Artykuł metodologiczny

Systemowe wstrzykiwanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych u myszy z przewlekłym EAE

DOI:

10.3791/51154

⸱

15 kwietnia 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Neurosciences, John Van Geest Centre for Brain Repair, University of Cambridge, UK, 2NIHR Biomedical Research Center, University of Cambridge, UK

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeszczep komórek macierzystych/progenitorowych (NPC) jest bardzo obiecujący w neurologii regeneracyjnej. Systemowe dostarczanie NPC przekształciło się w skuteczny, mało inwazyjny i bardzo skuteczny terapeutycznie protokół dostarczania komórek macierzystych do mózgu i rdzenia kręgowego gryzoni i naczelnych dotkniętych eksperymentalnym przewlekłym uszkodzeniem zapalnym ośrodkowego układu nerwowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronalne komórki macierzyste/prekursorowe (NPC) są obiecującym źródłem komórek macierzystych dla metod transplantacji mających na celu naprawę lub odbudowę mózgu w neurologii regeneracyjnej. Dyrektywa ta powstała w oparciu o obszerne dowody na to, że naprawa mózgu jest osiągana po ogniskowym lub ogólnoustrojowym przeszczepie NPC w kilku przedklinicznych modelach chorób neurologicznych.

Te dane eksperymentalne zidentyfikowały drogę dostarczania komórek jako jedną z głównych przeszkód w terapii regeneracyjnymi komórkami macierzystymi w chorobach mózgu, która wymaga pilnej oceny. Przeszczep intraparenchymalnych komórek macierzystych stanowi logiczne podejście do tych patologii, które charakteryzują się izolowanymi i dostępnymi zmianami w mózgu, takimi jak urazy rdzenia kręgowego i choroba Parkinsona. Niestety, zasada ta nie ma zastosowania w przypadku schorzeń charakteryzujących się wieloogniskowym, zapalnym i rozsianym (zarówno w czasie, jak i przestrzeni), w tym stwardnienia rozsianego (SM). W związku z tym celowanie w mózg poprzez ogólnoustrojowe dostarczanie NPC stało się mało inwazyjnym i skutecznym terapeutycznie protokołem dostarczania komórek do mózgu i rdzenia kręgowego gryzoni i naczelnych innych niż ludzie dotkniętych eksperymentalnym przewlekłym uszkodzeniem zapalnym ośrodkowego układu nerwowego (OUN).

Ta alternatywna metoda dostarczania komórek opiera się na patotropizmie NPC, a konkretnie na ich wrodzonej zdolności do (i) wyczuwania otoczenia za pomocą funkcjonalnych cząsteczek adhezyjnych komórek oraz zapalnych receptorów cytokin i chemokin; (ii) przekroczyć nieszczelne bariery anatomiczne po wstrzyknięciu dożylnym (i.v.) lub domózgowym (i.c.v.); (iii) kumulują się na poziomie wielu miejsc okołonaczyniowych zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego; oraz (iv) wywierają niezwykłe efekty troficzne i regulacyjne immunologiczne na różne komórki docelowe gospodarza in vivo.

Tutaj opisujemy metody, które opracowaliśmy dla dostarczania dożylnie i i.c.v. syngenicznych NPC u myszy z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia (EAE), jako model przewlekłej demielinizacji zapalnej OUN, i przewidujemy systemiczne dostarczanie komórek macierzystych jako cenną technikę selektywnego kierowania na mózg w stanie zapalnym w neurologii regeneracyjnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z badań in vivo powstały mocne dowody potwierdzające skuteczność terapeutyczną przeszczepu somatycznych nerwowych komórek macierzystych/prekursorowych (NPC) w modelach zwierzęcych zaburzeń OUN1-8. Niemniej jednak szereg kwestii związanych z dostarczaniem komórek macierzystych do gospodarza wymaga starannego rozważenia, zanim wyniki tych eksperymentów będzie można przełożyć na zastosowania kliniczne. Szczególnie istotną przeszkodą na drodze do rozwoju (niehematopoetycznych) terapii regenerującymi komórkami macierzystymi w wieloogniskowych, przewlekłych chorobach zapalnych mózgu jest określenie idealnej drogi iniekcji NPC. Dokładne zrozumienie patofizjologii choroby docelowej (ogniskowej lub wieloogniskowej; pierwotna choroba zapalna lub pierwotna choroba zwyrodnieniowa) oraz ostrożna analiza wykonalności i kwestii ryzyka związanych z technikami dostarczania są w identyfikacji optymalnego protokołu dostarczania komórek macierzystych.

Podczas gdy ogniskowy (np. do miąższu układu nerwowego) przeszczep komórek macierzystych jest logicznym podejściem do leczenia chorób OUN charakteryzujących się przestrzennie ograniczonymi obszarami uszkodzeń (np. choroba Parkinsona i Huntingtona, urazy mózgu i rdzenia kręgowego oraz udar), to samo podejście może okazać się praktycznie niewykonalne w stanach takich jak stwardnienie rozsiane, gdzie wieloogniskowe, przewlekłe i przestrzennie rozproszone uszkodzenie OUN kumuluje się z czasem. W tym ostatnim przypadku ukierunkowanie iniekcji komórek ogniskowych na poszczególne zmiany chorobowe jest również utrudnione ze względu na ograniczoną zdolność przeszczepionych NPC do migracji na duże odległości w obrębie miąższu OUN, co skłania do identyfikacji alternatywnych, bardziej odpowiednich metod celowania w OUN z mniej inwazyjnymi przeszczepami NPC.

