Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Streszczenie

Precyzyjna kontrola translacji mRNA jest fundamentalna dla homeostazy komórek eukariotycznych, szczególnie w odpowiedzi na stres fizjologiczny i patologiczny. Zmiany w tym programie mogą prowadzić do wzrostu uszkodzonych komórek, co jest cechą charakterystyczną rozwoju raka, lub do przedwczesnej śmierci komórek, jak to ma miejsce w chorobach neurodegeneracyjnych. Wiele z tego, co wiemy na temat molekularnych podstaw kontroli translacyjnej, uzyskano z analizy polisomów przy użyciu systemu frakcjonowania w gradiencie gęstości. Technika ta opiera się na ultrawirowaniu ekstraktów cytoplazmatycznych na liniowym gradiencie sacharozy. Po zakończeniu wirowania system umożliwia frakcjonowanie i kwantyfikację odwirowanych stref odpowiadających różnym populacjom rybosomów translujących, co pozwala uzyskać profil polisomowy. Zmiany w profilu polisomów wskazują na zmiany lub defekty w inicjacji translacji, które występują w odpowiedzi na różne rodzaje stresu. Technika ta pozwala również ocenić rolę określonych białek w inicjacji translacji oraz zmierzyć aktywność translacyjną określonych mRNA. Tutaj opisujemy nasz protokół wykonywania profili polisomów w celu oceny inicjacji translacji komórek i tkanek eukariotycznych w normalnych lub stresujących warunkach wzrostu.

Wprowadzenie

Komórki eukariotyczne nieustannie napotykają szereg szkodliwych warunków fizjologicznego i środowiskowego, które wymagają szybkiej adaptacyjnej odpowiedzi komórkowej. Reakcja komórki na stres obejmuje precyzyjną równowagę między czynnikami działającymi przeciwko przeżyciu i pro-przeżyciu. Zakłócenie tej równowagi może mieć nieodwracalne konsekwencje, prowadząc do rozwoju patologii człowieka, takich jak nowotwory i choroby neurodegeneracyjne. W pierwszym etapie reakcji na stres komórki aktywują szlaki sprzyjające przetrwaniu, które obejmują skoordynowaną kontrolę zmian w ekspresji genów na poziomie translacji mRNA.

translacja mRNA u eukariontów to złożony proces komórkowy, który obejmuje skoordynowane interakcje między czynnikami inicjacji translacji (eIF), specyficznymi białkami wiążącymi RNA (RBD) i cząsteczkami RNA¹. Translacja mRNA jest podzielona na trzy odrębne fazy: inicjację, wydłużenie i zakończenie. Chociaż wszystkie trzy fazy podlegają mechanizmom regulacyjnym, mechanizmy kontroli translacyjnej koncentrują się głównie na fazie inicjacji translacji, która w związku z tym stanowi etap ograniczający szybkość syntezy białek².

Inicjacja translacji to wysoce uporządkowany proces, który rozpoczyna się od utworzenia trójskładnikowego kompleksu eIF2a.GTP.Met-tRNA_i^Met, a następnie jego wiązania z podjednostką rybosomu 40S, co prowadzi do powstania kompleksu pre-inicjacyjnego. Kolejnym krokiem jest rekrutacja kompleksu preinicjacyjnego do mRNA, co wiąże się z aktywnością czynników inicjujących translację, takich jak eIF4F i eIF3. Utworzony w ten sposób kompleks preinicjacyjny 48S ulega specyficznym zmianom konformacyjnym, które umożliwiają tej maszynerii rozpoczęcie skanowania nieulegającego translacji regionu 5' mRNA, dopóki nie rozpozna kodonu inicjacyjnego AUG. Większość czynników inicjujących translację jest następnie uwalniana, a podjednostki 60S są rekrutowane w celu utworzenia kompleksu rybosomu 80S zdolnego do translacji, w którym to momencie rozpoczyna się synteza białek (ryc. 1). Więcej niż jeden monosom 80S może translować ten sam mRNA na raz, wytwarzając tak zwane polisomy (lub polirybosomy). Gęstość polisomów na mRNA odzwierciedla szybkość inicjacji, elongacji i terminacji, a zatem jest miarą translatowalności określonego transkryptu. Jednak profil polisomowy jest używany głównie do oceny zmian w translacji mRNA na etapie inicjacji. Tutaj użyliśmy inhibitora proteasomu jako inhibitora inicjacji translacji. Leczenie komórek nowotworowych tym lekiem indukuje reakcję stresową charakteryzującą się aktywacją kinazy stresowej o nazwie HRI, która fosforyluje czynnik inicjacji translacji eIF2a³. Fosforylacja eIF2a jest jednym z głównych zdarzeń prowadzących do zahamowania inicjacji translacji w komórkach ssaków⁴.

Protokół

Protokół jest zgodny z wytycznymi zatwierdzonymi przez Komisję Oceny Etycznej Laval.

