Artykuł metodologiczny

Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych

DOI:

10.3791/51161

⸱

29 stycznia 2014

 ,  , 
1Department of Immunopathology, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory Academic Medical Center, University of Amsterdam, 2Department of Hematology, Academic Medical Center, University of Amsterdam

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy dwa testy do pomiaru aktywacji dopełniacza indukowanej przez przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom. Główną przewagą nad obecnymi testami jest ich ilościowy i łatwy w interpretacji charakter.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom (RBC) mogą prowadzić do aktywacji dopełniacza, co skutkuje przyspieszonym klirensem przez receptory dopełniacza w wątrobie (hemoliza pozanaczyniowa) lub prowadzić do wewnątrznaczyniowej lizy krwinek czerwonych. Alloprzeciwciała (np. ABO) lub autoprzeciwciała przeciwko antygenom RBC (obserwowane w autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej, AIHA) prowadzące do aktywacji dopełniacza są potencjalnie szkodliwe i mogą być - zwłaszcza gdy prowadzą do lizy wewnątrznaczyniowej - śmiertelne1. Obecnie aktywację dopełniacza spowodowaną (auto)przeciwciałami na krwinkach czerwonych ocenia się in vitro za pomocą testu Coombsa odzwierciedlającego osadzanie się dopełniacza na krwinkach czerwonych lub nieilościowego testu hemolitycznego odzwierciedlającego lizę erytrocytów1-4. Jednak aby ocenić skuteczność inhibitorów dopełniacza, konieczne jest posiadanie technik ilościowych. Tutaj opisujemy dwie takie techniki. Po pierwsze, przedstawiono test do wykrywania odkładania się C3 i C4 na krwinkach czerwonych, które jest indukowane przez przeciwciała w surowicy pacjenta. W tym celu stosuje się analizę FACS z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami anty-C3 lub anty-C4. Następnie opisano ilościowy test hemolityczny. W tym teście mierzy się hemolizę za pośrednictwem dopełniacza indukowaną przez surowicę pacjenta przy użyciu spektrofotometrycznej detekcji uwolnionej hemoglobiny. Oba te testy są bardzo powtarzalne i ilościowe, co ułatwia badania nad aktywacją dopełniacza indukowaną przez przeciwciała.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom (RBC) mogą być wywołane przez transfuzję krwinek czerwonych wyrażających antygen, który nie występuje na krwinkach czerwonych biorcy. Te alloprzeciwciała mogą powodować ciężkie ostre reakcje hemolityczne przetoczenia z powodu aktywacji dopełniacza po następnej transfuzji5. W autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej (AIHA) pacjenci mają autoprzeciwciała przeciwko własnym krwinkom czerwonym. Prowadzi to do przyspieszonego klirensu komórek poprzez oddziaływanie IgG związanych z erytrocytami z receptorami Fcγ na fagocytach w śledzionie i/lub w przypadku autoprzeciwciał zdolnych do aktywacji dopełniacza poprzez receptory dopełniacza w wątrobie6,7. Piorunująca aktywacja dopełniacza prowadząca do hemolizy wewnątrznaczyniowej jest rzadka, ale często śmiertelna. Przyspieszone, zależne od dopełniacza niszczenie erytrocytów indukowane przez allo- lub autoprzeciwciała powoduje ostrą niedokrwistość, a tym samym potencjalnie śmiertelne niedotlenienie tkanek. Autoprzeciwciała w AIHA są klasyfikowane jako przeciwciała ciepłe i zimne, w zależności od optymalnej temperatury, w której wiążą się z krwinkami czerwonymi (odpowiednio 37 °C lub niższa). Ciepłe przeciwciała są zwykle izotypem IgG, a zimne przeciwciałami IgM izotypu8,9. AIHA może być wtórna np. do zaburzeń limfoproliferacyjnych, chorób tkanki łącznej, guzów litych, infekcji lub leków, ale w 50% przypadków AIHA jest idiopatyczna9.