Wielka obietnica wynikała z obserwacji, że NPC celują w nowotwór wewnątrzczaszkowy (np. glejak) u myszy, gdy wstrzykuje się go donaczyniowo poza OUN9. W związku z tymi przełomowymi dowodami in vivo na patotrofizm komórek macierzystych10 zgromadzono obszerne dane dotyczące wykonalności i skuteczności terapeutycznej ogólnoustrojowego przeszczepiania NPC u zwierząt laboratoryjnych z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), jako modelu zapalnego uszkodzenia OUN, za pomocą dożylnego (iv) lub domózgowo-komorowego (i.c.v.) Wstrzyknięcie NPC1,2,5,6,8.. Po raz pierwszy wykazaliśmy, że zależy to od zdolności przeszczepionych NPC do celowania i wnikania do zapalnego OUN, a następnie do angażowania wielu programów komunikacji międzykomórkowej w określonych mikrośrodowiskach in vivo11. W celu specyficznego celowania w OUN, NPC są dostarczane bezpośrednio do krążenia płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) przez wstrzyknięcie dożylne lub do krwiobiegu przez wstrzyknięcie dożylne. Po dostaniu się do krwiobiegu lub płynu mózgowo-rdzeniowego przeszczepione NPC aktywnie oddziałują z barierami krew-mózg (BBB) lub płyn mózgowo-rdzeniowy krwi (BCSFB) i dostają się do miąższu OUN. Ta interakcja między przeszczepem NPC a BBB (lub BCSFB) jest regulowana przez specyficzny zestaw cząsteczek adhezyjnych komórek powierzchniowych NPC (CAM) i ułatwiana przez ekspresję wysokich poziomów przeciwligandów CAM na aktywowanych komórkach śródbłonka / wyściółki12-14. Przykładami tych CAM są receptor hialuronianu, CD44, oraz międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna (ICAM)-1 ligand bardzo późny antygen (VLA)-45,15,16 (które w leukocytach są odpowiedzialne za interakcję z aktywowanymi komórkami wyściółki i śródbłonka), a w znacznie mniejszym stopniu antygen związany z funkcją limfocytów (LFA)-1 i ligand glikoproteiny selektyny P (PSGL)-1. NPC wyrażają również szeroki zakres receptorów chemokin, w tym CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 i CXCR4 (ale nie wyrażają CCR3 i CCR7), które są funkcjonalnie aktywne, zarówno in vitro, jak i in vivo5,16. W związku z tym NPC, którym wstrzykuje się ogólnoustrojowo, wykorzystują te CAM, wraz z receptorem sprzężonym z białkiem G (GPCR), do akumulacji na poziomie zapalnego OUN. I odwrotnie, NPC wstrzykiwane ogólnoustrojowo zdrowym myszom nie dostają się do OUN przez drogi przestrzeni naczyniowej lub płynu mózgowo-rdzeniowego2. Zapalenie OUN lub aktywacja komórek śródbłonka/wyściółki po wstrzyknięciu cytokin ogólnoustrojowych lub lipopolisacharydów (LPS) jako model chemicznie wywołanego zapalenia mózgu jest zatem konieczne do akumulacji ogólnoustrojowo wstrzykiwanych NPC do mózgu i rdzenia kręgowego2. Tak więc skuteczne celowanie w OUN za pomocą ogólnoustrojowych terapii NPC zależy od identyfikacji specyficznego dla choroby okna Opportunity (WoO), w którym środowisko mózgu i rdzenia kręgowego sprzyja akumulacji i transśródbłonkowej migracji NPC. Takie stany występują na ogół w kontekście ostrego i podostrego zapalenia17. Wykazano, że po wejściu do OUN przeszczepione niezróżnicowane NPC poprawiają kliniczno-patologiczne cechy myszy oraz większych, niebędących ludźmi naczelnych z EAE. Opisano to jako zależne od minimalnej wymiany komórek2 i niezwykłego wydzielania immunologicznych regulacyjnych i neuroprotekcyjnych czynników parakrynnych w okołonaczyniowym OUN2,5,6,18 w porównaniu z obszarami nieobjętymi stanem zapalnymOUN 19,20 (np. węzły chłonne) w odpowiedzi na sygnalizację komórek zapalnych wywołaną przez naciekające komórki odpornościowe5.

Tutaj opisujemy kluczowe aspekty metodologiczne systemowego wstrzykiwania somatycznych NPC do mysiego modelu przewlekłego EAE. Dokładniej mówiąc, definiujemy protokoły, które ustanowiliśmy, aby (i) uzyskać, rozszerzyć i przygotować do przeszczepu somatyczne NPC ze strefy podkomorowej (SVZ) dorosłych myszy C57BL / 6; (ii) indukować przewlekłe EAE u takich myszy i (iii) przeprowadzać terapeutycznie skuteczne ogólnoustrojowe (i.v. lub i.c.v) przeszczepienie NPC myszom EAE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt są wykonywane zgodnie z zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi, zatwierdzonymi przez brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych na mocy ustawy o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 roku (PPL nr 80/2457 do SP).

