Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych

Summary

Tutaj opisujemy dwa testy do pomiaru aktywacji dopełniacza indukowanej przez przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom. Główną przewagą nad obecnymi testami jest ich ilościowy i łatwy w interpretacji charakter.

Abstract

Przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom (RBC) mogą prowadzić do aktywacji dopełniacza, co skutkuje przyspieszonym klirensem przez receptory dopełniacza w wątrobie (hemoliza pozanaczyniowa) lub prowadzić do wewnątrznaczyniowej lizy krwinek czerwonych. Alloprzeciwciała (np. ABO) lub autoprzeciwciała przeciwko antygenom RBC (obserwowane w autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej, AIHA) prowadzące do aktywacji dopełniacza są potencjalnie szkodliwe i mogą być - zwłaszcza gdy prowadzą do lizy wewnątrznaczyniowej - śmiertelne¹. Obecnie aktywację dopełniacza spowodowaną (auto)przeciwciałami na krwinkach czerwonych ocenia się in vitro za pomocą testu Coombsa odzwierciedlającego osadzanie się dopełniacza na krwinkach czerwonych lub nieilościowego testu hemolitycznego odzwierciedlającego lizę erytrocytów^1-4. Jednak aby ocenić skuteczność inhibitorów dopełniacza, konieczne jest posiadanie technik ilościowych. Tutaj opisujemy dwie takie techniki. Po pierwsze, przedstawiono test do wykrywania odkładania się C3 i C4 na krwinkach czerwonych, które jest indukowane przez przeciwciała w surowicy pacjenta. W tym celu stosuje się analizę FACS z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami anty-C3 lub anty-C4. Następnie opisano ilościowy test hemolityczny. W tym teście mierzy się hemolizę za pośrednictwem dopełniacza indukowaną przez surowicę pacjenta przy użyciu spektrofotometrycznej detekcji uwolnionej hemoglobiny. Oba te testy są bardzo powtarzalne i ilościowe, co ułatwia badania nad aktywacją dopełniacza indukowaną przez przeciwciała.

Introduction

Przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom (RBC) mogą być wywołane przez transfuzję krwinek czerwonych wyrażających antygen, który nie występuje na krwinkach czerwonych biorcy. Te alloprzeciwciała mogą powodować ciężkie ostre reakcje hemolityczne przetoczenia z powodu aktywacji dopełniacza po następnej transfuzji⁵. W autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej (AIHA) pacjenci mają autoprzeciwciała przeciwko własnym krwinkom czerwonym. Prowadzi to do przyspieszonego klirensu komórek poprzez oddziaływanie IgG związanych z erytrocytami z receptorami Fcγ na fagocytach w śledzionie i/lub w przypadku autoprzeciwciał zdolnych do aktywacji dopełniacza poprzez ....

Protocol

1. Przygotowanie czerwonych krwinek traktowanych bromelainą

1. Przemyć krwinki czerwone typu 0 3x 1x PBS (wirowanie przy 664 x g przez 2-5 min).
2. Inkubować 1 objętość upakowanych erytrocytów z dwiema objętościami 0,5% roztworu bromelainy przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
3. Umyj komórki 3x za pomocą 1x PBS.
4. Komórki mogą być przechowywane w postaci 3% roztworu w temperaturze 4 °C w 1x PBS przez co najmniej tydzień.

2. Analiza osadzania C3 i C4 na krwinkach czerwonych przez FACS

1. Inaktywować termicznie wymaganą ilość surowicy pacjenta (lub innego źródła przeciwciał anty-RBC) poprzez ogrz....

Results

Rysunek 2A pokazuje reprezentatywny wykres punktowy dla RBC. Odpowiednie bramkowanie dla pojedynczych RBC można zobaczyć na wykresie de FSC-W - FSC-A (P1). Zwykle około 95% erytrocytów mieści się w tej bramce P1 (pojedyncze komórki), ale gdy stosuje się wysoki procent surowicy pacjenta, może to spaść do 70-80%, zwłaszcza gdy w surowicy pacjenta obecne są IgM anty-RBC.

Reprezentatywne wyniki dla wpływu surowicy pacjenta AIHA na osadzanie się C4 są pokazane na Rysunku 2B.......

Discussion

Powyższe testy są powtarzalne i solidne. Są łatwe do wykonania i możliwe jest ich wykonanie z wieloma próbkami jednocześnie (w płytce 96-dołkowej). W związku z tym podejście to byłoby również odpowiednie dla w pełni zautomatyzowanego systemu, np. systemu robota ELISA. W przeciwieństwie do obecnie stosowanych technik, testy te mają charakter ilościowy, co pomoże m.in . w badaniu działania inhibitorów dopełniacza. Co więcej, interpretacja jest obiektywna, co stanowi poprawę w stosunku do obecnie stosowany.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Fresenius Kabi
BSA	Sigma	B-4287
Barbital	Fagron	0261	Ta substancja chemiczna podlega regulacji leków.
Sodium Barbital	Fagron	0263	Ta substancja chemiczna podlega regulacji leków.
Żelatyna	Merck	1.0470.0500
Chlorek sodu	Merck	1.06404.1000
Chlorek magnezu	Merck	1.05833.0250
Chlorek wapnia	Merck	1.0238.0500
Dylight 488 barwnik reaktywny aminowy	Pierce	46402
Dylight 650 aminowo-reaktywny barwnik	Pierce	62265
&alfa; C5 (Ekulizumab)	Alexion Pharmaceuticals
FACS (Canto)	BD		Można użyć dowolnego FACS, który ma odpowiednie lasery.
Spektrofotometr (np. Multiskan spectrum)	Thermo Labsystems	1500-193	Można użyć dowolnego spektrofotometru o odpowiednim zakresie długości fali
Oprogramowanie BD FACSDiva v 6.1.2	BD	643629	Można użyć dowolnego kompatybilnego oprogramowania do analizy FACS
Bromelaina	Sanquin	K1121