Wykrywanie gammaglobulin (np. IgG lub IgM) i dopełniacza związanego z krwinkami czerwonymi pacjenta wykonuje się za pomocą półilościowego bezpośredniego testu antyglobulinowego (Coombs) (DAT). U pacjentów z DAT erytrocyty są inkubowane z anty-IgG lub anty-C3d. Występowanie aglutynacji RBC świadczy o obecności przyłączonych składników dopełniacza lub wiązania IgG. Wykrywanie allo- lub autoprzeciwciał w surowicy pacjenta odbywa się za pomocą pośredniego testu antyglobulinowego (IAT). W IAT testowe krwinki czerwone traktowane bromelainą są inkubowane z surowicą pacjenta, przemywane, a następnie inkubowane z anty-ludzkimi IgG. W przypadku, gdy erytrocyty zostały uczulone na anty-RBC IgG obecne w organizmie pacjenta, nastąpi aglutynacja surowicy. Przeciwciała IgM przeciwko erytrocytom bezpośrednio prowadzą do aglutynacji po inkubacji testowych krwinek czerwonych traktowanych bromelainą z surowicą pacjenta. Aglutynacja RBC w bezpośrednim teście Coombsa lub w IAT jest oceniana wizualnie albo na oko w probówce, albo przez umieszczenie próbki w małej kolumnie Sephadex oddzielającej aglutynowane i pojedyncze RBC według wielkości1.

Inną często używaną techniką pomiaru aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych jest test hemolityczny1, w którym ocenia się zdolność surowicy pacjenta do indukowania (za pośrednictwem dopełniacza) hemolizy krwinek czerwonych10 leczonych bromelainą. Test jest odnotowywany jako pozytywny, gdy supernatant po odwirowaniu jest zabarwiony na czerwono z powodu uwolnionej hemoglobiny i uważany za ujemny, jeśli pozostaje bezbarwny. Zarówno test antyglobulinowy, jak i test hemolityczny są półilościowe, ponieważ oznacza się najwyższe rozcieńczenie surowicy, w którym test jest nadal dodatni.

Test antyglobulinowy i test hemolityczny są solidnymi testami, które są rutynowo używane w diagnostyce. Ponieważ testy te są półilościowe i zależą od doświadczenia technika wykonującego test, nie nadają się do badania subtelnych różnic w aktywacji dopełniacza na erytrocytach, co jest konieczne przy ocenie skuteczności inhibitorów dopełniacza. Dlatego opracowaliśmy dwa testy ilościowe w celu określenia aktywacji dopełniacza przez (auto)przeciwciała przeciwko erytrokomórkom, które opiszemy w tym artykule.

Po pierwsze, opracowaliśmy test do pomiaru osadzania się fragmentów aktywacji dopełniacza C3 i C4 na krwinkach czerwonych (Rysunek 1A). W tym teście ludzkie erytrocyty typu 0 traktowane bromelainą inkubuje się z inaktywowaną termicznie surowicą pacjenta (źródło przeciwciał anty-RBC), świeżą surowicą AB (źródło dopełniacza) i przeciwciałem monoklonalnym anty-C5 (ekulizumab). Podczas tej inkubacji nastąpi odkładanie C3 i C4, jeśli surowica pacjenta zawiera przeciwciała anty-RBC aktywujące dopełniacz. Aby zapobiec lizie erytrocytów poprzez dalszą aktywację dopełniacza, dodaje się blokujące przeciwciało monoklonalne anty-C5. Następnie odkładanie się C3 i C4 na krwinkach czerwonych jest wykrywane przez FACS przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał monoklonalnych lub fragmentów Fab reagujących odpowiednio z C3 i C4. Bramkowanie na pojedynczych krwinkach czerwonych jest ważne dla zapewnienia wiarygodności wyników. Do zalet tej techniki należy to, że wymagana jest niewielka objętość materiału pacjenta, oceniana jest aktywacja dopełniacza na wczesnym etapie kaskady, a metoda jest powtarzalna i ilościowa. Dodatkową zaletą patrzenia zarówno na C3, jak i C4 jest to, że można dokonać rozróżnienia między aktywacją szlaku klasycznego i lektynowego (zarówno osadzanie C3, jak i C4) a alternatywną aktywacją szlaku (tylko osadzanie C3). Zastosowanie erytrocytów poddanych działaniu bromelainy zamiast nieleczonych erytrocytów zwiększa czułość testu.

Drugi test jest oparty na obecnie używanym teście hemolitycznym (Rysunek 1B). Ludzkie erytrocyty typu 0 traktowane bromelainą inkubuje się z inaktywowaną termicznie surowicą pacjenta (źródło przeciwciał anty-RBC) i świeżą surowicą AB (źródło dopełniacza). Jeśli dopełniacz jest aktywowany przez przeciwciała anty-RBC pacjenta, nastąpi zależna od dawki liza RBC, prowadząca do uwolnienia hemoglobiny. Ilość uwolnionej hemoglobiny określa się ilościowo, mierząc jej absorbancję przy 414 nm w supernatancie po odwirowaniu nienaruszonych i rozdrobnionych krwinek czerwonych. Absorbancja koreluje z ilością zaistniałej hemolizy. W przeciwieństwie do obecnie stosowanego testu, protokół ten pozwala na obiektywną, ilościową wartość hemolizy, która jest bardzo powtarzalna i niezależna od osoby interpretującej test.