1. Wyprowadzenie somatycznych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych (NPC) ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłych myszy

  1. Przygotowanie narzędzi i pożywek preparacyjnych
    Uwaga: Te dwa roztwory należy przygotować na 1-2 godziny przed przygotowaniem narzędzi do sekcji i wstępnie podgrzać w temperaturze 37 ºC co najmniej 20-30 minut przed użyciem (pomaga to rozcieńczyć papainę i optymalizuje aktywność enzymów).
    1. Autoklaw jedną prostą ostrą nożycę, jedną małą nożyczkę chirurgiczną i dwie małe zakrzywione ząbkowane kleszcze.
    2. Roztwór do wytrawiania: Przygotować dwie oddzielne probówki o pojemności 50 ml z:
      Roztwór #1: 25 ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) + 10 mg kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) + 10 mg L-cysteiny; oraz
      Roztwór #2: 25 ml EBSS + 50 mg papainy.
    3. Przygotuj "Kompletną pożywkę wzrostową" (CGM): kompletną pożywkę podstawową dla myszy z suplementami proliferacyjnymi u myszy, heparyną 0,002%, podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF; 10 ng/ml), naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF; 20 ng/ml) i antybiotykami (Pen/Strep).
  2. Sekcja mózgu
    Uwaga: Usunięcie kości skroniowych może łatwo uszkodzić tkankę ze względu na ich ostrość. Aby tego uniknąć, mocno zabezpiecz kości kleszczami i wyciągnij, aż cała kość zostanie usunięta.
    1. Na każde przygotowanie NPC należy usunąć przez zwichnięcie szyjki macicy n = 5-7, 4-8 tygodniowe myszy C57BL/6.
    2. Oczyść 70% etanolem (w wodzie) sierść zabitych myszy i przytnij za uszami prostymi, ostrymi nożyczkami, aby usunąć głowę;
    3. Wykonaj nacięcie w linii środkowej za pomocą małych nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć skórę nad czaszką. Za pomocą kleszczy złóż dwa płaty skóry, aby odsłonić czaszkę.
    4. Za pomocą małych nożyczek chirurgicznych wykonaj dwa małe nacięcia u podstawy czaszki i usuń kości pod mostem/rdzeniem (brzuszna czaszka). Kontynuuj, wyciągając kości skroniowe. Tymi samymi nożyczkami wykonaj cięcie wzdłuż czaszki, zaczynając od podstawy do cebulek, nie uszkadzając powierzchni mózgu. Wykonaj również cięcie między kośćmi czołowymi a oczami, aby ułatwić usunięcie kości ciemieniowych. Za pomocą dwóch kleszczy rozpocznij usuwanie czaszki, ciągnąc każdą z kości ciemieniowych na zewnątrz. Podczas ciągnięcia zwróć uwagę na opony mózgowe, które mogą uszkodzić mózg podczas usuwania kości.
    5. Po usunięciu czaszki wsuń kleszcze między mózg a czaszkę, aby całkowicie odłączyć pozostawione opony mózgowe. Delikatnie unieś mózg z czaszki. Przetnij nerwy wzrokowe, aby uwolnić mózg i na koniec zbierz mózg w probówce z zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
    6. Trzymaj probówkę na lodzie i powtórz tę samą procedurę dla wszystkich myszy.
  3. Rozwarstwienie SVZ, testy tworzenia i utrzymywania neurosfery
    Średnia liczba komórek x współczynnik rozcieńczenia x 104

    Gdzie 104 oznacza przeliczenie całkowitej objętości komory hematocytometru (całkowita objętość = 0,1 mm3 -> 10-4 cm3 -> 10-4 ml). Rozważając współczynnik rozcieńczenia, należy wziąć pod uwagę zarówno ten wykonany za pomocą CGM, jak i ten wykonany z barwieniem przyżyciowym. Na przykład, jeśli 160 komórek zostało policzonych w 4 kwadratach narożnych, końcowa gęstość (komórki/ml) zawiesiny komórek wyniesie:

