Izolacja i kwantyfikacja neurotoksyny botulinowej ze złożonych matryc za pomocą testów matrycowych BoTest

Summary

Testy wykrywania neurotoksyny botulinowej (BoNT) BoTest Matrix szybko oczyszczają i kwantyfikują BoNT z różnych matryc próbek. Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i oznaczania ilościowego BoNT zarówno z matryc stałych, jak i ciekłych oraz demonstrujemy test z BOTOXEM, pomidorami i mlekiem.

Abstract

Dokładne wykrywanie i oznaczanie ilościowe neurotoksyny botulinowej (BoNT) w złożonych matrycach jest wymagane do testowania próbek farmaceutycznych, środowiskowych i spożywczych. Szybkie testy BoNT żywności są potrzebne podczas kryminalistyki epidemicznej, diagnozowania pacjentów i testowania bezpieczeństwa żywności, podczas gdy dokładne testy siły działania są wymagane do produkcji produktów leczniczych opartych na BoNT i bezpieczeństwa pacjentów. Szeroko stosowany test biologiczny na myszach do testowania BoNT jest bardzo czuły, ale brakuje mu precyzji i przepustowości potrzebnej do szybkich i rutynowych testów BoNT. Co więcej, wykorzystanie testów biologicznych na zwierzętach spowodowało wezwania ze strony organów regulacyjnych ds. produktów leczniczych i obrońców praw zwierząt w USA i za granicą do zastąpienia testu biologicznego na myszach w testach na BoNT. Opracowano kilka testów zastępczych in vitro, które dobrze współpracują z oczyszczonym BoNT w prostych, ale większość z nich nie ma zastosowania do testowania w wysoce złożonych matrycach. W tym miejscu przedstawiono protokół detekcji BoNT w złożonych matrycach za pomocą testów BoTest Matrix. Test składa się z trzech części: pierwsza część obejmuje przygotowanie próbek do badania, druga część to etap immunoprecypitacji przy użyciu kulek paramagnetycznych pokrytych przeciwciałem anty-BoNT w celu oczyszczenia BoNT z matrycy, a trzecia część określa ilościowo aktywność proteolityczną izolowanego BoNT za pomocą reportera fluorogenicznego. Protokół został napisany z myślą o testach o wysokiej przepustowości na płytkach 96-dołkowych przy użyciu zarówno matryc płynnych, jak i stałych i wymaga około 2 godzin ręcznego przygotowania z całkowitym czasem oznaczania 4-26 godzin w zależności od rodzaju próbki, obciążenia toksyną i pożądanej czułości. Przedstawiono dane do testów BoNT/A z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, produktem leczniczym, supernatantem hodowli, 2% mlekiem i świeżymi pomidorami i obejmują omówienie parametrów krytycznych dla powodzenia testu.

Introduction

Neurotoksyny botulinowe (BoNTs) są najbardziej śmiercionośnymi znanymi substancjami, z dożylnymi dawkami śmiertelnymi dla ludzi szacowanymi na 1-3 ng/kg^1,2. Istnieje siedem strukturalnie podobnych serotypów BoNT, oznaczonych od A do G, z których każdy składa się z domeny łańcucha ciężkiego odpowiedzialnej za wiązanie, wychwyt i translokację komórek do cytozolu oraz łańcucha lekkiego, który koduje endopeptydazę cynkową^3-5. Wyśmienita toksyczność BoNT wynika częściowo z jego specyficznego wiązania i wnikania do neuronów ruchowych w połączeniu nerwowo-mięśniowym⁶. Po wejściu do neuronu endopeptydaza łańcucha lekkiego specyficznie rozszczepia jedno lub więcej rozpuszczalnych białek receptora białka przyłączającego czynnik wrażliwy na N-etylomaleimid (SNARE) wymaganych do fuzji pęcherzyków, hamując uwalnianie neuroprzekaźników i prowadząc do porażenia wiotkiego^7-14. Powszechnie znany jako choroba "zatrucie jadem kiełbasianym", paraliż przepony i mięśni międzyżebrowych przez BoNT ostatecznie prowadzi do niewydolności oddechowej i śmierci, chyba że otrzyma się wczesną diagnozę i leczenie.

Ludzki jad kiełbasiany przenoszony przez żywność jest najczęściej kojarzony z serotypami BoNT A, B, E i F (BoNT/A, BoNT/B, itd.) i zwykle wynika ze spożycia skażonej żywności^15,16; chociaż odnotowano kilka przypadków zatrucia jadem kiełbasianym wśród osób zażywających narkotyki dożylnie^17,18. W Stanach Zjednoczonych zatrucie jadem kiełbasianym u niemowląt wynikające ze spożycia zarodników Clostridium przez dzieci poniżej pierwszego roku życia jest najczęstszą formą zatrucia jadem kiełbasianym^{w wieku 19-21} lat. Jednak zarówno w Stanach Zjednoczonych, jak i za granicą odnotowano ogniska BoNT przenoszone przez żywność wynikające z niewłaściwego domowego konserwowania i przetwarzania żywności. W latach 2000-2009 na całym świecie zgłoszono co najmniej 338 przypadków zatrucia jadem kiełbasianym, w tym^{sześć ofiar} śmiertelnych. Zdolność do szybkiego i czułego wykrywania ognisk zatrucia jadem kiełbasianym przenoszonym przez żywność jest kluczowym wskazaniem, które może pomóc we wczesnej diagnozie^23,24. Ponadto metody wykrywania, które umożliwiają opłacalne i rutynowe badanie żywności, doprowadzą do poprawy bezpieczeństwa żywnościowego.