Zastosowanie tych metod zostało opisane w 11, gdzie badano potencjalne zastosowanie inhibitora C1 jako inhibitora dopełniacza w AIHA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie czerwonych krwinek traktowanych bromelainą

  1. Przemyć krwinki czerwone typu 0 3x 1x PBS (wirowanie przy 664 x g przez 2-5 min).
  2. Inkubować 1 objętość upakowanych erytrocytów z dwiema objętościami 0,5% roztworu bromelainy przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Umyj komórki 3x za pomocą 1x PBS.
  4. Komórki mogą być przechowywane w postaci 3% roztworu w temperaturze 4 °C w 1x PBS przez co najmniej tydzień.

2. Analiza osadzania C3 i C4 na krwinkach czerwonych przez FACS

  1. Inaktywować termicznie wymaganą ilość surowicy pacjenta (lub innego źródła przeciwciał anty-RBC) poprzez ogrzewanie próbki przez 30 minut w temperaturze 56 °C.
  2. Przemyć erytrocyty poddane działaniu bromelainy trzykrotnie w VBG- (5 mM Veronal, 150 mM NaCl, 0,05% żelatyny pH 7,4) i ponownie zawiesić je w VBG++ (VBG-- + 2 mM MgCl2 + 10 mM CaCl2) do uzyskania 0,5% roztworu.
  3. Do okrągłej płytki z perłą szklaną (w celu prawidłowego wymieszania) odpipetować następujące składniki: 25 μl 0,5% RBC, 37,5 μl świeżej surowicy AB (źródło dopełniacza) i 37,5 μl 200 μg/ml anty-C5. Anty-C5 jest drogi i może być trudny do zdobycia. Można rozważyć użycie surowicy z niedoborem C5-/C6-/C7- lub C8 zamiast surowicy AB i anty-C5.
  4. Dodaj surowicę pacjenta na studzienkę do końcowego stężenia 0,1-33%. Skorygować różnice w stężeniu surowicy na studzienkę za pomocą inaktywowanej termicznie surowicy AB. Dodaj VBG++, aby uzyskać końcową objętość 150 μl/studzienkę. Zamknąć płytkę folią ELISA.
  5. Inkubować 1,5-2 godziny w temperaturze 37 °C, wstrząsając.
  6. Przemyć erytrocyty trzykrotnie PBS + 0,5% BSA (odwirowanie przy 664 x g przez 2 min).
  7. Dodać znakowane fluorescencyjnie przeciwciała monoklonalne anty-C3 i anty-C4 lub ich fragmenty Fab (w celu zmniejszenia aglutynacji) w PBS + 0,5% BSA do końcowego stężenia 1 μg/ml. Tutaj stosuje się specjalnie opracowane przeciwciała monoklonalne anty-C3-Alexa Fluor 488 i anty-C4-Alexa Fluor 647; wybór tych etykiet fluorescencyjnych pozwala na jednoczesne wykrywanie C3 i C4 przez FACS.
  8. Inkubować 30-45 minut w temperaturze pokojowej delikatnie wstrząsając.
  9. Umyj erytrocyty 3x PBS + 0,5% BSA.
  10. Ponownie zawiesić erytrocyty 150 μl w PBS +0,5% BSA i odpipetować je do nowej płytki (w celu pozbycia się szklanych pereł przed analizą FACS).
  11. Wykonaj analizę FACS. Oddziel pojedyncze komórki od dubletów na wykresie punktowym FSC-A; ustawić bramkę na pojedynczych RBC; wybrać odpowiedni kanał detekcji dla sygnałów fluorescencyjnych (np. FITC i APC).
  12. Określ ilościowo wyniki, korzystając z mediany intensywności fluorescencji.

Uwaga: Możliwe jest użycie kontroli izotypu (np. fluorescencyjnie znakowanej myszy anty-IL6 IgG1). Zaleca się jednak włączenie prawdziwej kontroli ujemnej, np. poprzez inkubację erytrocytów bez surowicy pacjenta (tylko surowica AB) lub bez źródła dopełniacza (inaktywowana termicznie surowica AB i inaktywowana termicznie surowica pacjenta), a następnie barwienie ich tymi samymi przeciwciałami anty-C3-Alexa Fluor 488 i anty-C4-Alexa Fluor 647. Daje to bardziej wiarygodną kontrolę niż kontrola izotypu w przypadku czerwonych krwinek12, chociaż te różne kontrole zazwyczaj dają ten sam, negatywny wynik.