1. Przygotowanie kultur komórkowych i manipulacja mózgiem

1. Komórki ssaków i Drosophila
   1. Hoduj komórki raka szyjki macicy HeLa i komórki embrionalne Schneider Drosophila zgodnie z zaleceniami American Type Culture Collection. Pracuj z komórkami przy niskim przejściu.
   2. Płytki komórkowej w celu osiągnięcia 80% zbieżności w dniu eksperymentu. Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj ∼12 x 10⁶ komórek dla każdego warunku eksperymentalnego. Przed przygotowaniem ekstraktów do analizy polisomów należy stymulować translację, dodając świeżą, kompletną pożywkę przez co najmniej 90 minut.
2. Izolacja mózgu: Odizoluj mózgi myszy w wieku od 9 do 16 dni po urodzeniu. Eutanazja polega na wdychaniu CO₂ po znieczuleniu i zwichnięciu szyjki macicy. Po uśmierceniu należy odizolować cały mózg i umieścić go w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio przenieść do zimnego PBS 1X w celu natychmiastowego użycia.

2. Przygotowanie systemu frakcjonowania w gradimencie gęstości

1. Myć system rurek z 0,1% SDS przez 5 minut.
2. Umyj system rurek 70% etanolem przez 5 minut, a następnie roztworem RNaseZAP przez 5 minut przed umyciem go wodą DEPC.
3. Pompować powietrze w celu wysuszenia systemu przewodów urządzenia.

3. Przygotowanie gradientów sacharozy

1. Przygotować 15% i 55% roztwory sacharozy w 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,25 mM MgCl₂, 150 mM NaCl i 1 mM DTT.
2. Wygeneruj liniowy gradient sacharozy 15-55% za pomocą formera gradientu Isco Model 160, zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Jednak ważne jest, aby dobrze kontrolować prędkość pompy perystaltycznej TRIS, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków lub turbulencji w gradientach. Utrzymuj gradienty w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
3. W czasie, gdy uruchomiony jest program do tworzenia gradientu, schłodzić ultrawirówkę do temperatury 4 °C.

4. Przygotowanie ekstraktów z komórek i mózgu myszy

1. Przygotowanie ekstraktów komórkowych
   1. Umieść płytkę (płytki) na lodzie i umyj komórki 3x zimnym PBS 1X.
   2. Zebrać komórki (∼12 x 10⁶) w 1 ml buforu do lizy (20 mM Tris-HCl o pH 7,4, 1,25 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% Nonidet P40, 5 U/ml inhibitora RNazy, uzupełnionego kompletnymi tabletkami koktajlowymi z inhibitorami proteazy bez EDTA), przenieś je do probówki Eppendorfa i dobrze wymieszaj, przepuszczając je 15 razy przez strzykawkę insulinową 1 ml U100 28 G 1/2. Pozostaw lizat komórkowy na lodzie na 15 minut.
   3. Umieść kilka kropli lizatu komórkowego na szkiełku, aby ocenić lizę komórkową, obserwując pod mikroskopem kontrastu fazowego przy użyciu obiektywu 10X. Tylko jądra komórkowe powinny być widoczne i żadne błony komórkowe nie powinny być widoczne świadczące o lizie komórek. Jako kontrolę obserwuj niezlizane komórki.
   4. Klarować lizat komórkowy przez odwirowanie w stężeniu 11 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i utrzymywać rozpuszczalny lizat zawierający polirybosomy.
2. Przygotowanie ekstraktów z mózgu myszy
   1. Homogenizować cały izolowany mózg (∼500 mg) przez 10 uderzeń w lodowatym homogenizatorze z 2 ml buforu do lizy i klarować homogenat przez odwirowanie w temperaturze 11 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Załadować otrzymany supernatant na poduszkę z 50% sacharozy i kontynuować sedymentację przez 2 godziny przy 200 000 x g za pomocą wirnika ultrawirówki TH-641 w temperaturze 4 °C.
   3. Zawiesić półprzezroczysty osad zawierający polirybosomy w 1 ml buforu do lizy i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół. Pozostaw zawieszenie na lodzie przez 30 minut przed załadowaniem na pochyłości.

5. Ładowanie ekstraktów na gradienty sacharozy i ultrawirowanie

1. Zmierzyć stężenie RNA obecnego w ekstrakcie cytoplazmatycznym za pomocą spektrofotometru. Ostrożnie i powoli załaduj ∼20 OD₂₆₀ jednostek ekstraktu na gradient sacharozy od 15% do 55%. Upewnij się, że na powierzchni probówki jest 2-3 mm wolnej przestrzeni, aby uniknąć przelania probówek podczas wirowania.
2. Odwirować gradienty za pomocą ultrawirówki przez 2 godziny 30 minut przy 230 000 x g przy użyciu wirnika ultrawirówki TH-641 w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu wirowania wyjmij probówki i ostrożnie umieść je na lodzie, aby nie naruszyć gradientów.