Specyficzność neuronalna BoNT i długi biologiczny okres półtrwania również sprawiają, że jest to silny środek terapeutyczny. W Stanach Zjednoczonych leki na bazie BoNT są zatwierdzone przez Agencję ds. Żywności i Leków do leczenia schorzeń kosmetycznych i zaburzeń związanych z nerwowo-mięśniowymi, w tym zmarszczek gładzizny czoła, dystonii szyjnej, migrenowych bólów głowy, pęcherza nadreaktywnego i zeza. Udokumentowane są liczne zastosowania "off-label", w tym leczenie wysokimi dawkami ciężkiej dysfunkcji mięśni^25-28. Dokładne określenie ilościowe toksyn ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego dawkowania, ponieważ niedostateczne dawkowanie może prowadzić do nieskutecznego leczenia, podczas gdy przedawkowanie naraża pacjentów na ryzyko potencjalnie szkodliwych skutków ubocznych. Niestety, żaden ustandaryzowany protokół oznaczania siły działania nie jest wspólny dla wszystkich producentów, co powoduje rozbieżności w definicjach jednostek między produktami leczniczymi na bazie BoNT^29-31.

Standardowym testem na BoNT jest test biologiczny na myszach, w którym próbki zawierające BoNT są wstrzykiwane dootrzewnowo myszom, a liczba zgonów zarejestrowanych w ciągu 1-7 dni^{wynosi 16,32,33}. Test biologiczny myszy jest bardzo czuły z granicami wykrywalności (LOD) 5-10 pg BoNT/A³⁴; jednak obawy etyczne związane z wykorzystywaniem zwierząt, wysokie koszty szkolenia personelu i utrzymania obiektów dla zwierząt, długi czas testów i brak znormalizowanych protokołów spowodowały wezwania do opracowania znormalizowanych, wolnych od zwierząt metod testowania i kwantyfikacji BoNT^35-39. Niedawno opracowano kilka alternatywnych metod kwantyfikacji BoNT, które oferują czułość testu biologicznego myszy lub myszy^40-49. Metody te powszechnie wykorzystują fluorescencję, spektrometrię mas lub metody immunologiczne i oferują czas oznaczania znacznie krótszy niż test biologiczny na myszach bez użycia na zwierzętach. Wykazano, że metody spektrometrii mas w połączeniu z technikami immunologicznymi wykrywają i określają ilościowo BoNT zawarty w żywności i innych złożonych próbkach; Jednak wymagania dotyczące szkolenia personelu i specjalistyczny sprzęt ograniczają te testy^{do 50-55}. Większość innych alternatywnych testów nie jest łatwa do zastosowania do złożonych testów próbek lub brakuje im przepustowości wymaganej do rutynowych testów BoNT. Wysoce zmienny charakter lepkości, pH, zawartości soli i składników matrycy próbek żywności stanowi szczególnie trudne wyzwanie przy próbie opracowania metod oznaczania in vitro z czułością odpowiadającą ekstremalnej sile działania BoNT. Co więcej, nawet proste i stosunkowo łagodne systemy buforowe, takie jak te wynikające z ponownego zawieszania produktów leczniczych na bazie BoNT, zawierają sól, albuminy i stabilizatory cukru (tj. substancje pomocnicze), które znacząco wpływają na siłę działania BoNT in vitro ⁵⁶. Oczyszczanie toksyn jest wymagane do dokładnego badania aktywności wszystkich próbek z wyjątkiem najprostszych^56-59.