3. Ilościowy test hemolityczny

  1. Inaktywować termicznie wymaganą ilość surowicy pacjenta (lub innego źródła przeciwciał anty-RBC) poprzez ogrzewanie próbki przez 30 minut w temperaturze 56 °C.
  2. Umyj RBC 3x za pomocą VBG - i raz za pomocą VBG++.
  3. Na okrągłodenną płytkę ze szklaną perłą (w celu prawidłowego wymieszania) odpipetować następujące składniki: 35 μl 3% RBC, 25 μl świeżej surowicy AB (źródło dopełniacza) i 1-50% surowicy pacjenta. Skorygować różnice w stężeniu w surowicy za pomocą inaktywowanej termicznie surowicy AB. Dodaj VBG++, aby uzyskać końcową objętość 150 μl/studzienkę. Zamknąć płytkę folią ELISA.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1,5-2 godziny z wytrząsaniem.
  5. Płytka wirowa przy 664 x g przez 5 minut ze zmniejszonym opóźnieniem (np. zwalnianie do całkowitego zatrzymania w ciągu 2-3 minut).
  6. Ostrożnie odpipetować 90 μl supernatantu na nowej płytce do mikromiareczkowania. Na tym etapie ważne jest, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza i zabraniu ze sobą nienaruszonych komórek.
  7. Zmierzyć A414/690 w odpowiednim spektrofotometrze.
  8. Wyrazić lizę jako procent lizy próbki krwinek czerwonych czystą wodą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2A pokazuje reprezentatywny wykres punktowy dla RBC. Odpowiednie bramkowanie dla pojedynczych RBC można zobaczyć na wykresie de FSC-W - FSC-A (P1). Zwykle około 95% erytrocytów mieści się w tej bramce P1 (pojedyncze komórki), ale gdy stosuje się wysoki procent surowicy pacjenta, może to spaść do 70-80%, zwłaszcza gdy w surowicy pacjenta obecne są IgM anty-RBC.

Reprezentatywne wyniki dla wpływu surowicy pacjenta AIHA na osadzanie się C4 są pokazane na Rysunku 2B...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyższe testy są powtarzalne i solidne. Są łatwe do wykonania i możliwe jest ich wykonanie z wieloma próbkami jednocześnie (w płytce 96-dołkowej). W związku z tym podejście to byłoby również odpowiednie dla w pełni zautomatyzowanego systemu, np. systemu robota ELISA. W przeciwieństwie do obecnie stosowanych technik, testy te mają charakter ilościowy, co pomoże m.in . w badaniu działania inhibitorów dopełniacza. Co więcej, interpretacja jest obiektywna, co stanowi poprawę w stosunku do obecnie stosowany...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SZ i DW otrzymują nieograniczoną dotację od Viropharma.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PBSFresenius Kabi 
BSASigmaB-4287 
BarbitalFagron0261Ta substancja chemiczna podlega regulacji leków.
Sodium BarbitalFagron0263Ta substancja chemiczna podlega regulacji leków.
ŻelatynaMerck1.0470.0500 
Chlorek soduMerck1.06404.1000 
Chlorek magnezuMerck1.05833.0250 
Chlorek wapniaMerck1.0238.0500 
Dylight 488 barwnik reaktywny aminowyPierce46402 
Dylight 650 aminowo-reaktywny barwnikPierce62265 
&alfa; C5 (Ekulizumab)Alexion Pharmaceuticals 
FACS (Canto)BDMożna użyć dowolnego FACS, który ma odpowiednie lasery.
Spektrofotometr (np. Multiskan spectrum) Thermo Labsystems1500-193Można użyć dowolnego spektrofotometru o odpowiednim zakresie długości fali
Oprogramowanie BD FACSDiva v 6.1.2BD643629Można użyć dowolnego kompatybilnego oprogramowania do analizy FACS
Bromelaina SanquinK1121 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
  2. Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
  3. Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
  4. Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
  5. Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
  6. Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
  7. Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
  8. Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
  9. Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
  10. Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
  11. Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
  12. Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Depozycja przeciwciacytometria przep ywowatest hemolitycznydetekcja C3 i C4analiza ilo ciowadetekcja spektrofotometrycznasurowica pacjentaprzeciwcia o anty C5

Powiązane artykuły