    160/4 x 5 (rozcieńczenie z CGM) x 2 (rozcieńczenie z barwieniem życiodajnym) x 104
    1. Włącz okap sekcyjny wyposażony w mikroskop preparacyjny.
    2. Oczyść wszystkie powierzchnie 70% etanolem (w wodzie) i spryskaj roztworem anty Mycoplasma, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.
    3. Przykryj dno zlewki sterylną gazą (w celu zachowania zaostrzonych narzędzi) i napełnij ją 70% etanolem (w wodzie). Namocz w zlewce dwie pary kleszczy, jedną parę mikronożyczek i ostrze chirurgiczne.
    4. Umieść cały mózg na matrycy fragmentatora mózgu.
    5. Używając dwóch żyletek, wykonaj przekrój koronalny w odległości 2 mm od przedniego bieguna mózgu, z wyłączeniem dróg wzrokowych, i 3 mm za poprzednim cięciem, a następnie umieść tkankę na czystej szalce Petriego.
    6. Pod mikroskopem preparacyjnym wyizoluj tkankę SVZ i pokrój na 1 mm3 kawałki za pomocą nożyczek do irydektomii. Powtórz dla wszystkich mózgów.
      1. Dobrze wymieszać oba roztwory (sekcja 1.1.2) powyżej i przefiltrować przez filtr 0,22 μm natychmiast po rozbiorze mózgów i przygotowaniu SVZ do strawienia.
    7. Przenieść skrawki do 30 ml roztworu "do wytrawiania", delikatnie zawiesić pipetą o pojemności 10 ml i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Co 15 minut delikatnie potrząsaj rurką 2-3 razy.
    8. Wirować przy 300 x g przez 10 min.
    9. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl CGM, pipetując najpierw pipetą P1000, a następnie pipetą P200 (10-20 razy każda), aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.
    10. Pobrać zawiesinę do 5 ml za pomocą CGM i przenieść do kolby T25 cm2.
    11. Po 5-7 dniach utworzą się neurosfery in vitro (DIV). Zebrać zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przez 10 minut przy 150 x g.
    12. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl CGM.
      Dysocjuj neurosfery mechanicznie, pasując komórki 100-150x za pomocą pipety P200, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki i pobrania jej do 1 ml za pomocą CGM.
    13. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową, np. 10 μl zawiesiny komórek w 40 μl CGM w celu uzyskania rozcieńczenia 1:5 i dobrze wymieszać. Zmieszać 10 μl zawiesiny rozcieńczonych komórek z 10 μl barwnika przyżyciowego i dobrze wymieszać.
    14. Napełnij komorę zliczania hemocytometrów 10 μl zawiesiny komórek 1:1: roztworu barwienia żywotnego. Osobno policz liczbę żywych (białych) i martwych (niebieskich) komórek w 4 kwadratach narożnych. Aby określić liczbę komórek/ml, zastosuj następujące obliczenia:
    15. Zawiesić 2 x 10,5 komórek w 5 ml CGM i przenieść do kolby T25 cm2;
    16. Powtórz sekcje 1.3.11-1.3.12 co 4-5 działek. Począwszy od drugiego etapu ekspansji, oceń żywotność komórek poprzez wykluczenie barwienia życiowego i zacznij budować ciągłą krzywą wzrostu poprzez posiewanie NPC o gęstości klonalnej (8000 komórek / cm2), jak opisano21. Zachowaj numery komórek i powtarzaj procedurę co 4-5 działek. Aby wygenerować ciągłą krzywą wzrostu, wykonaj następujące czynności:
      Uwaga: Aby mieć dobre przygotowanie komórek, po 4-5 kulach DIV powinny one osiągnąć średnicę 150-200 μm. Aby dobrze oszacować gęstość komórek, ważne jest znalezienie optymalnego współczynnika rozcieńczenia, aby mieć dobrze rozmieszczone, nienakładające się na siebie komórki w całym hematocytometrze. Idealnie, powinno być łącznie od 50 do 200 komórek. Podczas liczenia należy wziąć pod uwagę tylko komórki znajdujące się w kwadracie bez dotykania granic. Również żywotność komórek jest kluczowym czynnikiem wpływającym na zdrowy preparat. Co ważne, powinna być ona większa niż 90%. Liniowa krzywa wzrostu jest kolejnym wskaźnikiem zdrowego przygotowania komórek.
      1. Policz liczbę żywych i martwych komórek (np. 1,3 x 106).
      2. Zdefiniować szybkość wzrostu, dzieląc liczbę żywych komórek przez liczbę posianych komórek (np. 1,3 x 106/2 x 105 = 6,5).
      3. Oblicz całkowitą liczbę komórek, mnożąc szybkość wzrostu przez całkowitą liczbę komórek obecnych w poprzednim punkcie czasowym (na początku = 2 x 105).
      4. Zgłoś średnią ± odchylenie standardowe, aby utworzyć liniową linię trendu.
    17. Począwszy od przejścia 6, dysocjacja mechaniczna jest zastępowana dysocjacją enzymatyczną. Po odwirowaniu przy 150 x g przez 10 minut, usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 200 μl roztworu dysocjacji agregatu komórkowego, ponownie zawiesić 7-8x za pomocą P200 i inkubować 10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    18. Ponownie zawiesić 7-8 razy za pomocą P200, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową i dodać 800 μl CGM. Policz komórki (zarówno żywe, jak i martwe) i ustal ich żywotność. Zawiesić 2 x 105 komórek w 5 ml CGM i przenieść do kolby T25 cm2.
  4. Transdukcja wirusowa NPC do śledzenia komórek in vivo
    Uwaga: Aby zweryfikować skuteczność transdukcji wirusa, zbuduj równoległą krzywą wzrostu z transdukowanymi i nietransdukowanymi NPC. Ponadto wydajność klonalna, czyli bezwzględna liczba komórek tworzących neurosferę obecnych w preparacie komórkowym lub analizie cyklu komórkowego na podstawie zawartości DNA (z jodkiem propidyny, PI), może być wykorzystana jako dalsze wskaźniki stanu komórki. Jeśli odsetek zakażonych komórek nie jest dobry, protokół transdukcji wirusa można powtórzyć po raz drugi z tą samą populacją komórek. Gdy poziom infekcji jest zadowalający, a krzywa wzrostu jest podobna do tej uzyskanej w przypadku komórek typu dzikiego, transdukowane NPC mogą być namnażane i/lub przeszczepiane.
    1. Zbierz neurosfery i uzyskaj zawiesinę pojedynczej komórki. Umieścić komórki w wysokiej gęstości (1,5 x 10,6 komórek w kolbie T75 cm2) w 10 ml CGM.
    2. Po 12 godzinach dodać 3 x 106 T.U./ml wektora lentiwirusowego trzeciej generacji pRRLsin. PPT-hCMV zmodyfikowany za pomocą β-galaktozydazy pochodzącej z E. coli (lacZ) lub z białkiem zielonej fluorescencji (GFP).
    3. 48 godzin później zbierz komórki, odwiruj przy 300 x g przez 10 minut i ponownie plateruj komórki w stosunku 1:1.
    4. Po 3 pasażach in vitro zweryfikować skuteczność infekcji. Cytometria przepływowa jest powszechnie stosowana do badania skuteczności infekcji, a powszechnie przyjmuje się, że zadowalający poziom infekcji mieści się w zakresie 75-95% komórek dodatnich. Sprawdź ponownie skuteczność infekcji po 3 kolejnych przejściach ekspansji, aby zweryfikować utrzymanie wyrażenia markera.
  5. Zamrożenie neurosfery
    1. Zebrać neurosfery z kolby T25cm2, odwirować przy 300 x g przez 10 minut i wyrzucić supernatant.
    2. Zawiesić osad z 1 ml pożywki zamrażającej (CGM z 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO).
    3. Umieścić kriowiale w temperaturze -80 °C w pojemniku do zamrażania.
    4. Po upływie co najmniej 24 godzin przenieść komórki do krioboxa i przechowywać w temperaturze -80 °C przez miesiące lub doprowadzić do ciekłego azotu (N2) w celu dłuższego przechowywania.
  6. Neurosfera rozmrażania
    Uwaga: Aby uniknąć toksycznych skutków długotrwałego kontaktu NPC z DMSO, proces rozmrażania musi być tak szybki, jak to możliwe.
    1. Wyjąć kriowial z -80 °C/N2 i przechowywać go na suchym lodzie.
    2. Szybko rozmrozić fiolkę na łaźni wodnej, aż prawie cała zawiesina komórkowa zostanie rozmrożona i pozostanie tylko mały kawałek mrożonej zawiesiny.
    3. Zawiesić zawiesinę komórkową w 5 ml podgrzanego świeżego CGM.
    4. Wirować przy 300 x g przez 10 min.
    5. Usunąć sklarowany nad osadem, delikatnie zawiesić z 5 ml świeżego CGM i umieścić zawiesinę komórek w czystej, niepoddanej obróbce kolbieT25 cm 2.
  7. 1.7) Charakterystyka NPC
    Uwaga: Ostatnie pranie PBS można zastąpić 0,05% azydkiem sodu-PBS, aby zapobiec rozwojowi grzybów lub zanieczyszczeniom, a szkiełka nakrywkowe są przechowywane w temperaturze 4 °C przez 2-3 tygodnie.