Testy matrycowe BoTest zostały zaprojektowane do szybkiego, wysokowydajnego i spójnego oznaczania ilościowego BoNT z wysoce złożonych próbek przy użyciu sprzętu powszechnie spotykanego w laboratoriach badawczych^56,60. Testy te wykorzystują kulki paramagnetyczne kowalencyjnie połączone z przeciwciałami anty-BoNT specyficznymi dla serotypu do wiązania i sekwestracji BoNT z próbki, a następnie usuwania zakłócających związków matrycy przez mycie. Po przemyciu, związana aktywność proteolityczna BoNT jest następnie oznaczana ilościowo w zoptymalizowanym buforze reakcyjnym przy użyciu reportera zgodnego z badanym serotypem BoNT. Te reportery są białkami fluorogennymi składającymi się z N-końcowego ugrupowania cyjanowego białka fluorescencyjnego (CFP) i C-końcowego ugrupowania pochodnej białka żółtej fluorescencji (Venus) połączonego substratem BoNT, resztami SNAP25 141-206 lub resztami synaptobrevin 33-94 stanowiącymi odpowiednio reportery BoTest A/E lub B/D/F/G⁴⁵. Rozszczepienie reporterowe przez BoNT jest monitorowane za pomocą rezonansowego transferu energii Förstera (FRET). Gdy reporter jest nienaruszony, wzbudzenie CFP powoduje FRET do Wenus, wygaszając emisję CFP i ekscytującą emisję na Wenus. Rozszczepienie reportera przez BoNT zapobiega FRET, prowadząc do wzrostu emisji CFP i zmniejszenia emisji z Wenus. Aktywność BoNT można następnie zmierzyć ilościowo za pomocą stosunku emisji CFP i Venus. LOD poniżej 3 pg są możliwe w przypadku szerokiej gamy produktów spożywczych przy użyciu wysokowydajnej płytki 96-dołkowej^{formatu 56}. Zwiększoną czułość można uzyskać przy użyciu większych objętości próbek, ponieważ test pozwala na zagęszczenie toksyny na powierzchni kulki.

Testy BoTest Matrix dla BoNT A, B, E i F zostały opracowane i przetestowane na próbkach żywności, farmaceutycznych i środowiskowych^56,60. W tym miejscu opisano procedury wykonywania tych testów w celu wykrycia BoNT w próbkach o niskiej złożoności (np. farmaceutycznej, BoNT w buforze) i wysokiej złożoności (np. żywność, środowisko). W niniejszym protokole omówiono konkretne metody przetwarzania dla kilku typów próbek, a typy próbek nieopisane w niniejszym dokumencie można zazwyczaj dostosować przy użyciu kombinacji przedstawionych metod. Protokół został opracowany i przetestowany z BoNT/A, ale można go dostosować do innych serotypów BoNT przy użyciu ich odpowiednich testów, jak pokazano w innym miejscu^56,60.

Protocol

1. Przygotowanie odczynników do testów

1. Rozmrozić 200x ditiotreitol (DTT), 10x bufor wiążący matrycę (10x bufor wiążący dalej), 10x bufor neutralizacyjny (tylko próbki spożywcze lub próbki o niezrównoważonym pH) i 10x bufor reakcyjny BoTest (10x bufor reakcyjny dalej) w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut lub do całkowitego rozmrożenia. Tabela 1 zawiera wykaz i odczynników stosowanych w tym protokole. Tabela 2 zawiera wykaz materiałów i sprzętu wymaganych do realizacji tego protokołu.
2. Wiruj rozmrożone przez 5 sekund, aby wymieszać. 10x bufor neutralizacyjny, 200xDTT i 10x bufor reakcji powinny wydawać się czyste, podczas gdy 10x bufor wiążący będzie miał mętny wygląd. Ogrzewać 10-krotny bufor reakcyjny przez 5 minut w temperaturze 37 °C i powtórzyć wirowanie, jeśli po rozmrożeniu wydaje się mętny.
3. Wygeneruj 3,8 ml 1x buforu reakcyjnego.
   1. Oznacz stożkową probówkę o pojemności 15 ml jako "1x bufor reakcyjny" i dodaj 3,42 ml wody klasy biologii molekularnej, 380 μl 10x buforu reakcyjnego i 19 μl 200x DTT. Dobrze wymieszaj bufor przez inwersję.
   2. Pokrój pojedynczą tabletkę inhibitora proteazy wolną od EDTA na ćwiartki za pomocą czystej żyletki i dodaj jedną ćwiartkę tabletki do 1x buforu reakcyjnego (pozostałą porcję tabletki można przechowywać w temperaturze 4 ° C do późniejszego wykorzystania). Inhibitory proteazy mogą nie być konieczne w przypadku stosowania oczyszczonej toksyny i prostych (np. próbek farmaceutycznych).
   3. Wirować bufor reakcyjny 1x, aż tabletka proteazy całkowicie się rozpuści.
4. Podgrzewaj koraliki Matrix A (dalej koraliki IP-A) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
5. Rozmrozić BoTest A/E reporter (A/E reporter zwany dalej A/E) w RT w celu ochrony przed światłem.
6. Oznaczyć stożkową probówkę o pojemności 15 ml "0,5 μM A/E reporter" i dodać 45 μl 20 μM A/E do 1,8 ml 1x bufor reakcyjny. Dokładnie wymieszać za pomocą pipetowania i przechowywać na lodzie chronionym przed światłem.

2. Generowanie próbki krzywej standardowej

Opisana tutaj krzywa wzorcowa obejmuje 10-30 000 mLD₅₀/g żywności lub na ml buforu w rozcieńczeniach półlogarytmicznych (Tabela 3). Użytkownik końcowy może swobodnie stosować alternatywne stężenia, jeśli ma to zastosowanie.

