuń żuchwy szczura, delikatnie przecinając tkankę błoniastą i przyczepy tkanki mięśniowej, zachowując całą żuchwę, w tym wyrostek dziobiasty i wyrostek kłykciowy (ryc. 1)15.
  2. Oddziel hemimandibles, ostrożnie przecinając włóknistą tkankę spojenia żuchwy za pomocą ostrza skalpela.
    Uwaga: Wyrostki wieńcowe i kłykciowe oraz ramus żuchwy (ryc. 1) należy usunąć, jeśli fizycznie utrudniają badanie biomechaniczne 2. zęba trzonowego.
  3. Przeciąć siekacze bez odsłaniania komory miazgi, aby nie utrudniać obciążenia zęba trzonowego.

2. Przygotowanie próbki do obciążenia ściskającego in situ (Rysunek 2)

  1. Unieruchomić próbkę na stalowym króćcu za pomocą materiału, który jest znacznie sztywniejszy niż próbka doświadczalna przed załadowaniem jej do urządzenia ładującego in situ (rysunek 2A).
    Uwaga: Do unieruchomienia próbki w tym badaniu użyto polimetakrylanu metylu (PMMA), a nadmiar, jeśli wystąpił, usunięto za pomocą eksploratora dentystycznego.
  2. Wyrównaj powierzchnię zgryzową zęba trzonowego (zębów trzonowych) będących przedmiotem zainteresowania równolegle do krążka próbki metalowej AFM, używając prostej krawędzi w obu płaszczyznach (tj. mezjalno-dystalnej i policzkowo-językowej).
  3. Stwórz koryto narzędziem otaczającym zęby trzonowe.
    Uwaga: Przestrzeń ta powinna służyć jako "fosa", aby zatrzymać nadmiar płynu i utrzymać nawodnienie tkanek podczas ładowania in situ.
  4. Przygotuj powierzchnię zęba do odbudowy do koncentrycznego (Rysunek 2B) lub mimośrodowego (Rysunek 2C) obciążenia za pomocą kompozytu dentystycznego. Wytrawić powierzchnię interesującego zęba 35% żelem z kwasem fosforowym na powierzchni zgryzu przez 15 sekund.
  5. Dokładnie spłucz wytrawiacz wodą dejonizowaną i osusz powierzchnię za pomocą strzykawki powietrzno-wodnej lub kanistra ze sprężonym powietrzem. Za pomocą eksploratora rozprowadź cienką warstwą kroplę środka wiążącego w otwartych guzkach. Utwardź kompozyt za pomocą lampy do utwardzania zębów.
    Uwaga: Wszystkie czynności związane z kompozytami powinny być wykonywane bez bezpośredniego światła z lampy. Takie warunki w niepożądany sposób przyspieszyłyby proces polimeryzacji i mogłyby uniemożliwić prawidłowe ułożenie kompozytu. Dopuszczalne jest oświetlenie pomieszczenia.
  6. Usuń nadmiar środka wiążącego z sąsiednich zębów za pomocą drobnego skalpela lub żyletki.
  7. Po przygotowaniu powierzchni umieść płynny kompozyt dentystyczny na powierzchni i rozprowadź go w rowkach zębów trzonowych za pomocą eksploratora dentystycznego.
  8. Wystaw kompozyt na działanie światła utwardzającego zęby przez 30 sekund.
  9. Uformuj nagromadzenie zgryzowe o wielkości około 3-4 mm za pomocą kompozytu z żywicy dentystycznej, od płaszczyzny zgryzowej zębów trzonowych będących przedmiotem zainteresowania i utwardź światłem przez 30 sekund.
  10. Zmniejsz górną część kompozytu do płaskiej powierzchni równoległej, aby umożliwić spójny schemat ładowania wszystkich próbek przy użyciu prostej krawędzi i szybkoobrotowej rękojeści.
    Uwaga: Podczas badań biomechanicznych inne próbki powinny być przechowywane w roztworze buforowanym tris-fosforanem (TBS) z 50 mg/ml penicyliny i streptomycyny15.

3. Dryf i sztywność urządzenia załadowczego, zdolność różnicowania właściwości materiału, obciążenie złącza włóknistego in situ

  1. Zabezpiecz próbkę za pomocą kompozytu nagromadzonego na kowadle etapu ładowania i przetestuj równomierne obciążenie, jak pokazano na rysunku 2B.
  2. Umieść papier przegubowy na powierzchni kompozytu, a następnie załaduj próbkę do skończonego obciążenia, aby sprawdzić, czy nie ma obciążenia koncentrycznego lub mimośrodowego (rysunki 2B i 2C).
  3. Umieść nasączony TBS Kimwipe wokół próbki, aby zapewnić nawodnienie próbki. Zrób koryto wokół próbki i wypełnij je TBS, aby utrzymać narząd nawodniony podczas obrazowania.
  4. Wprowadź obciążenie szczytowe i szybkość przemieszczenia do oprogramowania Deben, aby ścisnąć trzonowiec do pożądanego obciążenia szczytowego przy szybkości przemieszczenia po unieruchomieniu krwionośnego.
    Uwaga: Typowe odczyty powinny uwzględniać obciążenie reakcyjne, ponieważ materiał jest ściskany w czasie (czułość przetwornika obciążenia = 0,1 N). Na podstawie czasu obciążenia i czasu przemieszczenia należy uzyskać krzywą obciążenia-przemieszczenia dla sprasowanego materiału16-18. Na podstawie danych zebranych z cykli obciążenia można również określić różne właściwości złącza. Sztywność połączenia należy obliczyć, biorąc pod uwagę nachylenie części liniowej (w przybliżeniu ostatnie 30% danych) fazy obciążenia obciążenia w funkcji krzywej przemieszczenia19.

