Artykuł metodologiczny

Sortowanie osadów komórkowych Streptomyces za pomocą złożonego obiektowego analizatora parametrycznego i sortera

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51178

⸱

13 lutego 2014

 ,  ,  , 
1Microbial Biotechnology, Institute Biology Leiden, Leiden University, 2Microbiology, Kluyver Centre for Genomics of Industrial Fermentation, Utrecht University

W tym artykule

Podsumowanie

Hodowle Streptomyces hodowane w płynie charakteryzują się niejednorodnymi rozmiarami granulek grzybni. Opisujemy tutaj metodę analizy i sortowania takich granulek w sposób wysokoprzepustowy. Granulki te mogą być wykorzystane do dalszych analiz, które dostarczą wskazówek do zrozumienia i kontrolowania niejednorodności wzrostu.

Streszczenie

Streptomycetes to nitkowate bakterie glebowe, które są wykorzystywane w przemyśle do produkcji enzymów i antybiotyków. Organizmy te, hodowane w bioreaktorach, tworzą sieci połączonych ze sobą strzępek, znanych jako granulki, które są niejednorodne pod względem wielkości. Tutaj opisujemy metodę analizy i sortowania granulek grzybni za pomocą Analizatora i Sortera Parametrów Złożonych Obiektów (COPAS). Podano szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z przyrządu i podstawowej analizy statystycznej danych. Ponadto opisujemy, w jaki sposób granulki mogą być sortowane zgodnie z ustawieniami zdefiniowanymi przez użytkownika, co umożliwia dalsze przetwarzanie, takie jak analiza zawartości RNA lub białka. Korzystając z tej metodologii, można zająć się mechanizmem leżącym u podstaw niejednorodnego wzrostu. Będzie to miało zasadnicze znaczenie dla ulepszenia paciorkowców jako fabryki komórek, biorąc pod uwagę fakt, że produktywność koreluje z rozmiarem granulek.

Wprowadzenie

Streptomycetes to nitkowate bakterie glebowe, które są dobrze znane ze swojej biegłości w wytwarzaniu antybiotyków, a także związków, które mogą być używane jako leki immunosupresyjne lub do zwalczania infekcji grzybiczych lub raka1,2. Ponadto organizmy te wytwarzają enzymy, które są interesujące w szerokim zakresie zastosowań przemysłowych3. Większość z tych interesujących komercyjnie związków jest wytwarzana w bioreaktorach. Wzrost paciorkowców w bioreaktorach charakteryzuje się tworzeniem złożonych struktur połączonych ze sobą strzępek, zwanych grudkami lub granulkami. Te wielokomórkowe struktury są wysoce niejednorodne pod względem wielkości4 i mogą osiągać rozmiary ponad milion razy większe niż bakterie jednokomórkowe, takie jak Escherichia coli lub Bacillus subtilis. Chociaż heterogeniczność jest uważana za korzystną cechę w naturalnych systemach biologicznych5, w przemyśle jest uważana za pułapkę produkcyjną. Uprawy w bioreaktorach muszą być powtarzalne i kontrolowane, aby uzyskać jak najwyższe plony. Szczegółowe zrozumienie roli każdego z rodzajów granulek w bioreaktorze ma zatem kluczowe znaczenie dla ulepszenia streptomycetes jako fabryki komórek.