1. Wzbogacanie i inkubacja matryc z materiałem referencyjnym. Wygeneruj krzywą wzorcową, używając rozcieńczalnika o tej samej matrycy, co nieznana, jeśli to możliwe, w celu zmniejszenia efektów matrycy. Użyć żelatynowego buforu fosforanowego (GPB) lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako rozcieńczalnika, jeśli dodatkowa, ujemna matryca BoNT nie jest dostępna (np. badanie próbki w terenie lub w przypadku wybuchu epidemii BoNT). Wygeneruj krzywą standardową, wprowadzając BoNT/A do wybranej macierzy zgodnie z odpowiednim protokołem poniżej.
   1. Próbki o niskiej złożoności (np. PBS, GPB lub farmaceutyczne)
      1. Dodać 10 ml odpowiedniego buforu do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odstawić. Próbka ta zostanie użyta jako rozcieńczalnik do krzywej wzorcowej i nieznanych rozcieńczeń (sekcja 4).
      2. Dodać 1,2 ml buforu do probówki mikrowirówkowej.
      3. UWAGA: W tym kroku wykorzystuje się BoNT i należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się i utylizacji wszelkich odczynników i materiałów, które mają kontakt z toksyną. Stosowanie środków ochrony osobistej i właściwa utylizacja wszystkich materiałów muszą odbywać się zgodnie z wytycznymi OSHA Departamentu Pracy USA dla BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Dodać BoNT/A do próbki o objętości 1,2 ml tak, aby końcowe stężenie wynosiło 30 000 mLD₅₀/ml (łącznie 36 000 mLD₅₀).
   2. Próbki żywności w płynie (lub inne złożone próbki cieczy) Uwaga: Zaleca się przeprowadzenie wstępnych badań w celu określenia objętości supernatantu odzyskanego z próbek klarowanych, ponieważ zawartość cząstek stałych (np. miazgi) w matrycach cieczy będzie się różnić. W protokole tym zakłada się, że co najmniej 1,2 ml sklarowanego supernatantu zostanie odzyskane z próbki o objętości 1,4 ml. W razie potrzeby zwiększyć wielkość próby.
      1. Dodaj 10 ml płynnego pokarmu do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odstaw na bok. Próbka ta zostanie użyta jako rozcieńczalnik do krzywej wzorcowej i nieznanych rozcieńczeń (sekcja 4).
      2. Zważyć pustą probówkę do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i zanotować jej masę.
      3. Dodać 1,4 ml płynnego pokarmu do zważonej probówki mikrowirówkowej.
      4. Ponownie zważyć probówkę do mikrowirówki i obliczyć masę dodanej próbki żywności, odejmując masę pustej probówki.
      5. UWAGA: W tym kroku wykorzystuje się BoNT i należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się i utylizacji wszelkich odczynników i materiałów, które mają kontakt z toksyną. Stosowanie środków ochrony osobistej i właściwa utylizacja wszystkich materiałów muszą odbywać się zgodnie z wytycznymi OSHA Departamentu Pracy USA dla BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Dodać BoNT/A do 1,4 ml próbki o końcowym stężeniu 30 000 mLD₅₀/g żywności.
      6. Próbki rozcieńczalnika i wzbogacone należy inkubować w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez 2 godziny, aby dać BoNT czas na interakcję z matrycą pokarmową, naśladując naturalne zanieczyszczenie.
   3. Stałe próbki żywności (lub inne próbki stałe) Uwaga: Zaleca się przeprowadzenie wstępnych badań w celu określenia objętości supernatantu odzyskanego z próbek homogenizowanych i sklarowanych po dodaniu 1 ml GPB/g żywności. W protokole tym zakłada się, że z próbki o masie 2 g zostanie odzyskane co najmniej 1,2 ml sklarowanego supernatantu. W razie potrzeby zwiększyć wielkość próby.
      1. Odważyć 10 g próbki stałej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odstawić na bok. Zostanie to użyte jako rozcieńczalnik.
      2. Odważyć 2 g stałej próbki żywności do drugiej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
      3. UWAGA: W tym kroku wykorzystuje się BoNT i należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się i utylizacji wszelkich odczynników i materiałów, które mają kontakt z toksyną. Stosowanie środków ochrony osobistej i właściwa utylizacja wszystkich materiałów muszą odbywać się zgodnie z wytycznymi OSHA Departamentu Pracy USA dla BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Dodać BoNT/A do powierzchni próbki o masie 2 g do końcowego stężenia 30 000 mLD₅₀/g żywności (60 000 mLD_{ogółem 50}).
      4. Próbki rozcieńczalnika i wzbogacone należy inkubować w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez 2 godziny, aby dać BoNT czas na interakcję z matrycą pokarmową, naśladując naturalne zanieczyszczenie.
2. Homogenizacja próbki i regulacja buforu. Przetwarzać próbkę z wzbogaconą krzywą wzorcową i rozcieńczalnik wygenerowany powyżej zgodnie z typem próbki.
   1. Próbki o niskiej złożoności
      1. Nie jest konieczne dalsze przetwarzanie próbki.
   2. Płynne próbki żywności (lub inne złożone próbki cieczy)
      1. Homogenizacja próbki nie jest konieczna.
      2. Dodać 140 μl 10x buforu neutralizującego do 1,4 ml próbki wzbogaconej i 1 ml 10x buforu neutralizacyjnego do 10 ml próbki rozcieńczalnika. Dobrze wymieszaj próbki przez odwrócenie.
      3. Częściowo sklarować obie próbki przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 6 000 x g i w temperaturze 4 °C. Natychmiast usunąć supernatanty i przenieść do nowych probówek.
   3. Stałe próbki żywności (lub inne próbki stałe)
      1. Dodać 2 ml GPB (1 ml GPB/g żywności) do 2 g próbki stałego pokarmu z dodatkiem BoNT/A i 10 ml GPB do 10 g próbki rozcieńczalnika.
      2. Homogenizować próbki za pomocą tłuczka, aż do całkowitego wymieszania. W zależności od charakteru próbki mogą występować małe kawałki materiału, których nie można zhomogenizować, co jest dopuszczalne. Alternatywnie można stosować metody homogenizacji mechanicznej. Nie zaleca się używania blendera, ponieważ może on dezaktywować, a także rozpylać toksynę.
      3. Dodać 1/10 objętości 10-krotnego buforu neutralizacyjnego do próbki rozcieńczalnika w oparciu o przybliżoną całkowitą objętość (np. 2 ml, jeśli objętość wynosi 20 ml). Ekstrapolować całkowitą objętość próbki wzbogaconej BoNT/A i dodać 1/10 objętości 10-krotnego buforu neutralizacyjnego. Dobrze wymieszaj próbki przez odwrócenie.
      4. Częściowo sklarować obie próbki przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 6 000 x g i w temperaturze 4 °C. Natychmiast usunąć supernatanty i przenieść do nowych probówek.
3. Przygotowanie seryjnych rozcieńczeń krzywej wzorcowej do testowania
   1. Używając próbki z krzywej wzorcowej wzbogaconej BoNT/A jako D1 i próbki bez wzbogacania jako rozcieńczalnika, należy wygenerować pozostałe próbki krzywej wzorcowej w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zgodnie z tabelą 3.