4. Barwienie tkanek miękkich, PDL, kwasem fosfowolframowym (PTA)

Uwaga: Aby zwiększyć kontrast tłumienia promieniowania rentgenowskiego, PDL powinien być zabarwiony 5% roztworem PTA20.

  1. Wlej roztwór barwiący PTA do czystej szklanej karpuli o pojemności 1,8 ml i umieść załadowaną karpulę w strzykawce.
  2. Roztwór należy wstrzykiwać powoli (5 min/karpulę) do przestrzeni PDL sąsiednich zębów, aby zapobiec uszkodzeniom strukturalnym tkanek przyzębia otaczających zęby trzonowe będące przedmiotem zainteresowania.
    Uwaga: Powyższe czynności należy powtarzać do momentu wstrzyknięcia około 5 pełnych karpul (9 ml) roztworu i pozostawienia go do spływania do otaczających tkanek. Przygotowane próbki można również namoczyć przez noc w pozostałym roztworze PTA (8 godzin).

5. Zalecane ustawienia skanowania μ-XCT

Wykonaj m-XCT z następującymi ustawieniami skanowania:

Obiektywne powiększenie4x, 10x
1 800 obrazów
Napięcie lampy rentgenowskiej75 kVp (50 kVp dla próbek barwionych PTA)
8 W
Czas ekspozycji~8-25 sekund*
~4 μm (obiektyw 4X),~2 μm (obiektyw 10X) **

* czas ekspozycji może się różnić w zależności od geometrii i gęstości optycznej próbki oraz napięcia lampy rentgenowskiej.
** Rzeczywista rozdzielczość pikseli będzie się nieznacznie różnić w zależności od konfiguracji źródła, próbki i detektora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oszacowanie obciążenia urządzenia "luz", "odepchnięcie", sztywność i dryf systemu pod stałym obciążeniem

Luza: Pomiędzy częścią cyklu załadunku i rozładunku występuje 3-sekundowa przerwa, podczas której biegi w silniku zmieniają się do tyłu przed rozpoczęciem właściwego rozładowywania, tj. gdy próbka odsuwa się od górnej szczęki (Rysunek 3). Okres ten jest określany jako luz w systemie, który reprezentuje odcinek czasu, w którym syste...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwszym krokiem do ustanowienia tego protokołu była ocena sztywności ramy ładunkowej przy użyciu sztywnego nadwozia. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że sztywność była znacznie wyższa, co umożliwiło wykorzystanie urządzenia obciążającego do dalszych badań próbek o znacznie niższych wartościach sztywności. Drugi etap uwypuklił zdolność przyrządu do rozróżniania różnych wartości sztywności przy użyciu dwóch faz krzywej obciążenia-odciążenia wygenerowanej przy użyciu sztywnego korpusu, materiałów PDMS o różnej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe NIH/NIDCR R00DE018212 (SPH), NIH/NIDCR-R01DE022032 (SPH), NIH/NIDCR T32 DE07306 (AJ, JDL), NIH/NCRR S10RR026645, (SPH) oraz Departments of Preventive and Restorative Dental Sciences oraz Orofacial Sciences, UCSF. Ponadto autorzy dziękują Xradia Graduate Fellowship (AJ), Xradia Inc., Pleasanton, CA.

Autorzy dziękują dr Kathryn Grandfield, UCSF za pomoc w przetwarzaniu danych; Drs. Stephen Weiner i Gili Naveh, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Izrael; Dr. Ron Shahar, The HebrewUniversity of Jerusalem, Izrael za ich wnikliwe dyskusje na temat urządzenia do ładowania in situ. Autorzy chcieliby również podziękować Biomaterials and Bioengineering MicroCT Imaging Facility na UCSF za zastosowanie Micro XCT i in situ urządzenie ładujące.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bard Parker BladeBDMEDC-001054
Metalowy dysk AFMTed Pella16218
Polimetylometakrylan GC AmericaN/A
Uni-EtchBiscoE5502EBM
Optibond Solo PlusKerr CorpN/A
Filtek Flow3MN/A
Hurculite UltraKerr34346
Tris bufferMediatech Inc.Nie dotyczy
Papier przegubowyParkell Inc.
Kwas fosfowolframowySigma AldrichHT152