Cytometria przepływowa jest powszechnie używana do analizy pojedynczych komórek w populacji6. Cytometry przepływowe mogą pozyskiwać informacje wieloparametryczne, jednocześnie mierząc cechy komórek (takie jak rozmiar, gęstość i fluorescencja wielobarwna). W ten sposób właściwości komórek mogą być skorelowane, przyczyniając się w ten sposób do zrozumienia heterogeniczności w obrębie kultury i istnienia odrębnych populacji komórek6. Bardziej wyspecjalizowane instrumenty umożliwiły sortowanie komórek według parametrów zdefiniowanych przez użytkownika. Na przykład mutanty mogą być poddawane badaniom przesiewowym. Po sortowaniu takie zmutowane komórki mogą być hodowane w celu dalszej charakterystyki. Okazało się to już przydatne m.in. w celu poprawy produktywności szczepów7,8. Dysze cytometrów przepływowych zazwyczaj pozwalają na przejście komórek o maksymalnej średnicy około 10 μm. Dlatego osady paciorkowców nie mogą być analizowane za pomocą zwykłych cytometrów przepływowych. Można je jednak analizować za pomocą Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS). Podobnie jak zwykłe cytometry przepływowe, COPAS może pozyskiwać wieloparametryczne dane o cząstkach w sposób wysokoprzepustowy. W zależności od rodzaju COPAS można analizować cząstki o wielkości 10-1 500 μm. Ponadto pozwala na sortowanie pojedynczych cząstek, które można wykorzystać do hodowli lub dalszych analiz, takich jak izolacja DNA, RNA lub białek. COPAS został początkowo zaprojektowany do analizy i sortowania małych organizmów wielokomórkowych, takich jak nicienie Caenorhabditis elegans9 oraz zarodki i larwy Drosophila 10. Instrumenty te zostały również wykorzystane w przypadku danio pręgowanego11 i grzybów strzępkowych12,13. Te ostatnie organizmy tworzą również osady grzybni, które są jeszcze większe niż te tworzone przez bakterie nitkowate. Niedawno wykazaliśmy, że zastosowanie COPAS jest również możliwe w przypadku Streptomycetes4. Opisujemy tutaj eksperymentalną procedurę wykorzystania COPAS do oceny niejednorodności osadów u Streptomyces coelicolor, w tym szczegóły dotyczące metodologii sortowania osadów według wielkości. Należy jednak pamiętać, że metoda ta może być również stosowana do analizy innych paciorkowców tworzących osady.

Protokół

Procedura analizy i sortowania granulek Streptomyces z dwudniowej kultury uprawianej w płynie jest schematycznie przedstawiona na rysunku 1. Szczegóły dotyczące metody podano poniżej.

1. Wzrost (w tym przygotowanie pożywek i)

  1. Przygotować 1 l 10 x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4 w 1 l wody destylowanej dostosowanej do pH 7,4). W momencie użycia dodać 100 ml 10x PBS do 900 ml wody destylowanej, aby uzyskać 1 L PBS.
  2. Przygotuj 1 l pożywki YEME (3 g ekstraktu drożdżowego Difco, 5 g peptonu Bacto, 3 g ekstraktu słodowego Oxoid, 10 g glukozy, 340 g sacharozy, woda destylowana do 1 l) i 100 ml 2,5 M MgCl2. Wysterylizuj oba roztwory w autoklawie. Należy pamiętać, że można również stosować inne podłoża Streptomyces 4,14.
  3. Dodać 100 ml pożywki YEME i 0,2 ml 2,5 M MgCl2 do sterylnej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml wyposażonej w metalowe sprężyny zwijane. Przygotuj tyle kolb, ile próbek bakterii do badania.
  4. Zaszczepić każdą kolbę10-8 zarodnikami Streptomyces, aby uzyskać stężenie przetrwalników 10-6 zarodników/ml. Hodować bakterie przez 2 dni w temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 180 obr./min.

2. Pobieranie próbek

  1. Przenieść 5 ml próbki z każdej kultury do 15 ml probówki Falcon za pomocą sterylnej pipety o pojemności 5 ml. Delikatnie potrząśnij kulturą podczas pobierania próbki, aby upewnić się, że próbka jest reprezentatywna dla całej kultury.
  2. Gdy próbki są analizowane natychmiast za pomocą COPAS, nie są konieczne żadne etapy przygotowania próbki. Utrzymuj próbkę na lodzie i przejdź do kroku 3.1 niniejszego protokołu. Gdy próbki są analizowane w późniejszym czasie, należy utrwalić granulki zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.5 niniejszego protokołu. Należy pamiętać, że mocowanie zapobiega również rozwojowi bakterii w systemie przewodów, gdy nie jest odpowiednio czyszczony po analizach. Upewnij się, że utrwalenie formaldehydem nie utrudnia dalszych analiz. Na przykład RNA nie można było wyizolować z granulek grzybów po utrwaleniu formaldehydem. Natomiast RNA udało się wyizolować po utrwaleniu z 70% etanolem12.
  3. Dodać 600 μl 37% formaldehydu do 5 ml próbki i wymieszać odwracając probówkę 3x. Utrwalić próbki na lodzie na 30 minut.
  4. Odwirować próbki o masie 2 500 x g w stałym wirniku w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i przemyć granulki 5 ml PBS.
  5. Powtórz krok 2.4, aby granulki zostały umyte PBS 2x. Próbki mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.