3. Przygotuj nieznane próbki

Tę sekcję można wypełnić równolegle z sekcją 2.

1. Określ liczbę i rozcieńczenia niewiadomych. Jeśli to możliwe, przetestuj niewiadome w trzech egzemplarzach.
   1. W przypadku testów jakościowych należy przeprowadzić niewiadome bez dalszego rozcieńczania niż jest to wymagane do przetworzenia próbki zgodnie z opisem poniżej.
   2. W przypadku analiz ilościowych należy przygotować co najmniej dwie próbki o rozcieńczeniu 1:10, jak opisano poniżej, aby upewnić się, że jedna lub więcej próbek mieści się w liniowym zakresie odpowiedzi testu. Wytwarzać rozcieńczalniki przy użyciu rozcieńczalnika o tej samej matrycy, co nieznany, jeśli to możliwe, w celu zmniejszenia wpływu matrycy, jak opisano w sekcji 3. W przeciwnym razie użyj PBS lub GPB jako rozcieńczalnika.
2. Generowanie i rozcieńczanie nieznanych próbek w zależności od typu próbki.
   1. Niewiadome o niskiej złożoności (np. PBS, GPB lub farmaceutyczne)
      1. Dodać co najmniej 750 μl nieznanego roztworu do probówki mikrowirówkowej, aby uzyskać Nieznane rozcieńczenie 1.
      2. Dodać 675 μl rozcieńczalnika do dwóch probówek do mikrowirówek oznaczonych jako Nieznane rozcieńczenie 2 i 3. Rozcieńczalnik będzie tym samym materiałem, który jest używany do generowania krzywej standardowej.
      3. Seryjnie rozcieńczać rozcieńczalnik 1, przenosząc 75 μl rozcieńczenia 1 do probówki z rozcieńczalnikiem 2 i mieszając.
      4. Rozcieńczenie 2 rozcieńczyć seryjnie, przenosząc 75 μl rozcieńczenia 2 do probówki z rozcieńczeniem 3 i mieszając.
   2. Nieznane informacje o płynnej żywności (lub inne złożone próbki cieczy) Uwaga: Zaleca się przeprowadzenie wstępnych badań w celu określenia objętości supernatantu odzyskanego z oczyszczonych próbek, jak omówiono w sekcji 3. W razie potrzeby zwiększyć wielkość próby.
      1. Dodać ≥ 875 μl nieznanego płynu do probówki mikrowirówkowej.
      2. Dodać 1/10 objętości 10-krotnego buforu neutralizacyjnego do próbki (np. 87,5 μl dla próbki 875 μl).
      3. Częściowo sklarować próbkę przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 6 000 x g i w temperaturze 4 °C. Natychmiast przenieść supernatant do nowej probówki. To jest Nieznane rozcieńczenie 1.
      4. Dodać 675 μl rozcieńczalnika do dwóch probówek oznaczonych jako Nieznane rozcieńczenie 2 i 3. Rozcieńczalnik będzie tym samym przetworzonym materiałem, który jest używany do generowania krzywej standardowej.
      5. Seryjnie rozcieńczać rozcieńczalnik 1, przenosząc 75 μl rozcieńczenia 1 do probówki z rozcieńczalnikiem 2 i mieszając.
      6. Rozcieńczenie 2 rozcieńczyć seryjnie, przenosząc 75 μl rozcieńczenia 2 do probówki z rozcieńczeniem 3 i mieszając.
   3. Nieznana stała żywność (lub inne próbki stałe) Uwaga: Zaleca się przeprowadzenie wstępnych badań w celu określenia objętości supernatantu odzyskanego z oczyszczonych próbek, jak omówiono w sekcji 3. W razie potrzeby zwiększyć wielkość próby.
      1. Odważyć 2 g nieznanej próbki stałej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
      2. Dodać 2 ml GPB (1 ml GPB/g żywności) do 2 g próbki stałej.
      3. Homogenizować próbki zgodnie z opisem w sekcji 3.2.3.2.
      4. Dodać 1/10 objętości 10-krotnego buforu neutralizacyjnego do próbki w oparciu o przybliżoną całkowitą objętość (np. 0,4 ml, jeśli objętość wynosi 4 ml). Dobrze wymieszaj próbki przez odwrócenie.
      5. Częściowo sklarować próbkę przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 6 000 x g i temperaturze 4 °C. Natychmiast przenieść ≥750 μl supernatantu do probówki do mikrowirówki. To jest Nieznane rozcieńczenie 1.
      6. Dodać 675 ml rozcieńczalnika do dwóch probówek oznaczonych jako Nieznane rozcieńczenie 2 i 3. Rozcieńczalnik będzie tym samym przetworzonym materiałem, który jest używany do generowania krzywej standardowej.
      7. Seryjnie rozcieńczać rozcieńczalnik 1, przenosząc 75 μl rozcieńczenia 1 do probówki z rozcieńczalnikiem 2 i mieszając.
      8. Rozcieńczenie 2 rozcieńczyć seryjnie, przenosząc 75 μl rozcieńczenia 2 do probówki z rozcieńczeniem 3 i mieszając.