    Uwaga: Aby wybarwić markery wewnątrzkomórkowe, dodaj środek przepuszczalny do PBS w roztworze blokującym. Jeżeli źródłem przeciwciała pierwszorzędowego jest koza, należy użyć albuminy surowicy bydlęcej (BSA) lub surowicy innej niż kozia.

    Uwaga: Aby wybarwić markery wewnątrzkomórkowe, należy użyć środka przepuszczalnego w roztworze przeciwciała pierwotnego.
    1. Umieść szkiełko nakrywkowe o średnicy 13 mm na dnie płytki 24-dołkowej. Dodaj 150 μl roztworu powlekającego na wierzch każdego szkiełka nakrywkowego, aby uzyskać małą kroplę. Inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    2. Zbierz neurosfery i zdysocjuj, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
    3. Policz żywe komórki i rozcieńcz do uzyskania 80 000 komórek/35 μl. Usuń nadmiar roztworu powlekającego z szkiełka nakrywkowego przez delikatne zasysanie i umieść 35 μl zawiesiny komórek.
    4. Inkubować przez 25 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Szybko sprawdź pod mikroskopem fazy kontrastu, czy komórki zaczęły przylegać.
    5. Przygotować pożywkę różnicującą, mieszając podstawową pożywkę mysią z odpowiednimi suplementami (patrz Tabela 1) i antybiotykami (Pen/Strep).
    6. Dodać 400 μl pożywki różnicującej i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    7. Po 3 DIV zmień połowę pożywki na świeżą pożywkę różnicującą.
    8. Po 6 DIV usunąć podłoże i przemyć raz PBS. Pod kapturem chemicznym usuń PBS i dodaj 300 μl podgrzanego 4% paraformaldehydu (PFA) 4% sacharozy. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Usuń PFA i umyj 3x PBS.
    9. Aby kontynuować immunocytochemię, usuń PBS i zablokuj PBS 10% normalną kozią surowicą (NGS) (roztwór blokujący) i inkubuj 1 godzinę w RT.
    10. Usunąć roztwór blokujący i dodać żądane przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone PBS 1% NGS. Inkubować w temperaturze 4 °C O/N lub, alternatywnie, 120 minut w temperaturze pokojowej.
    11. Po inkubacji przemyć 2x PBS. Inkubować z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym PBS 1%NGS. Inkubować 60 minut w RT.
    12. Przemyć 2x PBS i przeciwbarwić jądra 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) rozcieńczonym w stosunku 1:20 000 środkiem przepuszczalnym PBS przez 3 minuty w temperaturze RT w ciemności. Przemyć dwukrotnie PBS i raz wodą destylowaną.
    13. Umieść kroplę podłoża montażowego na szkiełku z bibuły szklanej i za pomocą kleszczyków zamontuj szkiełko nakrywkowe tak, aby komórki były skierowane w stronę podłoża montażowego. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby wycisnąć nadmiar medium montażowego. Szkiełko nakrywkowe pozostawić w ciemności w temperaturze pokojowej do czasu wyschnięcia podłoża montażowego i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Eksperymentalna autoimmunizacja wywołana glikoproteiną oligodendrocytów mieliny (MOG) u myszy C57Bl/6

  1. Przygotowanie emulsji
    1. Na szklanej zlewce przygotować emulsję złożoną z niekompletnego adiuwantu Freunda, zawierającą 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosis [inaczej określanego jako kompletny adiuwant Freunda (CFA)] i 200 μg MOG (peptyd 35-55), biorąc pod uwagę, że całkowita ilość emulsji na mysz wyniesie 300 μl.
      Uwaga: Odpowiednie kontrole myszy uodpornionych MOG w CFA to myszy uodpornione tylko CFA. Oczekiwana wariancja początku choroby u myszy uodpornionych na MOG wynosi 11,3 (±1,8) dpi.