3. Analiza COPAS

  1. Upewnij się, że COPAS Plus, pompa, komputer i laser argonowy 488 nm są włączone i uruchom oprogramowanie Biosort. Mimo że laser jest włączony, nadal będzie w trybie czuwania.
  2. Sprawdź, czy butelka z płynem w osłonie jest pełna, a butelka na odpady jest pusta.
  3. Kliknij "START", a następnie "URUCHOM", aby przełączyć laser argonowy 488 nm z trybu czuwania na włączony. Po około 60 sekundach, gdy laser jest włączony, kliknij "GOTOWE".
  4. Sprawdź manometry. Naciski dla "Pochwy", "Próbki", "Sortera" i "Czystej" powinny wynosić odpowiednio około 4,0, 0,5, 2,7 i 10,9.
  5. Kliknij pole wyboru obok opcji "Ciśnienie OK". Następnie system zalewa komórkę przepływową i jest gotowy do użycia.
  6. Zakłada się, że ustawienia standardowe są ustawione z "Opóźnieniem" na 11 i "Szerokością" 7. Progi ustalono na poziomie 50 dla "sygnału" i 40 dla "minimum TOF", przy czym TOF oznacza czas przelotu. (Dla kompletności: wszystkie "Wzmocnienia" są ustawione na 1, wyzwalacz jest ustawiony na EXT (Extinction) i w zakładce "Konfiguracja" w sekcji "Wybierz szybkość skanowania" wybiera się 2.50 MHz. Zbieżność jest ustawiona na "Wzmocniona").
  7. Usunąć resztki wody z kubka na próbkę i dodać do kubka 0,1 ml próbki Streptomyces z kroku 2.2 lub 2.5 razem z PBS (około 50 ml). Upewnij się, że kubek na próbkę jest prawidłowo zamknięty.
  8. Kliknij "Pobierz", aby rozpocząć zbieranie danych. Zarządzaj prędkością przepływu, aby uzyskać od 30 do 50 zdarzeń na sekundę. Jeśli przepływ jest zbyt duży, dodać PBS do kubka na próbkę. Jeśli prędkość przepływu jest zbyt niska, dodaj więcej próbki.
  9. Po zebraniu co najmniej 2 500 zdarzeń kliknij przycisk "STOP". Aby zapisać wszystkie dane, kliknij "Zapisz" i zapisz plik do późniejszej analizy statystycznej. Oprogramowanie Biosort zapisze dane w czterech plikach, z których tylko .txt plik zostanie wykorzystany do późniejszej analizy.
  10. Oczyścić kubek na próbkę, wyjmując próbkę strzykawką o pojemności 50 ml i przemywając wodą 2x.
  11. Powtarzaj kroki 3.7-3.10, aż wszystkie próbki zostaną przeanalizowane.