4. Wyjaśnienie próbki końcowej

W przypadku badania płynnych lub stałych próbek żywności należy odwirować wszystkie próbki przez 5 minut przy ≥14 000 x g w mikrowirówce, aby w pełni sklarować próbki. Natychmiast usunąć supernatanty i przenieść do nowych probówek.

5. Ustawienie płyty i ściąganie BoNT/A

1. Konkretny układ płyt jest zależny od zastosowania, jednak nie należy używać zewnętrznych studzienek, aby uniknąć efektów krawędziowych. Każda nieznana próbka i próbka krzywej standardowej D1-D8 wymaga 3 dołków, podczas gdy próbka D9 wymaga 6 dołków. Sugerowany układ blach pokazano na rysunku 1.
2. Dodaj 20 μl 10x buforu wiążącego do każdego dołka, który ma być użyty.
3. Dodać 200 μl każdego oczyszczonego rozcieńczenia i nieznanego do każdej z trzech studzienek (sześć studzienek dla D9) w celu przeprowadzenia potrójnego testu. Mieszaj płytkę przez 10 sekund na mikserze do mikropłytek.
4. Dodaj koraliki IP-A.
   1. Wiruj kulki IP-A przez 10 sekund z najwyższą prędkością. Kontynuuj wirowanie, jeśli kulki nie są w pełni zawieszone i jednorodne.
   2. Odpipetować 20 μl kulek IP-A do każdej studzienki próbki.
   3. Mieszaj płytkę przez 30 sekund na mikserze do mikropłytek.
5. Inkubować płytkę za pomocą inkubatora z obrotową płytką przez 2 godziny przy 750 obr./min, 25 °C lub RT. Wydajność testu w dużym stopniu zależy od wytwarzania i utrzymywania zawiesiny kulek IP-A podczas wszystkich etapów inkubacji. Po granulowaniu należy zawsze ponownie zawiesić kulki za pomocą mieszalnika do mikropłytek i utrzymywać zawiesinę za pomocą orbitalnej wytrząsarki płytkowej do mikromiareczkowania podczas wszystkich etapów inkubacji.

