Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Komórki eukariotyczne nieustannie napotykają szereg szkodliwych warunków fizjologicznego i środowiskowego, które wymagają szybkiej adaptacyjnej odpowiedzi komórkowej. Reakcja komórki na stres obejmuje precyzyjną równowagę między czynnikami działającymi przeciwko przeżyciu i pro-przeżyciu. Zakłócenie tej równowagi może mieć nieodwracalne konsekwencje, prowadząc do rozwoju patologii człowieka, takich jak nowotwory i choroby neurodegeneracyjne. W pierwszym etapie reakcji na stres komórki aktywują szlaki sprzyjające przetrwaniu, które obejmują skoordynowaną kontrolę zmian w ekspresji genów na poziomie translacji mRNA.

translacja mRNA u eukariontów to złożony proces komórkowy, który obejmuje skoordynowane interakcje między czynnikami inicjacji translacji (eIF), specyficznymi białkami wiążącymi RNA (RBD) i cząsteczkami RNA¹. Translacja mRNA jest podzielona na trzy odrębne fazy: inicjację, wydłużenie i zakończenie. Chociaż wszystkie trzy fazy podlegają mechanizmom regulacyjnym, mechanizmy kontroli translacyjnej koncentrują się głównie na fazie inicjacji translacji, która w związku z tym stanowi etap ograniczający szybkość syntezy białek².

Inicjacja translacji to wysoce uporządkowany proces, który rozpoczyna się od utworzenia trójskładnikowego kompleksu eIF2a.GTP.Met-tRNA_i^Met, a następnie jego wiązania z podjednostką rybosomu 40S, co prowadzi do powstania kompleksu pre-inicjacyjnego. Kolejnym krokiem jest rekrutacja kompleksu preinicjacyjnego do mRNA, co wiąże się z aktywnością czynników inicjujących translację, takich jak eIF4F i eIF3. Utworzony w ten sposób kompleks preinicjacyjny 48S ulega specyficznym zmianom konformacyjnym, które umożliwiają tej maszynerii rozpoczęcie skanowania nieulegającego translacji regionu 5' mRNA, dopóki nie rozpozna kodonu inicjacyjnego AUG. Większość czynników inicjujących translację jest następnie uwalniana, a podjednostki 60S są rekrutowane w celu utworzenia kompleksu rybosomu 80S zdolnego do translacji, w którym to momencie rozpoczyna się synteza białek (ryc. 1). Więcej niż jeden monosom 80S może translować ten sam mRNA na raz, wytwarzając tak zwane polisomy (lub polirybosomy). Gęstość polisomów na mRNA odzwierciedla szybkość inicjacji, elongacji i terminacji, a zatem jest miarą translatowalności określonego transkryptu. Jednak profil polisomowy jest używany głównie do oceny zmian w translacji mRNA na etapie inicjacji. Tutaj użyliśmy inhibitora proteasomu jako inhibitora inicjacji translacji. Leczenie komórek nowotworowych tym lekiem indukuje reakcję stresową charakteryzującą się aktywacją kinazy stresowej o nazwie HRI, która fosforyluje czynnik inicjacji translacji eIF2a³. Fosforylacja eIF2a jest jednym z głównych zdarzeń prowadzących do zahamowania inicjacji translacji w komórkach ssaków⁴.

Protokół jest zgodny z wytycznymi zatwierdzonymi przez Komisję Oceny Etycznej Laval.

1. Przygotowanie kultur komórkowych i manipulacja mózgiem

1. Komórki ssaków i Drosophila
   1. Hoduj komórki raka szyjki macicy HeLa i komórki embrionalne Schneider Drosophila zgodnie z zaleceniami American Type Culture Collection. Pracuj z komórkami przy niskim przejściu.
   2. Płytki komórkowej w celu osiągnięcia 80% zbieżności w dniu eksperymentu. Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj ∼12 x 10⁶ komórek dla każdego warunku eksperymentalnego. Przed przygotowaniem ekstraktów do analizy polisomów należy stymulować translację, dodając świeżą, kompletną pożywkę przez co najmniej 90 minut.
2. Izolacja mózgu: Odizoluj mózgi myszy w wieku od 9 do 16 dni po urodzeniu. Eutanazja polega na wdychaniu CO₂ po znieczuleniu i zwichnięciu szyjki macicy. Po uśmierceniu należy odizolować cały mózg i umieścić go w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio przenieść do zimnego PBS 1X w celu natychmiastowego użycia.