4. Analiza danych

  1. Otwórz plik .txt i odrzuć dane z EXT mniejszym niż 25 (używając na przykład MS Excel). Odpowiada to szczątkom i luźnym fragmentom strzępek (w przypadku Aspergillus niger wszystkie dane o EXT niższym niż 150 są odrzucane)4,12. Następnie zapisz wszystkie TOFy w jednej kolumnie w zwykłym pliku '.txt' (dla wielu plików danych można to zautomatyzować w języku programowania R, dostępnym pod adresem: http://www.r-project.org).
  2. Upewnij się, że SciLab (wersja 5.3.2 lub nowsza z http://www.scilab.org/) jest zainstalowany razem z biblioteką 'fittools', która jest dostępna, wraz z instrukcją, pod adresem:
    http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip
    http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual%20fittools.pdf
  3. Uruchom SciLab i uruchom niezbędne funkcje biblioteki fittools do modelowania danych. W skrócie: Zainstaluj bibliotekę fittools, jak pokazano w instrukcji (potrzebne tylko raz).
    1. Załaduj bibliotekę fittools.
    2. Wczytaj dane (plik '.txt') do SciLab.
    3. Log przekształca dane (logarytm naturalny jest domyślną funkcją logarytmu).
    4. Dopasuj model 2 populacji do danych.
    5. Narysuj wykres z histogramem i modelem (opcjonalnie).
    6. Uruchom dane (1 000 replikacji).
    7. Dopasuj model do początkowych zestawów danych.
    8. Uzyskaj oszacowania przedziałów ufności dla 5 parametrów. Dostarczy to informacji na temat ułamka partycypacji (p) populacji, ich 2 średnich (μ1 i μ2) oraz towarzyszących im odchyleń standardowych (α1 i α2). Co więcej, 95% przedziały ufności są określane przez ponowne dopasowanie do modelu po bootstrappingu (1 000 powtórzeń)12,13,15. Gdy przedziały ufności średnich nie nakładają się na siebie, a przedział ufności p mieści się w przedziale 0,025-0,975, zbiór danych można wyjaśnić jako kombinację dwóch populacji rozkładów normalnych. (Zauważ, że udział małych granulek wynosi p, podczas gdy udział dużych granulek wynosi 1-p.) Zależność między TOF a średnicą osadu Streptomyces wynosi 0,57 × TOF + 159 μm4.
  4. W przypadku znalezienia dwóch populacji, należy użyć średnich TOF-ów jako parametrów sortowania w COPAS jako górnej i dolnej granicy, aby następnie posortować małe i duże granulki. Należy pamiętać, że w zależności od wymagań użytkownika można wybrać również inne parametry sortowania.

5. Sortowanie granulek

  1. Załaduj próbkę Streptomyces, którą należy posortować, zgodnie z opisem w kroku 3.7.
  2. Ustaw "Limity sortowania" i podaj szczegółowe informacje o minimalnych (Lo) i maksymalnych (Hi) wartościach TOF. Alternatywnie, ustaw obszar, wybierając "Regiony", a następnie "Zdefiniuj region bramy", aby wybrać granulki o żądanych wymiarach lub właściwościach.
  3. Umieść probówkę o pojemności 50 ml, aby zebrać wiele granulek, które spełniają parametry sortowania. Alternatywnie, do sortowania pojedynczych granulek można użyć płytki z mikromiareczkowaniem. Do ekstrakcji DNA i białek potrzebnych jest wiele granulek (10,4-10,5). Pojedyncza osadówka jest wystarczająca do analizy ekspresji genów qPCR, ale do sekwencjonowania RNA potrzebnych jest wiele osadów.
  4. Zdecyduj i ustaw liczbę granulek, które należy posortować, a następnie kliknij "Sortuj ręcznie", aby posortować według wybranych parametrów. Po osiągnięciu ustawionej ilości granulek sortowanie kończy się automatycznie.
  5. Usunąć resztki próbki za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml z kubka na próbkę i umyć kubek wodą 2x. Powtórzyć kroki 5.1-5.5, jeśli konieczne jest sortowanie innych próbek.
  6. Przed wyłączeniem COPAS przepłukać kubek na próbkę wodą, aby usunąć pozostałe granulki i oczyścić kubek na próbkę 70% EtOH i/lub 2% podchlorynem w wodzie. Uruchom próbkę chlorowanej wody, aby wyczyścić cały system i powtórz to z wodą. Opróżnij pojemnik przelewowy i wyczyść lub wymień filtr, który znajduje się w tym pojemniku.
  7. Po zakończeniu kliknij "STOP", aby zwolnić ciśnienie z systemu. Gdy silnik się zatrzyma, zamknij program i kliknij "Wyłącz bez czyszczenia". Następnie wyłącz komputer, COPAS, laser i pompę.

