Zmniejszone stężenie itrakonazolu i czas jego trwania są skuteczne w leczeniu zakażenia Batrachochytrium dendrobatidis u

Podsumowanie

Zakażenie Batrachochytrium dendrobatidis u można wyeliminować za pomocą zmniejszonego stężenia (0,0025%) i krótszego czasu trwania (pięciominutowe kąpiele przez sześć dni) itrakonazolu niż jest to zwykle stosowane. Mniejszą śmiertelność i mniej negatywnych skutków ubocznych zaobserwowano przy użyciu tego zmodyfikowanego protokołu leczenia.

Streszczenie

doświadczają największego spadku liczebności spośród wszystkich klas kręgowców, a główną przyczyną tych spadków jest patogen grzybiczy, Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), który powoduje chorobę chytridiomycosis. Kolonie zabezpieczające w niewoli są ważne na całym świecie dla zagrożonych gatunków i mogą być jedyną deską ratunku dla tych, które są krytycznie zagrożone wyginięciem. Utrzymanie kolonii wolnych od chorób jest priorytetem dla osób zarządzających zwierzętami w niewoli, jednak nie zidentyfikowano bezpiecznych i skutecznych metod leczenia dla wszystkich gatunków i na różnych etapach życia. Najczęściej stosowaną chemioterapeutyką jest itrakonazol, chociaż powszechnie stosowana dawka może być szkodliwa dla niektórych osób i gatunków. Przeprowadziliśmy badanie kliniczne w celu oceny, czy można znaleźć mniejszą i bezpieczniejszą, ale skuteczną dawkę itrakonazolu w leczeniu zakażeń Bd. Odkryliśmy, że zmniejszając stężenie leczenia z 0,01-0,0025% i skracając czas trwania leczenia z 11-6 dni 5-minutowych kąpieli, żaby można wyleczyć z infekcji Bd przy mniejszej liczbie skutków ubocznych i mniejszej śmiertelności związanej z leczeniem.

Wprowadzenie

doświadczają obecnie największego spadku różnorodności biologicznej spośród wszystkich taksonów kręgowców¹. Chytridiomykoza, choroba skóry wywoływana przez patogen grzybiczy Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), jest jedną z głównych przyczyn tych dramatycznych spadków². Bd jest najgorszym w historii patogenem powodującym utratę różnorodności biologicznej: infekuje ponad 600 gatunków i spowodował spadek liczebności ponad 300 gatunków, z czego aż 200 gatunków stało się krytycznie zagrożonych lub wymarłych^2,3. Grzyb chytrid nie jest specyficzny dla żywiciela i nie jest jasne, jakie cechy gospodarza pozwalają na postęp infekcji Bd, powodując ciężką chorobę. Chytridiomykoza powoduje śmierć poprzez zakłócenie kanałów jonowych w skórze, co prowadzi do utraty elektrolitów i niewydolności serca⁴. Ponadto supernatant Bd (nie zawierający zoospor Bd) powoduje odpowiedź immunologiczną u kijanek⁵, co prowadzi naukowców do przekonania, że Bd wytwarza toksyczny produkt uboczny⁶.

Ponieważ wiele gatunków gwałtownie spada, kolonie w niewoli i programy hodowlane są ważnymi środkami ochronnymi i mogą być jedynym kołem ratunkowym dla niektórych gatunków. Zakładanie i utrzymywanie kolonii wolnych od chorób jest wyzwaniem dla ośrodków zarządzania. Obecne metody chemoterapeutyczne stosowane w leczeniu zakażeń Bd, choć skuteczne, mogą być szkodliwe dla leczonych zwierząt, a żadna pojedyncza metoda leczenia nie była skuteczna we wszystkich gatunkach i klasach wiekowych⁷.