      Uwaga: Obliczając całkowitą objętość potrzebnej emulsji, weź pod uwagę dwa razy większą objętość niż liczba myszy do uodpornienia. Szkło powinno być preferowane zamiast wyrobów z tworzyw sztucznych, aby zminimalizować marnotrawstwo części emulsji.
      1. Za pomocą szklanej strzykawki z igłą o sile 19 g zmiksuj miksturę przez około 30 minut, zawsze trzymając emulsję na lodzie.
      2. Aby sprawdzić, czy emulsja jest gotowa, upuść niewielką ilość emulsji na wodę. Emulsja jest gotowa do wstrzyknięcia tylko wtedy, gdy kropla pozostaje bez zmian i nie ulega dyspersji.
      3. Uodpornić grupę kontrolną myszy tylko za pomocą CFA. Leczenie myszy eksperymentalnych (immunizowanych MOG) za pomocą MOG w CFA. Oczekiwana wariancja początku choroby u myszy zaszczepionych MOG wynosi 11,3 (±1,8) dpi.
    2. Przenieść igłę 19 G do plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml i odessać emulsję. Należy unikać pęcherzyków powietrza, wymienić igłę na 25 G i pozostawić strzykawkę na lodzie. Strzykawki wypełnione emulsją są gotowe do użycia i powinny być przechowywane na lodzie przez kilka godzin.
  2. immunizacja
    1. Umieść myszy (6-8 tygodni, samica) w pudełku do podgrzewania i odczekaj około 10 minut, aby żyła ogonowa mogła się rozszerzyć.
    2. Przenieś jedną mysz z pudełka do podgrzewania do urządzenia do ograniczania myszy. Zamknij ogranicznik, aby uniknąć jakiegokolwiek ruchu myszy.
    3. Napełnij strzykawkę insulinową o pojemności 1 ml 100 μl toksyny krztuścowej (5 μg/ml), unikając tworzenia pęcherzyków. Powoli wstrzyknąć roztwór do żyły ogonowej. Wyjąć igłę i docisnąć przez kilka sekund kawałkiem papieru, aby zatamować krwawienie.
    4. Umieść mysz z powrotem w klatce i powtórz tę samą procedurę dla wszystkich myszy.
    5. Znieczulić mysz za pomocą ciągłej inhalacji izofluranu (1-2%, 2 l/min) i wstrzyknąć 100 μl emulsji podskórnie na poziomie dwóch boków i podstawy ogona (300 μl emulsji/mysz). Powoli wyjmować strzykawkę, unikając wycieku emulsji.
    6. Oznacz mysz dziurkaczem do uszu, umieść myszy w klatce i sprawdź, aż do pełnego wyzdrowienia. Powtórz tę czynność dla wszystkich myszy.
    7. Po 48 godzinach (2 dni po szczepieniu, dpi) powtórzyć punkt 2.2.3.
  3. Analiza behawioralna myszy EAE
    1. Zaczynając od 5 dpi, waż myszy codziennie i monitoruj ich sprawność lokomotoryczną, korzystając z systemu punktacji skali opisanego w Tabeli 1.

3. Wstrzyknięcie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych do żyły ogonowej (i.v.)

  1. Przygotowanie komórek
    1. Zbieraj neurosfery przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 10 min.
    2. Usunąć supernatant i dodać 200 μl roztworu dysocjacji agregatu komórkowego. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    3. Delikatnie zawiesić 10-12x (unikając pęcherzyków) z P200 aż do uzyskania zawiesiny jednokomórkowej i doprowadzić do 800 μl z podłożem podstawowym bez Ca2+ i Mg2+.
    4. Policzyć komórki, używając barwienia przyżyciowego do oceny żywotności komórek i rozcieńczyć zawiesinę podłożem podstawowym bez Ca2+ i Mg2+, aby uzyskać końcową gęstość 106 komórek/150 μl. Zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
  2. NPC i.v. iniekcja
    Uwaga: Idealna dysocjacja w zawiesinie pojedynczej komórki i brak pęcherzyków powietrza to dwa kluczowe aspekty, które należy wziąć pod uwagę, aby zmniejszyć ryzyko tworzenia się grudek/agregatów lub zatorów, co może skutkować niedrożnością żył i w konsekwencji śmiercią.
    1. W szczycie choroby (16-18 dpi) zważ i oceń myszy. Rozmieść myszy zgodnie z ich punktacją, aby mieć jednorodne grupy.
    2. Umieść myszy w pudełku do podgrzewania i odczekaj około 10 minut, aby żyła ogonowa mogła się rozszerzyć.
    3. Przenieś jedną mysz z pudełka do podgrzewania do urządzenia do ograniczania myszy. Zamknij ogranicznik, aby uniknąć jakiegokolwiek ruchu myszy.
    4. Napełnij strzykawkę insulinową o pojemności 1 ml 150 μl zawiesiny komórkowej i upewnij się, że wszystkie pęcherzyki zostały usunięte. Powoli wstrzyknąć roztwór do żyły ogonowej. Wyjąć igłę i docisnąć przez kilka sekund kawałkiem papieru, aby zatkać krwawienie (Rysunki 6A i 6B).
    5. Umieść mysz w klatce i sprawdź, aż dojdzie do siebie. Powtórz tę samą procedurę dla wszystkich myszy.