Wyniki

Pomiary COPAS granulatów Streptomyces
Streptomycety tworzą w kulturach płynnych grzybniowe granulaty o szerokim zakresie rozmiarów. Aby przeanalizować rozkład wielkości granulatów, 2-dniową kulturę Streptomyces coelicolor hodowaną w cieczy poddano cytometrii przepływowej dużych cząstek z użyciem urządzenia COPAS Plus Profiler wyposażonego w dyszę 1 mm. Typowym wynikiem z COPAS jest wykres rozrzutu, taki jak przedstawiono na Rysunku 2A. Oś x reprezentuje czas przelotu (TOF), który koreluje z wielkością granulatu (t.j. większe granulaty potrzebują więcej czasu, aby przejść przez wiązkę lasera). Oś y pokazuje ekstynkcję, która reprezentuje gęstość optyczną obiektu. Każdy punkt na wykresie rozrzutu odpowiada pojedynczemu zdarzeniu, t.j. pojedynczemu granulatowi przechodzącemu przez wiązkę lasera. Co ważne, gdy próbka jest zbyt skoncentrowana (t.j. gdy laser wykrywa więcej niż 100 zdarzeń/s), urządzenie COPAS często nie jest w stanie wykryć poszczególnych granulatów. Prowadzi to do uzyskania fałszywych, zbyt wysokich wartości TOF. Rozcieńczenie próbki zmniejsza średnie wartości TOF, aż do momentu, w którym dalsze rozcieńczanie nie wpływa już na TOF. Punkt ten zostaje osiągnięty, gdy analizowanych jest około 100 granulatów/s.

Naniesienie punktów danych na histogram wskazuje, że rozmiary nie mają rozkładu normalnego (Rysunek 2B). Rozkład wydaje się być prawostronnie skośny. Transformacja logarytmiczna zbioru danych również nie doprowadziła do uzyskania rozkładu normalnego (Rysunek 2C). Aby ocenić, czy rozkład rozmiarów można wyjaśnić, zakładając mieszaninę dwóch rozkładów normalnych, dane poddano modelowaniu matematycznemu12,15. Modelowanie rzeczywiście wykazało, że rozkład rozmiarów można wyjaśnić, zakładając istnienie dwóch odrębnych populacji granul. Populacja małych granul stanowiła 92% wszystkich granul ze średnią wielkością 248 μm, podczas gdy populacja dużych granul (8% wszystkich granul) miała średnią wielkość 319 μm (należy zauważyć, że zakłada się istnienie dwóch populacji, gdy ułamek udziału mieści się w zakresie 2,5-97,5%).
Sortowanie granul Streptomyces według rozmiaru

Przeprowadzono sortowanie mikrokolonii z populacji dużych i małych granulek. W tym celu, aby zdefiniować granice sortowania, wykorzystano średnie rozmiary granulek z obu populacji. Granulki o rozmiarze mniejszym niż 248 μm uznano za pochodzące z populacji małych granulek, natomiast granulki większe niż 319 μm uznano za pochodzące z populacji dużych granulek (Rysunek 3), co miało na celu ograniczenie sortowania granulek z nakładającej się części obu rozkładów wielkości. Analiza mikroskopowa posortowanych granulek potwierdziła ich wyraźne różnice w rozmiarach (Rysunek 3). Zebrane granulki mogą być następnie wykorzystane do izolacji DNA, RNA lub białek.

Schemat blokowy szczegółowo przedstawiający proces wzrostu, pobierania próbek, analizy COPAS, analizy danych oraz sortowania granulek.
Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie układu eksperymentalnego do pomiaru i analizy granulek Streptomyces przy użyciu systemu COPAS. Szczegóły znajdują się w procedurach eksperymentalnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Analiza czasu przelotu; wykres pokazujący korelację wygaszenia, rozkład szczytów i zmienność w skali logarytmicznej.
Rycina 2. Heterogeniczność wielkości granulek w kulturach Streptomyces hodowanych w cieczy. Analiza COPAS 2-dniowej kultury S. coelicolor w podłożu YEME (A) wskazuje, że wielkości granulek (wyrażone jako wartości Time of Flight) nie mają rozkładu normalnego (B) i nie przyjmują go również po przekształceniu logarytmicznym (C). Zamiast tego wykryto dwie populacje granulek różniące się TOF (a tym samym wielkością). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Analiza rozkładu wielkości komórek, wykres histogramu, obrazy mikroskopowe, porównanie dwóch szczytów populacyjnych.
Rysunek 3. Frakcjonowanie grudek Streptomyces według wielkości. Grudki o wielkości mniejszej niż 248 μm (oznaczone na różowo) uznano za grudki małe, natomiast grudki o wielkości większej niż 319 μm (oznaczone na niebiesko) uznano za grudki duże. Analiza mikroskopowa potwierdziła różnicę w wielkości. Należy zauważyć, że wielkości te obliczono z danych po transformacji logarytmicznej, wykorzystując opisany związek między TOF a średnicą grudki Streptomyces , który wynosi 0,57 × TOF + 159 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