Przeprowadzono niewiele badań klinicznych dotyczących leczenia zakażenia Bd ⁷. Trzy najczęściej stosowane metody leczenia to terapia cieplna, chloramfenikol i itrakonazol. Terapia cieplna jest opcją leczenia niechemioterapeutycznego, która wydaje się mieć niewiele skutków ubocznych, może być stosowana na wielu etapach życia i jest ogólnie skuteczna. W badaniu klinicznym Chatfield i Richards-Zawacki⁸ odkryli, że 96% leczonych zwierząt usunęło infekcje po 10 dniach trzymania w temperaturze 30 °C. Chociaż badanie to nie zakończyło się w 100% sukcesem, stanowi punkt odniesienia dla innych do oceny terapii cieplnej dla ich własnego gatunku. Terapia cieplna, choć skuteczna dla wielu gatunków, jest niepraktyczna dla wielu gatunków alpejskich, które nie mogą pozostać w wysokich temperaturach przez dłuższy czas. Chloramfenikol, środek przeciwbakteryjny, jest z powodzeniem stosowany w leczeniu Bd u wielu gatunków i hamuje rozwój grzybów in vitro. Jako środek przeciwbakteryjny, chloramfenikol nie atakuje grzyba specjalnie, ale wiadomo, że powoduje apoptozę w komórkach eukariotycznych⁹. Spekulowano, że terapia chloramfenikolem powoduje apoptozę w skórze, zabijając wewnątrzkomórkowe sporangia, chociaż dokładny mechanizm działania nie jest znany. Chociaż nie przeprowadzono żadnego badania klinicznego, a zatem nie oceniono dawki i czasu leczenia, obecne protokoły leczenia zazwyczaj wymagają zanurzenia na dwa do czterech tygodni^10,11, co czyni to leczenie niepraktycznym dla lądowych. Chloramfenikol został również ograniczony w niektórych krajach do użytku weterynaryjnego, ponieważ narażenie ludzi wiąże się z rzadką postacią niedokrwistości aplastycznej¹².

Itrakonazol, azolowy środek przeciwgrzybiczy, jest najczęściej stosowany w leczeniu infekcji Bd u w niewoli. Najczęściej stosowanym protokołem jest kąpanie zwierząt w 0,01% roztworze itrakonazolu przez pięć minut dziennie przez 11 kolejnych dni. Protokół ten został opracowany na podstawie standardów stosowanych do podawania ssaków i chociaż jest skuteczny w przypadku, nie jest oparty na badaniach klinicznych na^11,13. Protokół ten może powodować negatywne skutki uboczne u niektórych gatunków, zwłaszcza u rodzaju Rana oraz u kijanek i niedawnych metamorfów¹¹. Leczenie kijanek było skuteczne przy użyciu znacznie niższego stężenia (0,0005%) itrakonazolu, ale wiązało się z depigmentacją¹⁴. To samo stężenie zostało przetestowane na niedawnych metamorfach i okazało się, że nie jest skuteczne w leczeniu infekcji¹⁵. Ponieważ istnieje ryzyko wystąpienia negatywnych skutków ubocznych związanych z leczeniem itrakonazolem, niektórzy lekarze stosowali połowę zwykłego stężenia (0,005%) przez 11 kolejnych dni i stwierdzili, że jest to skuteczne w leczeniu infekcji Bd ¹⁶.

Niniejsze badanie jest podsumowaniem klinicznego badania klinicznego z użyciem itrakonazolu w leczeniu infekcji Bd ¹⁵. Protokół opisuje próbę znalezienia najniższej dawki i czasu leczenia, które są zarówno bezpieczne, jak i skuteczne w leczeniu itrakonazolu u zwierząt zakażonych Bd. Zwierzęta użyte w tym badaniu to niedawne metamorfy ropuch przybrzeżnych, mgławicy Incilius.

Protokół

Zatwierdzenie etyki: To badanie i jego metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Tulane (protokół nr 0407).

1. Testy na infekcję Bd

1. Wymaz na Bd
   1. Wymaz ze zwierząt sterylnym wacikiem pięć razy na brzuchu, pięć razy na każdym udzie, z każdej strony i każdej kończyny, co daje w sumie 45 pociągnięć. Wymaz jest nieinwazyjną metodą pobierania próbek na obecność Bd na skórze.
   2. Delikatnie obracaj wacik podczas i między pociągnięciami, aby upewnić się, że na waciku zebrała się jak największa ilość DNA.
   3. Waciki należy przechowywać w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml w temperaturze -20 °C.
2. Ekstrakcja DNA i test qPCR
   1. Wyodrębnić genomowe DNA z wymazów za pomocą dostępnego w handlu zestawu do izolacji DNA, zgodnie z instrukcją dla tkanki zwierzęcej.
   2. Przeanalizuj wyekstrahowane DNA za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) zgodnie z Boyle i wsp. ¹⁷, z następującymi modyfikacjami:
   3. Rozcieńczyć próbki do ekstrakcji DNA w stosunku 1:10 podwójnie dejonizowaną wodą.
   4. Dodać 0,7 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA), aby zapobiec zahamowaniu PCR.
   5. Uwzględnij wewnętrzną kontrolę pozytywną w każdej próbce, aby upewnić się, że hamowanie PCR nie wpływa na wyniki.
   6. Przeprowadzić próbki z kontrolą dodatnią i ujemną oraz szeregiem wzorców rozcieńczenia, aby oszacować obciążenie zoosporami (infekcją).