2. Przygotowanie systemu frakcjonowania w gradimencie gęstości

1. Myć system rurek z 0,1% SDS przez 5 minut.
2. Umyj system rurek 70% etanolem przez 5 minut, a następnie roztworem RNaseZAP przez 5 minut przed umyciem go wodą DEPC.
3. Pompować powietrze w celu wysuszenia systemu przewodów urządzenia.

3. Przygotowanie gradientów sacharozy

1. Przygotować 15% i 55% roztwory sacharozy w 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,25 mM MgCl₂, 150 mM NaCl i 1 mM DTT.
2. Wygeneruj liniowy gradient sacharozy 15-55% za pomocą formera gradientu Isco Model 160, zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Jednak ważne jest, aby dobrze kontrolować prędkość pompy perystaltycznej TRIS, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków lub turbulencji w gradientach. Utrzymuj gradienty w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
3. W czasie, gdy uruchomiony jest program do tworzenia gradientu, schłodzić ultrawirówkę do temperatury 4 °C.

4. Przygotowanie ekstraktów z komórek i mózgu myszy

1. Przygotowanie ekstraktów komórkowych
   1. Umieść płytkę (płytki) na lodzie i umyj komórki 3x zimnym PBS 1X.
   2. Zebrać komórki (∼12 x 10⁶) w 1 ml buforu do lizy (20 mM Tris-HCl o pH 7,4, 1,25 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% Nonidet P40, 5 U/ml inhibitora RNazy, uzupełnionego kompletnymi tabletkami koktajlowymi z inhibitorami proteazy bez EDTA), przenieś je do probówki Eppendorfa i dobrze wymieszaj, przepuszczając je 15 razy przez strzykawkę insulinową 1 ml U100 28 G 1/2. Pozostaw lizat komórkowy na lodzie na 15 minut.
   3. Umieść kilka kropli lizatu komórkowego na szkiełku, aby ocenić lizę komórkową, obserwując pod mikroskopem kontrastu fazowego przy użyciu obiektywu 10X. Tylko jądra komórkowe powinny być widoczne i żadne błony komórkowe nie powinny być widoczne świadczące o lizie komórek. Jako kontrolę obserwuj niezlizane komórki.
   4. Klarować lizat komórkowy przez odwirowanie w stężeniu 11 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i utrzymywać rozpuszczalny lizat zawierający polirybosomy.
2. Przygotowanie ekstraktów z mózgu myszy
   1. Homogenizować cały izolowany mózg (∼500 mg) przez 10 uderzeń w lodowatym homogenizatorze z 2 ml buforu do lizy i klarować homogenat przez odwirowanie w temperaturze 11 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Załadować otrzymany supernatant na poduszkę z 50% sacharozy i kontynuować sedymentację przez 2 godziny przy 200 000 x g za pomocą wirnika ultrawirówki TH-641 w temperaturze 4 °C.
   3. Zawiesić półprzezroczysty osad zawierający polirybosomy w 1 ml buforu do lizy i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół. Pozostaw zawieszenie na lodzie przez 30 minut przed załadowaniem na pochyłości.

5. Ładowanie ekstraktów na gradienty sacharozy i ultrawirowanie

1. Zmierzyć stężenie RNA obecnego w ekstrakcie cytoplazmatycznym za pomocą spektrofotometru. Ostrożnie i powoli załaduj ∼20 OD₂₆₀ jednostek ekstraktu na gradient sacharozy od 15% do 55%. Upewnij się, że na powierzchni probówki jest 2-3 mm wolnej przestrzeni, aby uniknąć przelania probówek podczas wirowania.
2. Odwirować gradienty za pomocą ultrawirówki przez 2 godziny 30 minut przy 230 000 x g przy użyciu wirnika ultrawirówki TH-641 w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu wirowania wyjmij probówki i ostrożnie umieść je na lodzie, aby nie naruszyć gradientów.

6. Frakcjonowanie ekstraktów cytoplazmatycznych do profilowania polisomów

1. Umieścić gradienty sacharozy w automatycznym systemie frakcjonowania gęstości i przystąpić do automatycznego frakcjonowania i zbierania frakcji (po 0,5 ml każdy), zgodnie z opisem producenta.
2. Zebrać każdą frakcję (∼500 μl) do pojedynczych probówek Eppendorfa z ciągłym monitorowaniem absorbancji przy 254 nm. Równolegle z operacją frakcjonowania gradientowego, profil polirybosomalny będzie edytowany na papierze wykresu. Alternatywnie można użyć jednostki akwizycji danych dołączonej do rejestratora wykresów, aby uzyskać elektroniczną akwizycję profilu polisomowego.
3. Na koniec każdego cyklu przenieś zebrane Eppendorfy na suchy lód. W tym czasie zebrane frakcje należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio wytrącić kompleksy białko-RNA w następujący sposób.

