Zmodyfikowana metoda wytrącania w celu wyizolowania egzosomów moczu

Summary

Ten manuskrypt opisuje protokół izolowania egzosomów z ludzkiego moczu przy użyciu zmodyfikowanej techniki wytrącania.

Abstract

Identyfikacja biomarkerów, które pozwalają na wczesne wykrywanie chorób nerek w moczu i osoczu, jest przedmiotem aktywnego zainteresowania od kilku lat. Pęcherzyki egzosomów moczowych o wielkości 40-100 nm są uwalniane do moczu w normalnych warunkach przez komórki ze wszystkich segmentów nefronu i mogą zawierać białka, mRNA i mikroRNA reprezentatywne dla ich typu komórki. W warunkach dysfunkcji lub uszkodzenia nerek egzosomy mogą zawierać zmienione proporcje tych składników, które mogą służyć jako biomarkery choroby. Obecnie dostępnych jest kilka metod izolacji egzosomów moczu, a wcześniej przeprowadziliśmy eksperymentalne porównanie każdego z tych podejść, w tym trzy oparte na ultrawirowaniu, jedno przy użyciu koncentratora ultrafiltracji nanomembranowej, jedno przy użyciu komercyjnego odczynnika do wytrącania i jedno wykorzystujące modyfikację techniki wytrącania za pomocą odczynnika ExoQuick, który opracowaliśmy w naszym laboratorium. Odkryliśmy, że zmodyfikowana metoda wytrącania dała najwyższą wydajność cząstek egzosomów, miRNA i mRNA, dzięki czemu podejście to jest odpowiednie do izolacji egzosomów w celu późniejszego profilowania RNA. Dochodzimy do wniosku, że zmodyfikowana metoda wytrącania egzosomów stanowi szybką, skalowalną i skuteczną alternatywę dla izolacji egzosomów z moczu. W tym raporcie opisujemy naszą zmodyfikowaną technikę wytrącania przy użyciu odczynnika ExoQuick do izolowania egzosomów z ludzkiego moczu.

Introduction

Egzosomy moczu to małe wewnętrzne pęcherzyki o długości 100 nm ciał wielopęcherzykowych (MVB) pochodzące ze wszystkich typów komórek w normalnych i patologicznych warunkach w przestrzeni moczowej, w tym podocyty kłębuszkowe i komórki wyściełające systemy drenażu moczu, które wydają się być wzbogacone o miRNA^1-2. Wielu badaczy wykryło odrębne białka w egzosomach wyizolowanych z moczu osób zdrowych, a także osób z chorobami nerek i/lub chorobami systematycznymi^3-5. Egzosomy można izolować różnymi metodami, takimi jak dwuetapowe ultrawirowanie różnicowe z sacharozą^6-7 lub bez niej, połączenie filtra nanomembranowego z ultrawirowaniem^8-9 lub wytrącanie^10-11. Niedawno opracowaliśmy prostą, szybką, skalowalną i skuteczną metodę izolowania egzosomów moczu i wykrywania biomarkerów miRNA i białek¹¹. Chociaż biomarkery można wykryć w wielu różnych płynach biologicznych, mocz jest najwygodniejszym wyborem dla pacjentów z chorobami nerek i dróg moczowych, ponieważ można go uzyskać w dużych ilościach w stosunkowo nieinwazyjny sposób.

Chociaż istnieje kilka metod izolowania egzosomów moczu^6-11, najczęściej stosowaną procedurą jest ultrawirowanie różnicowe z 30% poduszką sacharozową. Chociaż metoda ta jest skuteczna, a jakość powstałych egzosomów wyizolowanych za pomocą tej procedury jest wysoka, sama technika wymaga wykwalifikowanego personelu i jest czasochłonna, wymagając kilku etapów ultrawirowania. Inne metody, takie jak filtracja i wytrącanie, zostały opracowane do izolacji egzosomów, w tym jedna, która wykorzystuje zastrzeżony odczynnik do wytrącania (tj. ExoQuick-TC: System Biosciences; Mountain View, Kalifornia). Chociaż wytrącanie przy użyciu tego odczynnika jest szybkie i stosunkowo łatwe, czystość wyizolowanych egzosomów jest niska w porównaniu z metodą ultrawirowania. Niedawno porównaliśmy sześć metod izolacji egzosomów moczu, w tym modyfikację metody wytrącania za pomocą ExoQuick-TC, którą opracowaliśmy w naszym laboratorium¹¹. Odkryliśmy, że ta zmodyfikowana metoda wytrącania dawała większe ilości białka, miRNA i mRNA, a sama procedura była szybsza i łatwiejsza do wdrożenia niż ultrawirowanie. W tym miejscu opisujemy protokół eksperymentalny naszej zmodyfikowanej metody wytrącania w sposób krokowy i zawieramy omówienie zalet i wad tej techniki w porównaniu z innymi metodami izolacji egzosomów. Zmodyfikowana metoda wytrącania polega na początkowym wytrącaniu cząstek egzosomu, a następnie usuwaniu białka Tamm-Horsfall, które jest skorelowane z białkami egzosomalnymi i o którym wiadomo, że zmniejsza wydajność egzosomów z moczu. Odkryliśmy, że te modyfikacje zwiększyły wydajność i czystość preparatu egzosomalnego z moczu.