4. Wstrzyknięcie komórek macierzystych/progenitorowych do Cisterna Magna (i.c.v)

  1. Przygotowanie komórek
    1. Zbieraj NPC, odwirowując przy 300 x g przez 10 minut.
    2. Usunąć supernatant i dodać 200 μl roztworu dysocjacji agregatu komórkowego. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    3. Delikatnie zawiesić 10-12x z P200 aż do uzyskania zawiesiny jednokomórkowej i doprowadzić do 800 μl z podłożem podstawowym bez Ca2+ i Mg2+.
    4. Policz komórki i rozcieńcz zawiesinę podłożem podstawowym bez Ca2+ i Mg2+, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek. Zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
  2. 4.2) Wstrzyknięcie i.c.v. NPC
    1. W szczycie choroby (16-18 dpi) zważ i oceń myszy. Rozmieść myszy zgodnie z ich punktacją, aby mieć jednorodne grupy.
    2. Umieść mysz na aparacie stereotaktycznym pod ciągłym wdychaniem izofluranu (1-2%, 2 l/min). Zabezpiecz główkę myszy za pomocą nauszników. Następnie wyreguluj zarówno usta, jak i nos. Upewnij się, że główka myszy jest płaska i nieruchoma.
    3. Przetrzyj głowę myszy jodonem powidonu (PVP-I) i wykonaj nacięcie, aby przeciąć skórę w tylnej części głowy, aby odsłonić czaszkę.
    4. Za pomocą mikromanipulatora włóż końcówkę mikrolitrowej strzykawki do szczeliny między potylicą a kręgiem atlasowym przez nienaruszone mięśnie i więzadła w linii środkowej z tyłu szyi. Wygięta część igły pozostaje w ścisłym kontakcie z wewnętrzną powierzchnią potylicy na całej długości, jak opisano22.
    5. Powoli włóż igłę i odczekaj kilka sekund. Operator ma nauczyć się rozpoznawać uczucie "zaczepienia" igły o czaszkę myszy przed rozpoczęciem wstrzykiwania preparatu komórkowego. Powoli wstrzyknąć objętość komórek (w ciągu 3-5 minut). Pozostawić igłę na miejscu przez kilka dodatkowych sekund po wstrzyknięciu i powoli wyjąć strzykawkę.
    6. Zszyj skórę i umieść mysz w klatce regeneracyjnej do czasu pełnego wyzdrowienia.

5. Przetwarzanie tkanek

  1. Myszy należy głęboko znieczulić mieszaniną 0,5 ml ketaminy (100 mg/ml), 0,25 ml ksylazyny (23,32 mg/ml) i 4,25 ml sterylnej wody oraz perfuzji przezsercowej, przemywając solą fizjologiczną EDTA i utrwalając 4% PFA. Usunąć zarówno kręgosłupy, jak i mózg i umieścić przyrostek w 4% PFA przez 12 godzin w temperaturze 4 °C. Przemyć tkankę w PBS, usunąć rdzeń kręgowy z kości i pozostawić tkankę co najmniej 48 godzin w 30% sacharozie (w PBS) w temperaturze 4 °C. Zanurzyć tkanki w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i błyskawicznie zamrozić ciekłym azotem, zgodnie z opisem2.
  2. Za pomocą mikrotomu pokrój tkanki w plastry o grubości 10-12 μm.
  3. Alternatywnie, zanurz świeżą tkankę w agarozie i pokrój tkankę za pomocą wibratomu o grubości 50-80 μm.
  4. W obu przypadkach inkubować O/N w temperaturze 37 °C w roztworze 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β D-galaktopyranozydu (X-gal) w celu wykrycia jądrowej aktywności β-galaktozydazy.
  5. Pokrój skrawki zawierające komórki β-gal+ na plasterki 5 μm i podwójnie wybarwij za pomocą antyglejowego fibrylarnego białka kwaśnego (GFAP) dla astrocytów (50 μg/ml), antyneuronalnego antygenu jądrowego (NeuN) dla neuronów (1 μg/ml) i antynestyny dla niezróżnicowanych komórek nerwowych (10 μg/ml).
  6. Postępować zgodnie z opisem w sekcjach 1.7.11 i 1.7.12. W przypadku barwień wielokrotnych należy użyć przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z różnymi fluoroforami.
  7. W przypadku tkanek zawierających komórki znakowane GFP należy postępować zgodnie z opisem w krokach 5.1-5.3 i kontynuować wielokrotne barwienie.
  8. Dodaj kilka kropel podłoża montażowego do szkiełek i przykryj chusteczką nakrywkową.
  9. W przypadku skrawków wybarwionych przeciwciałami sprzężonymi z biotyną należy przygotować roztwór kompleksu biotyny awidyny (roztwór ABC, patrz tabela 2) i pozostawić w stanie wymieszania na 45 minut.
  10. Inkubować plastry przez 5 minut z 1% H2O2 w celu zablokowania aktywności endogennej peroksydazy.
  11. Umyć dwukrotnie PBS.
  12. Inkubować z roztworem ABC przez 1 godzinę w RT.
  13. Umyć dwukrotnie PBS.
  14. Inkubować z roztworem 3,3'-diaminobenzydyny i 0,3%H2O2. Monitoruj reakcję pod mikroskopem i przemyj PBS, gdy tylko plasterek zacznie brązowieć (zwykle około 5-10 minut).
  15. Przemyć dwukrotnie PBS i postępować zgodnie z opisem w kroku 5.7.