2. Inokulacja

1. Kultura Bd
   1. Przygotować bulion tryptonowy, dodając 10 g tryptonu do 1 litra wody z odwróconej osmozy lub wody dejonizowanej, sterylizować w autoklawie (121 °C przez 40 min) i pozostawić do ostygnięcia. Po schłodzeniu do temperatury 23 °C dodać 1 ml penicyliny-streptomycyny.
   2. Hoduj szczep Bd (JEL411 od J. Longcore, wyizolowany z Guabal, Panama z lemura Phyllomedusa) w bulionie tryptonowym przez siedem dni w temperaturze 23 °C.
2. Przenieś kulturę bulionu na płytki tryptonowe i agarowe.
   1. Aby przygotować płytki, dodaj 10 g tryptonu i 10 g agaru do 1 l odwróconej osmozy lub wody dejonizowanej i autoklawu (121 °C przez 40 min).
   2. Gdy autoklawizowana mieszanina ostygnie na tyle, aby można ją było dotknąć, ale zanim zastygnie, wlej do szalek Petriego, pełnych w 1/4-1/3, w okapie z przepływem laminarnym.
   3. Gdy agar całkowicie zastygnie i ostygnie, dodaj 0,5 ml bulionu Bd do każdej płytki i równomiernie rozprowadź na płytce. Pozostawić do wyschnięcia.
   4. Po zaszczepieniu płytek zoosporami Bd, uszczelnij płytki Parafilmem.
   5. Pozostawić płytki do inkubacji w temperaturze 23 °C przez pięć do siedmiu dni. Sprawdź ruch zoospor, aby zapewnić żywotność przed inokulacją.
3. Płytki zalewowe do roztworu do inokulacji zoospor
   1. Po pięciu do siedmiu dniach inkubacji i wzrostu Bd, zalej każdą płytkę 5 ml dojrzałej wody z kranu i pozwól zoosporom dostać się do pożywki na 10 minut.
   2. Wlej zawiesinę zoospor do przenośnego pojemnika.
   3. Oszacuj stężenie zoospor za pomocą hemocytometru.
   4. Rozcieńczyć mieszaninę do stężenia 1 x 10,6 na 3 ml starzoną wodą z kranu.
4. Szczepienie zwierząt
   1. W oddzielnych pojemnikach o pojemności 50 ml zaszczepić każde zwierzę, wylewając 3 ml mieszaniny inokulum na jego brzuszek. Pozwolić, aby dodatkowy inokulum spłynął na dno pojemnika do zaszczepiania.
   2. Każde zwierzę pozostanie w pojemniku do szczepienia przez 24 godziny, aby zapewnić zakażenie.
   3. Po 24 godzinach od zaszczepienia zwierzęta należy zwrócić do indywidualnie zdezynfekowanych terrariów.
   4. Pozwól, aby infekcja rozwijała się przez dwa tygodnie. Potwierdź zakażenie za pomocą wymazu i wyników qPCR i rozpocznij leczenie.
   5. W przypadku kontroli ujemnych Bd, należy zalać płytki agarowe wolne od Bd 5 ml dojrzałej wody z kranu i pozorować zaszczepić zwierzęta tymi samymi metodami, co powyżej.