6. Mycie płytek i ponowne zawieszenie koralików

1. Umyj płytki ręcznie lub za pomocą automatycznej myjki do płyt kompatybilnej z kulkami magnetycznymi. Zautomatyzowana myjka do płytek skonfigurowana pod kątem kulek magnetycznych znacznie zwiększa wydajność testów.
   1. Mycie ręczne
      1. Oznacz stożkową probówkę o pojemności 50 ml jako "1x bufor do płukania" i dodaj 45 ml wody klasy biologii molekularnej i 5 ml 10x buforu do płukania matrycy. Dobrze wymieszaj bufor przez inwersję.
      2. Wyjąć płytkę z inkubatora z obrotową płytką.
      3. Natychmiast umieść płytkę na 96-dołkowej magnetycznej płytce rozdzielającej kulki na 5 minut.
      4. Trzymając płytkę na 96-dołkowej płytce do oddzielania kulek magnetycznych, delikatnie usuń i wyrzuć supernatanty z dołków na próbkę za pomocą pipety jedno- lub wielokanałowej. Nie zasysaj kulek - wizualnie monitoruj zasysany bufor w końcówce pipety pod kątem przypadkowego usunięcia kulki. Jeśli zauważysz usunięcie, delikatnie dodaj zawartość końcówki z powrotem do studzienki, oddziel i powtórz usuwanie.
      5. Dodać 300 μl 1x bufor do przemywania do każdej studzienki próbki.
      6. Całkowicie zawieś kulki, mieszając płytkę przez 30 sekund na mieszadle do mikropłytek.
      7. Inkubować płytkę na 96-dołkowej płytce do oddzielania kulek magnetycznych przez 2 minuty.
      8. Usunąć i wyrzucić supernatanty z dołków na próbki, jak poprzednio.
      9. Powtórz kroki 6.1.1.5-6.1.1.8 jeszcze trzy razy, co daje w sumie 4 prania.
      10. Trzymając płytkę na 96-dołkowej płytce do separacji kulek magnetycznych, sprawdź wzrokowo studzienki, aby potwierdzić usunięcie nawet supernatantu; w razie potrzeby użyj pipety, aby usunąć nadmiar resztkowego buforu. Pewna ilość buforu pozostanie w studzienkach i należy zachować ostrożność, aby uniknąć usunięcia kulek lub wysuszenia kulek.
      11. Dodać 50 μl 1x bufor reakcyjny do każdej studzienki próbki i mieszać płytkę przez 30 sekund w mieszalniku do mikropłytek, aby całkowicie zawiesić kulki. W razie potrzeby użyj pipety, aby całkowicie zawiesić kulki.
   2. Automatyczne mycie płyt
      1. Ustaw i zaprogramuj pralkę zgodnie z tabelą 4. Wyczyść i przepłucz pralkę wysokiej jakości (np. nanopure) wodą.
      2. Zalać pralkę, uruchamiając program "Prime".
      3. Wyjąć płytkę z inkubatora z obrotową płytką.
      4. Natychmiast umieść płytkę na 96-dołkowej magnetycznej płytce rozdzielającej kulki na myjce płytowej.
      5. Uruchom program łączący "Master Wash". Pierwszym krokiem programu jest 5-minutowy etap inkubacji, w którym myjka będzie nieruchoma.
      6. Po zakończeniu programu wyjmij płytkę z myjki, dodaj 50 μl 1x buforu reakcyjnego do każdej studzienki próbki i mieszaj płytkę przez 30 sekund w mieszalniku do mikropłytek, aby całkowicie zawiesić kulki. W razie potrzeby użyj pipety, aby całkowicie zawiesić kulki.

7. Inicjacja i inkubacja testu

1. Dodać 50 μl 0,5 μM A/E reportera (patrz sekcja 1) do każdej studzienki na próbkę i mieszać przez 30 sekund na mieszalniku do mikropłytek, aby całkowicie zawiesić kulki.
2. Dodaj 100 μl wody do każdego niewykorzystanego dołka na płytce, aby zapobiec efektom krawędzi.
3. Uszczelnić płytkę taśmą uszczelniającą do płytek i inkubować płytkę za pomocą inkubatora z obrotową płytką przy prędkości 750 obr./min, 25 °C lub RT. Podczas inkubacji należy chronić płytkę przed światłem.

8. Gromadzenie i analiza danych

Uwaga: Ten test jest testem w czasie rzeczywistym, który można mierzyć wiele razy, aż do uzyskania pożądanej czułości, nie są wymagane odczynniki zatrzymujące. Zalecany początkowy czas odczytu to 2, 4 i 24 godziny inkubacji, przy czym czułość testu wzrasta wraz z czasem inkubacji.