Protocol

UWAGA: Etapy związane z izolacją egzosomów moczu przy użyciu zmodyfikowanej metody wytrącania są zilustrowane na rysunku 1. Początkowe etapy polegają na usunięciu dużych martwych komórek i resztek komórkowych poprzez odwirowanie. Końcowy osad uzyskany z supernatantu pobranego z każdego kolejnego etapu odpowiada egzosomowi, który rozpuszcza się w roztworze izolacyjnym w celu dalszej ekstrakcji białka, RNA i DNA.

1. Zbieranie moczu

1. Przed pobraniem moczu należy przygotować koktajl inhibitorów proteazy zgodnie z zaleceniami producenta i dodać 3,125 ml tego koktajlu do pustego sterylnego pojemnika. Probówka zawierająca koktajl inhibitorów proteazy może być następnie rozdana ochotnikom w celu pobrania moczu.
   UWAGA: Powodem dodania inhibitora proteazy jest zminimalizowanie degradacji białka w próbce moczu. Chociaż specjalnie użyliśmy koktajlu inhibitorów proteazy firmy Sigma, inne dostępne na rynku inhibitory proteazy można zastąpić.
2. Zebrać około 10 ml moczu z pierwszej mikcji. Przetwarzaj mocz natychmiast po pobraniu bez przechowywania lub chłodzenia. Wyizolować egzosomy moczu w dwóch egzemplarzach przy użyciu zmodyfikowanej metody wytrącania; jeden z duplikatów służy do ekstrakcji DNA, całkowitego RNA i białek, podczas gdy drugi służy do ilościowego oznaczania cząstek egzosomów w moczu.
   UWAGA: Próbkę moczu można pobrać w ciągu 24 godzin w celu izolacji egzosomu poprzez przechowywanie w temperaturze 4 °C.

2. Usuwanie resztek komórkowych i białka Tamm-Horsfall (THP)

1. Przenieść próbki moczu do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Odwirować 10 ml moczu o sile 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 37 °C w celu wyeliminowania komórek i resztek komórkowych (ryc. 1).
2. Za pomocą pipety przenieść supernatant do świeżej probówki w celu dalszego przetwarzania. Zawiesić osad w 500 μl roztworu izolacyjnego (250 mM sacharozy, 10 mM trietanoloaminy, pH 7,6), a następnie przeprowadzić 10-minutową inkubację z DL-ditiotreitolem (DTT: stężenie końcowe 200 mg/ml) w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: DTT jest dodawany w celu degradacji THP, który zatrzymuje egzosomy, prowadząc do zmniejszenia wydajności. Należy upewnić się, że osad nie został naruszony podczas przenoszenia supernatantu i upewnić się, że supernatant jest wolny od osadu.
3. Próbki granulek wirowych należy pobierać co 2 minuty, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu. Następnie do rozpuszczonego osadu dodać 500 μl roztworu izolacyjnego.
4. Natychmiast po dodaniu roztworu izolacyjnego do osadu, odwirować przy 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Odpipetować supernatant i połączyć z pobranym wcześniej supernatantem.
5. Zawiesić osad w 50 μl roztworu izolacyjnego do analizy SDS-PAGE.
   UWAGA: PBS lub TBS mogą być używane zamiast roztworu izolacyjnego do ponownego zawieszenia osadu.

3. Izolacja osadu egzosomu

1. Do 11 ml zebranego supernatantu dodać 3,3 ml odczynnika ExoQuick-TC i inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 12 godzin.
   UWAGA: Stosunek objętości supernatantu do odczynnika ExoQuick-TC można dostosować w celu zwiększenia lub zmniejszenia wydajności egzosomalnej. Zaobserwowaliśmy, że mniejsze objętości dodanego odczynnika powodują mniejszą wydajność egzosomów.
2. Po inkubacji odwirować próbkę i mieszaninę ExoQuick-TC przy 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 25 °C.
3. Przenieść supernatant do nowej probówki w celu analizy SDS-PAGE.
4. Osad egzosomu może być przechowywany w temperaturze -80 °C w celu ekstrakcji DNA, RNA i białek oraz ilościowego oznaczania cząstek egzosomu za pomocą CD9 ELISA¹¹,
   UWAGA: Granulat egzosomu można przechowywać w temperaturze -80 °C przez 1 rok z ograniczonym zamrażaniem i rozmrażaniem.