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Popowics, T. E., Rensberger, J. M., Herring, S. W. Enamel microstructure and microstrain in the fracture of human and pig molar cusps. Arch. Oral Biol. 49, 595-605 (2004).
  2. Jantarat, J., Palamara, J. E., Messer, H. H. An investigation of cuspal deformation and delayed recovery after occlusal loading. J. Dent. 29, 363-370 (2001).
  3. Jantarat, J., Panitvisai, P., Palamara, J. E., Messer, H. H. Comparison of methods for measuring cuspal deformation in teeth. J. Dent. 29, 75-82 (2001).
  4. Asundi, A., Kishen, A. A strain gauge and photoelastic analysis of in vivo strain and in vitro stress distribution in human dental supporting structures. Arch. Oral Biol. 45, 543-550 (2000).
  5. Asundi, A., Kishen, A. Advanced digital photoelastic investigations on the tooth-bone interface. J. Biomed. Opt. 6, 224-230 (2001).
  6. Wang, R. Z., Weiner, S. Strain-structure relations in human teeth using Moire fringes. J. Biomech. 31, 135-141 (1998).
  7. Wood, J. D., Wang, R., Weiner, S., Pashley, D. H. Mapping of tooth deformation caused by moisture change using moire interferometry. Dent. Mater. 19, 159-166 (2003).
  8. Dong-Xu, L., et al. Modulus of elasticity of human periodontal ligament by optical measurement and numerical simulation. Angle Orthod. 81, 229-236 (2011).
  9. Li, J., Li, H., Fok, A. S., Watts, D. C. Multiple correlations of material parameters of light-cured dental composites. 25, 829-836 (2009).
  10. Zhang, D., Arola, D. D. Applications of digital image correlation to biological tissues. J. Biomed. Opt. 9, 691-699 (2004).
  11. Zhang, D., Mao, S., Lu, C., Romberg, E., Arola, D. Dehydration and the dynamic dimensional changes within dentin and and enamel. Dent. Mater. 25, 937-945 (2009).
  12. Qian, L., Todo, M., Morita, Y., Matsushita, Y., Koyano, K. Deformation analysis of the periodontium considering the viscoelasticity of the periodontal. 25, 1285-1292 (2009).
  13. Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. , (2012).
  14. Qian, L., Todo, M., Morita, Y., Matsushita, Y., Koyano, K. Deformation analysis of the periodontium considering the viscoelasticity of the periodontal. 25, 1285-1292 (2009).
  15. Huelke, D. F., Castelli, W. A. The blood supply of the rat mandible. Anat. Rec. 153, 335-341 (1965).
  16. Chiba, M., Komatsu, K. Mechanical responses of the periodontal ligament in the transverse section of the rat mandibular incisor at various velocities of loading in vitro. J. Biomech. 26, 561-570 (1993).
  17. Natali, A. N., et al. A visco-hyperelastic-damage constitutive model for the analysis of the biomechanical response of the periodontal ligament. J. Biomech. Eng. 130, (2008).
  18. Naveh, G. R., Shahar, R., Brumfeld, V., Weiner, S. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone: A dynamic 3D microCT study of the rat molar. J. Struct. Biol. 177, 477-483 (2012).
  19. Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. 46, 443-449 (2013).
  20. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
  21. Carrillo, F., et al. Nanoindentation of polydimethylsiloxane elastomers: Effect of crosslinking, work of adhesion, and fluid environment on elastic modulus (vol 20, pg 2820). J. Mater. Res. 21, 535-537 (2006).
  22. Hiiemae, K. M. Masticatory function in the mammals. J. Dent. Res. 46, 883-893 (1967).
  23. Hunt, H. R., Rosen, S., Hoppert, C. A. Morphology of molar teeth and occlusion in young rats. J. Dent. Res. 49, 508-514 (1970).
  24. Komatsu, K., Sanctuary, C., Shibata, T., Shimada, A., Botsis, J. Stress-relaxation and microscopic dynamics of rabbit periodontal ligament. J. Biomech. 40, 634-644 (2007).
  25. Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. 46, 443-449 (2013).
  26. Quintarelli, G., Zito, R., Cifonelli, J. A. On phosphotungstic acid staining. I. J. Histochem. Cytochem. 19, 641-647 (1971).
  27. Quintarelli, G., Cifonelli, J. A., Zito, R. On phosphotungstic acid staining. II. J. Histochem. Cytochem. 19, 648-653 (1971).
  28. Quintarelli, G., Bellocci, M., Geremia, R. On phosphotungstic acid staining. IV. Selectivity of the staining reaction. J. Histochem. Cytochem. 21, 155-160 (1973).
  29. Crabtree, W. N., Murphy, W. M. The value of ethanol as a fixative in urinary cytology. Acta Cytol. 24, 452-455 (1980).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

In Situ LoadingBone Periodontal LigamentX ray MicroscopyMechanical TestingTooth Displacement3D MorphometricsEccentric LoadingPTA StainingFibrous Joint AnalysisOrgan Level Biomechanics

Powiązane artykuły