1. Gromadzenie danych
   1. Przy każdym odczycie należy wyjąć płytkę z inkubatora z obrotową płytką, usunąć taśmę uszczelniającą i natychmiast umieścić płytkę na 96-dołkowej płytce do separacji kulek magnetycznych. Pozwól koralikom się rozdzielić na 2 minuty.
   2. Umieścić płytkę w czytniku mikropłytek i zmierzyć emisje przy ~470 i ~526 nm pod wzbudzeniem przy ~434 nm.
   3. Jeśli wymagane są dodatkowe czasy odczytu, ponownie zawiesić kulki na 30 sekund w mieszalniku do mikropłytek, ponownie zamknąć płytkę i włożyć płytkę z powrotem do inkubatora z obrotową płytką.
2. analiza danych
   1. Obliczyć współczynnik emisji dla każdej próbki, dzieląc wartość względnej jednostki fluorescencji (RFU) przy długości fali 526 nm przez wartość RFU przy długości fali 470 nm.
   2. Wykreślić stosunek emisji w funkcji logarytmu [BoNT/A] dla punktów danych krzywej standardowej. W zależności od badanego zakresu siły działania BoNT/A otrzymana zostanie sigmoidalna krzywa dawka-odpowiedź (patrz Reprezentatywne wyniki).
   3. Dopasuj dane krzywej standardowej do krzywej dawka-odpowiedź o zmiennym nachyleniu Y=Dół+(Góra-dół)/(1+10^((logEC_50-X)*Nachylenie wzgórza)), gdzie X jest logarytmem stężenia, Y jest odpowiedzią, a Y zaczyna się od dołu i przechodzi do góry o kształcie sigmoidalnym.
   4. Określić granice wykrywalności (LOD), granice oznaczalności (LOQ) i połowę maksymalnego stężenia skutecznego (EC₅₀). Granice wykrywalności definiuje się jako próbkę, której stosunek emisji jest mniejszy niż 3 odchylenia standardowe (SD) poniżej ślepej próby kontrolnej (n = 6). Granice oznaczalności definiuje się jako próbkę o stosunku emisji mniejszym niż 10 SD poniżej ślepej próby kontrolnej (n = 6). EC₅₀ wyznacza się na podstawie sigmoidalnego dopasowania krzywej dawka-odpowiedź.
   5. Należy interpolować siłę działania wszelkich nieznanych próbek w stosunku do sigmoidalnej krzywej wzorcowej dawka-odpowiedź.
      1. W przypadku wyników ilościowych nieznana próbka powinna w idealnym przypadku mieścić się w liniowej części krzywej wzorcowej. Przybliżyć liniową część krzywej standardowej, obliczając całkowity zakres odpowiedzi testu wynoszący 20–80% (np. jeżeli współczynnik emisji krzywej standardowej mieści się w zakresie 0,5–2,5, zakresem liniowym byłaby część krzywej standardowej, która mieści się w zakresie 0,9–2,1).
      2. Aby uzyskać wyniki jakościowe, porównaj nieznaną próbkę z LOD i LOQ krzywej wzorcowej.
      3. Nie ekstrapolować nieznanych próbek poza granice krzywej wzorcowej.

Results

Diagram podsumowujący kroki w opisanym protokole jest pokazany na rysunku 2. Test wymaga od 4 do 26 godzin w zależności od rodzaju próbki i pożądanej czułości testu, ale tylko ~ 2 godziny czasu praktycznego. Test jest wykonywany na płytkach 96-dołkowych i, w zależności od rodzaju wykonywanego testu, umożliwia trzykrotne testowanie do 20 próbek, w tym wzorców na płytkę.

Rysunek 3 pokazuje reprezentatywne wyniki testów z użyciem holotoksyny BoNT/A wzbogaconej do...

Discussion

Protokół ten opisuje procedury ilościowego oznaczania kompleksu BoNT/A, holotoksyny lub supernatantu kultury Clostridium w złożonych matrycach. Protokół jest jednak taki sam w przypadku testowania innych serotypów BoNT (np. BoNT/B, E i F) z ich odpowiednimi testami matrycowymi^56,60, chociaż czułość testu będzie się różnić w zależności od serotypów i testów. Protokół ten nie uwzględnia każdego możliwego rodzaju próbki i mogą być wymagane pewne modyfikacje w zależności od konkretnego składu pró...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw do wykrywania neurotoksyny botulinowej BoTest Matrix A	Dostępne są również zestawy do wykrywania BioSentinel A1015 dla BoNT/B i F.
Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych Varioskan	Flash Thermo Fisher Scientific	5250040	Można stosować większość jednostek monochromatorowych lub filtrowych o zdolności wzbudzenia 434 nm i emisji 470 nm i 526 nm.
96-dołkowa magnetyczna płytka separująca kulki	V& P Scientific	VP771H	Można stosować inne płytki magnetyczne, ale płytka powinna być zaprojektowana tak, aby oddzielać koraliki z boku studni.
Magnetyczna myjka do talerzy BioTek		ELx405 VSRM	Opcjonalna, wymagana tylko do automatycznego mycia płyt.  Można również użyć innych podkładek płytowych kompatybilnych z koralikami magnetycznymi, ale należy je przetestować przed użyciem.
Mikrowirówka			Opcjonalna, wymagana tylko w przypadku próbek wymagających odwirowania.
Mikser płytowy MixMate
			C Jeśli dostępna jest kontrola temperatury
tabletki z inhibitorem proteazy bez EDTA,	Roche	4693132001	Wymagane tylko do badań żywności lub środowiska. Inhibitory proteazy muszą być wolne od EDTA.
BoNT/A	Metabiologics		Opcjonalny, wymagany tylko do celów standaryzacji i kwantyfikacji
Czarne, płaskodenne płytki 96-dołkowe	NUNC	237105	Płytki nie powinny być poddawane obróbce
Taśma uszczelniająca 96-dołkową płytkę	Thermo Fisher Scientific	15036