Cytometria przepływowa umożliwiła szybką analizę dużej liczby pojedynczych komórek, co przyczyniło się do lepszego zrozumienia heterogeniczności w populacjach klonów6. Regularna cytometria przepływowa nie jest możliwa do analizy wielokomórkowych osadów grzybni paciorkowców i grzybów. Nasze prace wykazały, że wysokoprzepustowa analiza granulek Streptomyces jest możliwa przy użyciu COPAS. Opisana tutaj procedura jest prosta, szybka i wysoce powtarzalna. Krytycznym parametrem, o którym należy pamiętać podczas pracy przyrządu, jest prędkość przepływu, która nie powinna przekraczać 100 zdarzeń/s (krok 3.8 tego protokołu). Jeśli stężenie granulek, a tym samym również prędkość przepływu, stanie się zbyt wysokie, wartości TOF zostaną błędnie obliczone, ponieważ przyrząd nie wykryje pojedynczych granulek. Wystarczające rozcieńczenie próbki przez dodanie PBS rozwiązuje ten problem.

Ograniczenia
Zastosowany tutaj COPAS Plus ma średnicę dyszy 1 mm, która nadaje się do pomiaru cząstek o wielkości w zakresie 30-700 μm. Dysza ta umożliwia zatem pomiar granulek utworzonych przez paciorkowce. W przypadku grzybów strzępkowych mikrokolonie mogą być większe, co ogranicza ogólne zastosowanie COPAS Plus. COPAS XL może mierzyć cząstki o wielkości do 1 500 μm, ale jego czułość w dolnym zakresie średnic jest mniejsza w porównaniu z COPAS Plus. Zarówno COPAS Plus, jak i COPAS XL nie mogą analizować cząstek mniejszych niż 30 μm. Oznacza to, że nie można analizować pojedynczych zarodników lub komórek drobnoustrojów. Ponadto, COPAS może nie analizować dokładnie małych agregatów zarodników i komórek lub bardzo małych mikrokolonii. W tym celu należy stosować zwykłe analizatory komórek. To ograniczenie jest pokonywane przez Biosorter firmy Union Biometrica, który może analizować cząstki w zakresie 1-1 500 μm. Nagroda za zakup jest jednak wyższa.

Rozwiązywanie problemów
COPAS to solidny przyrząd, który jest łatwy w obsłudze. Czasami jednak granulki nie są wykrywane po załadowaniu próbki do kubka na próbkę i rozpoczęciu pomiaru. Przyczyną jest zazwyczaj zatkana rura wejściowa, którą można łatwo rozwiązać, naciskając polecenie "wyczyść". Spowoduje to wypchnięcie granulek z powrotem z systemu rurek do kubka na próbkę. Alternatywnym powodem może być nieprawidłowe umieszczenie pokrywki na kubku na próbkę. Prowadzi to do utraty ciśnienia i jednoczesnej niemożności wykrycia granulek.

Znaczenie i kierunki na przyszłość
Skupiliśmy się tutaj na analizie wielkości granulek, ale konfiguracja COPAS jest również w stanie analizować i sortować na podstawie fluorescencji i gęstości. Detekcja fluorescencji umożliwia nam analizę ekspresji genów w oparciu o reportery, takie jak GFP. Ponadto można ocenić skład komórek. Jeszcze mocniejsza jest opcja oddzielania granulek zgodnie z tymi parametrami. Posortowane granulki mogą być wykorzystywane do dalszych analiz, w tym do wszystkich badań -omicznych. Rzeczywiście, wcześniej posortowaliśmy 60 000 dużych i 200 000 małych granulek i wykazaliśmy, że proteom znacznie różnił się między dużymi i małymi granulkami4. Technologia ta dostarcza zatem nowych wskazówek w celu ulepszenia paciorkowców jako fabryk komórek.