4. Wykrywanie i analiza biomarkerów osadu egzosomu

1. Do dalszych analiz należy wyekstrahować DNA, RNA i białko z osadu egzosomu za pomocą zestawu do izolacji DNA/RNA/białka i zestawu do izolacji RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Oznaczyć stężenia za pomocą spektrofotometru Nanodrop, mierząc absorbancję przy 260 i 280 nm z 2 μl próbki.
2. Wykonaj ilościowe testy RT-PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) przy użyciu testów mikroRNA TaqMan (w naszym przypadku użyliśmy ludzkich testów specyficznych dla miR-192 i miR-1207-5p) lub starterów specyficznych dla miRNA.
3. Do analizy SDS-PAGE należy użyć 4-12% żelu Bis-Tris i oddzielić próbki białek za pomocą jednowymiarowej elektroforezy. Wizualizację żeli za pomocą zestawu do barwienia srebra zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Przeprowadzić analizę western blot przy użyciu membran PVDF zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta. Użyj króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciwko białku X oddziałującemu z genem 2 sprzężonym z apoptozą lub ALIX oraz mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko białku genu podatności na nowotwór 101 lub TSG101 w wykrywaniu western blot. Określ ilościowo gęstość pasm za pomocą otwartego oprogramowania NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) lub podobnego programu.
5. Określ ilościowo liczbę cząstek egzosomu moczu uzyskanych za pomocą zestawu CD9 ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.

Results

Egzosomy moczu przenoszą biomarkery białek, miRNA i mRNA wydzielane z komórek nabłonka nerkowego. Izolacja i wykrycie tych egzosomów może stanowić użyteczne narzędzie diagnostyczne do wczesnego wykrywania chorób nerek, takich jak nefropatia cukrzycowa. Istnieje kilka metod izolacji egzosomów z próbek moczu pobranych od ludzi. Wcześniej porównaliśmy sześć metod izolacji egzosomów moczu i zbadaliśmy wynikowe poziomy białka, mRNA i miRNA¹¹. Naszym celem było szczegółowe opisanie opracowanej przez nas zmodyfikowan...

Discussion

Większość metod polegających na wytrącaniu egzosomów z moczu nie zajmuje się usuwaniem sieci polimerowej utworzonej przez białko Tamm-Horsfall (THP). Białko to jest obecne w dużych ilościach w moczu, gdzie przypuszczalnie zatrzymuje egzosomy podczas początkowego wirowania na niskiej prędkości. W naszej zmodyfikowanej metodzie zredukowaliśmy THP za pomocą DTT przed wytrącaniem egzosomów. Jak pokazano na rycinie 2, większą ilość THP zaobserwowano w nieprzetworzonym moczu i osadzie, bez THP w końcowym super...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning 15 ml Probówka wirówkowa	Corning (Sigma Aldrich)	CLS430791
Koktajl inhibitorów proteazy	Sigma Aldrich	P8340
Wirówka	Sorvall
DL-ditiothreitol	Sigma Aldrich	D9779	stosowana w końcowym stężeniu 200 mg/ml
System Novex NuPAGE SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm, 10 dołków	Invitrogen		NP0321BOX Do analizy SDS-PAGE
Zestaw do wykrywania e-blottingu ECL Advance	Healthcare Life Sciences	RPN2135	Do wykrywania biomarkerów Western blot
Exoquick-TC Reagent	System Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	Do izolacji egzosomów
Kompletny zestaw Exosome CD9 ELISA Biosciences	(SBI)	EXOEL-CD9-A-1	Do oznaczania ilościowego egzosomów
AllPrep DNA/RNA/Białko mini zestaw	Qiagen	80004	Do izolacji DNA, RNA, białek
Zestaw do czyszczenia Rneasy MinElute	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 Spektrofotometr UV-Vis	Thermo Scientific		do oznaczania ilościowego białek
ProteoSilver Sliver Stain Kit	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	Do barwienia żeli
SDS-PAGESystem elektroforezy Xcell SureLock Mini-Cell	Technologie życia Do		uruchamiania żeli SDS-PAGE
Testy mikroRNA TaqMan	Life Technologies		Do testów RT-PCR
Oprogramowanie qBasePlus v1.5	Biogazelle NV		Do analizy danych z testu RT-PCR
Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko ALIX	Millipore		Do wykrywania biomarkerów
western blotMysie przeciwciało monoklonalne przeciwko TSG101	Abcam		Do wykrywania biomarkerów western blot