Pełna lista materiałów i odczynników znajduje się w Tabeli 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pochodzenie i charakterystyka NPC
Sekcje SVZ przeprowadza się na basenach (n = 5-7 myszy / pulę) 6-8 tygodniowych myszy C57Bl / 6 za pomocą dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej (ryc. 1A). Po kilku dniach hodowli w CGM zaczynają tworzyć się swobodnie unoszące się neurosfery (ryc. 1A i 1B). Podstawowe sfery są zbierane i mechanicznie przepuszczane co 4-5 DIV. Po pasażowaniu ustala się liczbę żywych i martwych komórek, a łączną liczbę komórek wykreśla się w celu wyge...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapie oparte na somatycznych komórkach macierzystych stają się jedną z najbardziej obiecujących strategii leczenia przewlekłych chorób zapalnych OUN, takich jak MS211. Podczas gdy mechanizmy podtrzymujące ich efekty terapeutyczne nadal wymagają pełnego wyjaśnienia, znaczący wpływ przeszczepiania NPC na różne eksperymentalne modele chorób neurodegeneracyjnych zrodził nieco prowokacyjne przekonanie, że komórki macierzyste mogą wkrótce znaleźć zastosowanie w badaniach na ludziach. Zanim jednak zaczniemy rozważa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Jaydenowi Smithowi za krytyczne recenzowanie i korektę redakcyjną manuskryptu. Prace te otrzymały wsparcie od Krajowego Towarzystwa Stwardnienia Rozsianego (NMSS, częściowe granty RG-4001-A1), Włoskiego Stowarzyszenia Stwardnienia Rozsianego (AISM, grant 2010/R/31), włoskiego Ministerstwa Zdrowia (GR08-7), Wings for Life, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach umowy o grant ERC-2010-StG nr 260511-SEM_SEM oraz 7. programu ramowego Wspólnoty Europejskiej (EC) (FP7/2007-2013) na podstawie umowy o grant n*deg; 280772- iONE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cell culture
EBSSSigmaE2888
L-CysteinSigma AldrichC7352
PapainWorthington30H11965
EDTAFisher ScientificD/0700/50
Mysz NeuroCult bazalne podłożeTechnologie komórek macierzystych05700
Suplementy proliferacyjne NeuroCultStem Cell Technologies05701
HeparynaSigmaH3393
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastówPeprotech100-18B-1000
Naskórkowy czynnik wzrostuPeprotechAF-100-15-1000
Długopis/PaciorkowiecInvitrogen1514012
Matrigel (roztwór powlekający)BD Biosciences354230
NeuroCult® Zestaw różnicujący (mysz)Technologie komórek macierzystych05704
AccumaxeBioscience00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) bez Ca i MgPAA LaboratoriesH15-011
Myco tracePAA LaboratoriesQ052-020
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD2650
Immunofluorescencja< / silna>
normalna surowica koziaPAA LaboratoriesB11-035
Glikol polietylenowy p-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)-eter fenylowySigma AldrichT8787
Mysz anty NestinAbcamab11306
Królik anty GFAPDAKO203344
Mysz anty histon H3 (fosfo S10) Abcamab14955
Królik anty MAP-2Abcamab32454
Szczur anty MBPAbD SEROTECMCA409S
Przeciwciało anty-O4, klon 81 | MAB345MilliporeMAB345
DAPIInvitrogenD1306
Rozwiązanie montażoweDAKOS3023
EAE
Freund's Adjuwant IncompleteSigma AldrichF5506
Mycobacterium tuberculosisDIFCOH37Ra
MOG(35– 55) Espikem
Lista toksyn krztuścaLaboratoria biologiczne181
Przetwarzanie tkanek
Iris nożyczki prosteNarzędzia do nauk pięknych14060-09
Kleszcze/zgięteNarzędzia do nauk pięknych11080-02
Krajalnica do mózguZivic InstrumentsBSMAS005-1
Ostrza chirurgicznePipety
P200, P1000
7762-04
Paraformaldehyd (PFA)Sigma158127
VECTASTAIN Elite ABC KitVector LaboratoriesPK-6100
Swann-Morton 324 Ketamina (Vetalar)Boehringer Ingelheim 01LC0030 Ksylazyna (Rompun)Bayer 32371 Ramka stereotaktyczna KOPF Model 900 Strzykawka Hamilton

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
  2. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, 688-694 (2003).
  3. Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia. Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).
  4. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14, 634-644 (2008).
  5. Pluchino, S., et al. Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature. 436, 266-271 (2005).
  6. Einstein, O., et al. Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis. Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).
  7. Chu, K., et al. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats. Brain Res. 1023, 213-221 (2004).
  8. Jeong, S. W., et al. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage. Stroke. 34, 2258-2263 (2003).
  9. Aboody, K. S., et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).
  10. Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. Gene therapy: can neural stem cells deliver. Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).
  11. Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).
  12. Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).
  13. Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).
  14. Butcher, E. C., Picker, L. J. Lymphocyte homing and homeostasis. Science. 272, 60-66 (1996).
  15. Rampon, C., et al. Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44. Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).
  16. Pluchino, S., et al. Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates. Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).
  17. Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells. Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).
  18. Aharonowiz, M., et al. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis. PLoS ONE. 3, e3145(2008).
  19. Pluchino, S., et al. Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function. PLoS One. 4, (2009).
  20. Einstein, O., et al. Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression. Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).
  21. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  22. Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors. Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).
  23. Constantin, G. Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy. Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).
  24. Politi, L. S., et al. Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis. Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).
  25. Melzi, R., et al. Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice. PLoS One. 5, (2010).
  26. Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, (2009).
  27. Ben-Hur, T., et al. Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells. Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).
  28. Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials. Exp. Neurol. , (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie m zgu i rdzeniawstrzykni cie do ylneizolacja strefy podkomorowejtworzenie neurosfertransdukcja wektorem wirusowymanaliza cytometrycznawstrzykni cie do y y ogonowejakumulacja kom rek oko onaczyniowychanaliza immunohistochemiczna

Powiązane artykuły