Kluczową korzyścią płynącą z technologii COPAS jest czas. Wcześniejsze badania nad granulkami komórkowymi były prowadzone przy użyciu mikroskopii, co ogranicza liczbę granulek, które można przeanalizować, do kilkuset16. Badania mikroskopowe sugerowały już istnienie dwóch populacji osadów w kulturach Streptomyces hodowanych w płynie16. Rzeczywiście, wykryto dwie populacje wypluwek niezależnie od warunków hodowli w dużej liczbie różnych Streptomycetes4. Ta niejednorodność wielkości nie ogranicza się do paciorkowców nitkowatych, ale zaobserwowano ją również u grzybów strzępkowych12. We wszystkich przypadkach mechanizmy leżące u podstaw heterogeniczności nie są jeszcze znane. Możliwość sortowania granulek ze względu na wielkość i fluorescencję pozwala nam rozwikłać takie mechanizmy.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
COPAS PlusUnion BiometricaPLUSCytometr przepływowy dużych cząstek wraz z laserami i oprogramowaniem
NaClSigma AldrichS3014PBS składnik
KClSigma AldrichP9541PBS składnik
Na2HPO4Sigma AldrichS3264PBS składnik
KH2PO4Sigma AldrichP9791Składnik PBS
Ekstrakt drożdżowy Difco BDBiosciences210933Składnik medialny
Bacto PeptoneBD Biosciences211677Składnik podłoża
Ekstrakt ze słodu oksoidowegoFisher ScientificOXLP0039BSkładnik podłoża
GlukozaSigma AldrichG8270Media składnik
sacharozaSigma AldrichS9378Podłoże składnik
MgCl2• 6H2OSigma AldrichM2670Komponenty nośnikowe. Dodać po sterylizacji w autoklawie.
Roztwór formaldehyduSigma AldrichF8775Utrwalanie granulek
Roztwór podchlorynu sodu Sigma Aldrich71696Do czyszczenia instrumentu
EtOHVWR20816.367Do czyszczenia instrumentu
Kolba Erlenmeyera (250 ml)Fisher Scientific214-1132Kolba hodowlana do uprawy Streptomyces
SpringsVerenfabriek De SpiraalCustom-MadeUżywana w kolbie hodowlanej. RVS1.4401/Długość 210 mm/Średnica 17 mm/Podziałka 5 mm
Sterylna probówka wirówkowa (15 ml)Sarstedt62.554.002
Strzykawki (50 ml)SigmaZ683698

Bibliografia

  1. Hopwood, D. A. Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , University Press. New York, Oxford. (2007).
  2. van Wezel, G. P., McDowall, K. J. The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances. Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).
  3. Anné, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. Recombinant protein production and streptomycetes. J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).
  4. van Veluw, G. J., et al. Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).
  5. Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
  6. Davey, H. M., Winson, M. K. Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).
  7. Betz, J. W., Aretz, W., Härtel, W. Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs. Cytometry. 5, 145-150 (1984).
  8. Bell, P. J., et al. A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).
  9. Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. C. elegans: methods and applications. Strange, K. , Springer. 275-286 (2006).
  10. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).
  11. Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
  12. de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., Wösten, H. A. B. Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).
  13. van Veluw, G. J., et al. Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants. Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).
  14. Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. Norwich. (2000).
  15. Vinck, A., et al. Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger. Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).
  16. Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis. Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Granule Streptomycessorter COPAScytometria przepływowaanaliza wielkości granuleksortowanie granulek grzybniczas przelotupomiar ekstynkcjicytometria dużych cząstekheterogeniczność granulekhodowla Streptomyces
Sortowanie osadów komórkowych Streptomyces za pomocą złożonego obiektowego analizatora parametrycznego i sortera
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.