6. Frakcjonowanie ekstraktów cytoplazmatycznych do profilowania polisomów

1. Umieścić gradienty sacharozy w automatycznym systemie frakcjonowania gęstości i przystąpić do automatycznego frakcjonowania i zbierania frakcji (po 0,5 ml każdy), zgodnie z opisem producenta.
2. Zebrać każdą frakcję (∼500 μl) do pojedynczych probówek Eppendorfa z ciągłym monitorowaniem absorbancji przy 254 nm. Równolegle z operacją frakcjonowania gradientowego, profil polirybosomalny będzie edytowany na papierze wykresu. Alternatywnie można użyć jednostki akwizycji danych dołączonej do rejestratora wykresów, aby uzyskać elektroniczną akwizycję profilu polisomowego.
3. Na koniec każdego cyklu przenieś zebrane Eppendorfy na suchy lód. W tym czasie zebrane frakcje należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio wytrącić kompleksy białko-RNA w następujący sposób.

7. Ekstrakcja i analiza białek

1. Do każdej zebranej frakcji gradientu sacharozy dodać 2 objętości 100% zimnego etanolu i pozostawić kompleksy RNA-białko na wytrącenie się w temperaturze -20 °C przez noc.
2. Odwirować każdy osad białka RNA w temperaturze 11 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przemyć 70% etanolem. Wysuszyć i ponownie zawiesić osad w buforze próbki SDS-PAGE przed przystąpieniem do Western blot przy użyciu specyficznych przeciwciał (patrz rysunek 2).

8. Ekstrakcja i analiza RNA

1. Wytrącić kompleksy RNA-białko, jak w punkcie 7.1. Ponownie zawiesić każdy osad białka RNA w buforze do lizy zawierającym 0,1% SDS. Trawić składnik białkowy osadu za pomocą 2 mg/ml proteinazy K przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C.
2. Ekstrahować składniki RNA osadu przez dodanie 1 objętości "fenolu: chloroformu", 2 objętości chloroformu i 0,1 objętości 2 M NaOAc pH 4 i odwirowanie przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min. Wytrącić RNA z otrzymanej fazy wodnej każdej próbki przez noc w temperaturze -20 °C, dodając 1 objętość izopropanolu i 0,2 μg/μl glikogenu. Wirować osad przez 1 godzinę w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Przemyć osad RNA 70% zimnym etanolem.
3. Ponownie zawiesić osad RNA w małej objętości wody wolnej od RNAzy. Oceń ilość i jakość RNA za pomocą spektrofotometru.

Wyniki

Jak wspomniano wyżej, profil polisomów pozwala na analizę zmian inicjacji translacji w warunkach stresu. Rysunek 1 przedstawia uproszczony pogląd na inicjację translacji, która, jak opisano wcześniej, jest procesem wieloetapowym obejmującym uporządkowany zestaw kompleksów inicjacji translacji. W normalnych warunkach wzrostu kompleksy inicjujące translację są przekształcane w polirybosomy, których wykrycie przez profil polisomów świadczy o aktywnej inicjacji translacji (ryc. 2; Nieleczone...

Dyskusja

Analiza profilu polisomów na gradientach sacharozy pozwala na pomiar inicjacji translacji poprzez analizę gęstości polisomów wyizolowanych z komórek lub tkanek^9,11-14. Technika ta jest najlepszym (jeśli nie jedynym) podejściem do pomiaru inicjacji translacji in vivo. Służy do monitorowania stanu translacji rosnących komórek podczas cyklu komórkowego¹⁵ oraz do oceny wpływu różnych rodzajów stresu, w tym infekcji wirusowych, niedotlenienia^13,16, promieniowania¹⁷ i leków ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórki
raka szyjki macicy HeLa	Kolekcja kultur typu amerykańskiego (Manassas, VA; ATCC)	CCL-2
Schneider Drosophila komórki embrionalne	Kolekcja kultur typu amerykańskiego (Manassas, VA; ATCC)	CRL-1963
Pożywka hodowlana i suplementy
Schneidera' s Drosophila Medium	Sigma-Aldrich	SO146-500ml
DMEM	Technologie życia	11995-073
FBS	Fisher Naukowiec	Naukowiec SH30396-03
Penicylina/streptomycyna	Technologie życiowe	15140122
Roztwory sacharozy
D-sacharoza	Fisher Scientist	BP220-212
Glicerol	Sigma-Aldrich	49767
Błękit bromofenolowy	Fisher Scientist	B3925
Bufor do lizy
Tris HCl	Fisher Scientist	BP153-500
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-100G
NaCl	Tekniscience	3624-05
Cyfrowa Umowa	Telekomunikacyjna Sigma-Aldrich	D 9779
Nonidet P40 (Igepal CA-630 )	MJS Biolynx	19628
SDS	Tekniscience	4095-02
Inhibitor RNazy (Rekombinowany inhibitor rybonukleazy RnaseOUT)	Life technologies	10777-019
Antyproteazy (kompletne, mini, wolne od EDTA)Roche		11,836,170,001
Ekstrakcja RNA
Proteinaza K	Life technologie	AM2542
Fenol:chloroform	Fisher Scientist	BP1754I-400
	Chloroform Fisher Scientist	C298-500
Technologie Glycogen	Life	10814-010
Izopropanol	Acros organics	327270010
Przeciwciała
przeciwciała anty-FMRP	Fournier et al., Cancer Cell International, 2010