7. Ekstrakcja i analiza białek

1. Do każdej zebranej frakcji gradientu sacharozy dodać 2 objętości 100% zimnego etanolu i pozostawić kompleksy RNA-białko na wytrącenie się w temperaturze -20 °C przez noc.
2. Odwirować każdy osad białka RNA w temperaturze 11 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przemyć 70% etanolem. Wysuszyć i ponownie zawiesić osad w buforze próbki SDS-PAGE przed przystąpieniem do Western blot przy użyciu specyficznych przeciwciał (patrz rysunek 2).

8. Ekstrakcja i analiza RNA

1. Wytrącić kompleksy RNA-białko, jak w punkcie 7.1. Ponownie zawiesić każdy osad białka RNA w buforze do lizy zawierającym 0,1% SDS. Trawić składnik białkowy osadu za pomocą 2 mg/ml proteinazy K przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C.
2. Ekstrahować składniki RNA osadu przez dodanie 1 objętości "fenolu: chloroformu", 2 objętości chloroformu i 0,1 objętości 2 M NaOAc pH 4 i odwirowanie przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min. Wytrącić RNA z otrzymanej fazy wodnej każdej próbki przez noc w temperaturze -20 °C, dodając 1 objętość izopropanolu i 0,2 μg/μl glikogenu. Wirować osad przez 1 godzinę w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Przemyć osad RNA 70% zimnym etanolem.
3. Ponownie zawiesić osad RNA w małej objętości wody wolnej od RNAzy. Oceń ilość i jakość RNA za pomocą spektrofotometru.

Jak wspomniano wyżej, profil polisomów pozwala na analizę zmian inicjacji translacji w warunkach stresu. Rysunek 1 przedstawia uproszczony pogląd na inicjację translacji, która, jak opisano wcześniej, jest procesem wieloetapowym obejmującym uporządkowany zestaw kompleksów inicjacji translacji. W normalnych warunkach wzrostu kompleksy inicjujące translację są przekształcane w polirybosomy, których wykrycie przez profil polisomów świadczy o aktywnej inicjacji translacji (ryc. 2; Nieleczone). Jednak w warunkach stresu inicjacja translacji jest zablokowana, co powoduje akumulację monosomów 80S i redukcję pików polisomów (ryc. 2; inhibitor proteasomu).

Rysunek 1. Uproszczone spojrzenie na inicjację tłumaczenia. Inicjacja translacji obejmuje kilka etapów: 1) tworzenie trójskładnikowego kompleksu eIF2a.GTP.Met-tRNAiMet, 2) asocjację kompleksu trójskładnikowego z rybosomami 40S tworzącymi kompleks preinicjacyjny 43S, 3) asocjację kompleksów 43S z mRNA tworzącym kompleks preinicjacyjny 48S, 4) skanowanie nieulegającego translacji regionu 5' mRNA przez rybosomy 48S, aż dotrze on i zidentyfikuje inicjujący kodon AUG, oraz 5) rekrutacja dużej podjednostki rybosomalnej od 60S do 48S tworzącej kompleks 80S, w którym to momencie rozpoczyna się synteza polipeptydów. Każdy etap inicjacji tłumaczenia wiąże się z działaniem kilku czynników inicjujących translację. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 2. Profile polisomów i analiza białek związanych z polisomami metodą western blot w komórkach HeLa. (A - B) Ekstrakty cytoplazmatyczne przygotowano z komórek HeLa hodowanych w normalnych warunkach (A) lub po leczeniu inhibitorem proteasomu przez 4 godziny (B) i odwirowano na liniowym gradiencie sacharozy 15-55% v/w. Profile polisomów są wskazane w górnym panelu. Pozycje rybosomów 40S, rybosomów 60S, monosomów 80S i polisomów są wskazane w każdym profilu. Ułamki od góry (15%) do dołu (55%) gradientu są wyświetlane od lewej do prawej. Frakcje zebrano i przeanalizowano za pomocą western blot (dolne panele) z przeciwciałami przeciwko dużemu rybosomalnemu białku L28, a także z białkiem związanym z polisomami FMRP, które służą jako kontrola integralności polisomów5,6. Należy zauważyć, że leczenie inhibitorem proteasomu zmniejsza piki polisomów przy jednoczesnym wzroście monosomów 80S wskazujących na zahamowanie inicjacji translacji. Typowe profile uzyskane z komórek Schneider Drosophila lub mózgu myszy zostały opisane w innym miejscu7-10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.