3. Schemat leczenia

1. Przygotuj kąpiel zabiegową
   1. Dodać 2,50 ml wodnego itrakonazolu (1% roztwór doustny Straranox) do 1 l roztworu Ringera dla (0,0025% itrakonazolu - najniższe skuteczne stężenie stosowane w zabiegu).
      1. Przepis na roztwór Ringera: 1 l odwróconej osmozy lub wody dejonizowanej, 6,6 g chlorku sodu, 0,15 g chlorku potasu, 0,15 g chlorku wapnia i 0,2 g wodorowęglanu sodu. Roztwór w autoklawie (121 °C przez 40 min) i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
      2. Aby uzyskać stężenie 0,01% itrakonazolu, dodaj 10,00 ml wodnego roztworu itrakonazolu (1% roztwór doustny Straranox) do 1 l roztworu Ringera dla
      3. Aby uzyskać stężenie 0,005% itrakonazolu, dodaj 5,00 ml wodnego roztworu itrakonazolu (1% roztwór doustny Straranox) do 1 l roztworu Ringera dla.
   2. W przypadku kontroli Bd-dodatnich i Bd-ujemnych należy kąpać zwierzęta w roztworze Ringera dla bez itrakonazolu.
2. leczenie
   1. Umieścić poszczególne w zdezynfekowanych pojemnikach o pojemności 50 ml z 35 ml roztworu leczniczego.
   2. Upewnij się, że zwierzęta są całkowicie przykryte przez pięć minut, delikatnie obracając pojemnik.
   3. Wróć zwierzęta do zdezynfekowanych terrariów. Powtarzaj przez sześć dni.
3. Zadbaj o powodzenie leczenia
   1. Zwierzęta doświadczalne w kierunku zakażenia Bd w dniu rozpoczęcia leczenia.
   2. Zwierzęta przeprowadza się testy na obecność zakażenia Bd tydzień po zakończeniu leczenia i raz w tygodniu przez cztery tygodnie, aby upewnić się, że infekcja ustąpiła.

4. Bd jako zagrożenie biologiczne

1. Dezynfekuj poszczególne terraria co tydzień.
   1. Wykąp terraria i pojemniki zabiegowe w kąpieli z 10% roztworem wybielacza.
   2. Wypłucz każdy wybielony pojemnik dwukrotnie pod bieżącą wodą.
   3. Pozostaw pojemniki do wyschnięcia na 24 godziny przed ponownym użyciem.
2. Podczas pracy ze zwierzętami należy nosić czyste rękawice nitrylowe, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu patogenem Bd. Zmieniaj rękawiczki między obchodzeniem się z każdym zwierzęciem.
3. Zdezynfekuj wszystkie odpady płynne przed usunięciem, doprowadzając roztwór do 10% wybielacza.
4. Przed usunięciem należy sterylizować w autoklawie wszystkie odpady stałe, które są potencjalnie narażone na Bd.

Wyniki

Leczenie itrakonazolem uznano za skuteczne, jeśli wszystkie zwierzęta były Bd-ujemne cztery tygodnie po zakończeniu terapii. Przed rozpoczęciem leczenia, dwa tygodnie po inokulacji, wszystkie zwierzęta inokulowane Bd były zainfekowane, przy średnim obciążeniu zoosporami wynoszącym 1,121.7 (±17.34), natomiast cztery tygodnie po zakończeniu leczenia zwierzęta z grupy kontrolnej Bd-dodatniej miały średnie obciążenie zoosporami na poziomie 16,765.12 (±14643.08).

Leczenie...

Dyskusja

Korzystając z tego protokołu, udało nam się bezpiecznie i skutecznie zmniejszyć dawkę leczniczą i czas leczenia itrakonazolem Bd u. Najniższa dawka i czas leczenia (0,0025% przez sześć dni) okazały się skuteczne w leczeniu subklinicznie zakażonego I. nebulifer. Skuteczność zarówno mniejszej dawki, jak i czasu leczenia wskazują na potrzebę przeprowadzenia badań klinicznych w leczeniu zakażenia Bd , ponieważ obecnie nie ma bezpiecznych i skutecznych metod leczenia, które można by stosować dla wsz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,1% wodny itrakonazol, Sporonox	Janssen Pharmaceutica Inc.
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
KCl	Fisher Scientific	BP366-1
CaCl2	Fisher Scientific	BP510-100
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-500
Sterylne waciki bawełniane	Sprzęt medyczny i drutowy	MW113
1,5 ml Mikroprobówki	Sarstedt	73.703.217
Qiagen DNEasy Zestaw do krwi i tkanek	Qiagen	69581
7500 Real-time PCR	Applied Biosystems	4351104
VIC IPC	Applied Biosystems	4308323
BSA	Applied Biosystems	AM2618
Agar	Invitrogen	30391023
Trypton	Invitrogen	Q10029
Penicylina-streptomycyna	Invitrogen	15070-063
Szalka Petriego	Sigma Aldrich	CLS430589