Sortowanie osadów komórkowych Streptomyces za pomocą złożonego obiektowego analizatora parametrycznego i sortera

Summary

Hodowle Streptomyces hodowane w płynie charakteryzują się niejednorodnymi rozmiarami granulek grzybni. Opisujemy tutaj metodę analizy i sortowania takich granulek w sposób wysokoprzepustowy. Granulki te mogą być wykorzystane do dalszych analiz, które dostarczą wskazówek do zrozumienia i kontrolowania niejednorodności wzrostu.

Abstract

Streptomycetes to nitkowate bakterie glebowe, które są wykorzystywane w przemyśle do produkcji enzymów i antybiotyków. Organizmy te, hodowane w bioreaktorach, tworzą sieci połączonych ze sobą strzępek, znanych jako granulki, które są niejednorodne pod względem wielkości. Tutaj opisujemy metodę analizy i sortowania granulek grzybni za pomocą Analizatora i Sortera Parametrów Złożonych Obiektów (COPAS). Podano szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z przyrządu i podstawowej analizy statystycznej danych. Ponadto opisujemy, w jaki sposób granulki mogą być sortowane zgodnie z ustawieniami zdefiniowanymi przez użytkownika, co umożliwia dalsze przetwarzanie, takie jak analiza zawartości RNA lub białka. Korzystając z tej metodologii, można zająć się mechanizmem leżącym u podstaw niejednorodnego wzrostu. Będzie to miało zasadnicze znaczenie dla ulepszenia paciorkowców jako fabryki komórek, biorąc pod uwagę fakt, że produktywność koreluje z rozmiarem granulek.

Introduction

Streptomycetes to nitkowate bakterie glebowe, które są dobrze znane ze swojej biegłości w wytwarzaniu antybiotyków, a także związków, które mogą być używane jako leki immunosupresyjne lub do zwalczania infekcji grzybiczych lub raka^1,2. Ponadto organizmy te wytwarzają enzymy, które są interesujące w szerokim zakresie zastosowań przemysłowych³. Większość z tych interesujących komercyjnie związków jest wytwarzana w bioreaktorach. Wzrost paciorkowców w bioreaktorach charakteryzuje się tworzeniem złożonych struktur połączonych ze sobą strzępek, zwanych grudkami lub granulkami. Te wielokomórkowe struktury są wysoce niejednorodne pod względem wielkości⁴ i mogą osiągać rozmiary ponad milion razy większe niż bakterie jednokomórkowe, takie jak Escherichia coli lub Bacillus subtilis. Chociaż heterogeniczność jest uważana za korzystną cechę w naturalnych systemach biologicznych5, w przemyśle jest uważana za pułapkę produkcyjną. Uprawy w bioreaktorach muszą być powtarzalne i kontrolowane, aby uzyskać jak najwyższe plony. Szczegółowe zrozumienie roli każdego z rodzajów granulek w bioreaktorze ma zatem kluczowe znaczenie dla ulepszenia streptomycetes jako fabryki komórek.

Cytometria przepływowa jest powszechnie używana do analizy pojedynczych komórek w populacji⁶. Cytometry przepływowe mogą pozyskiwać informacje wieloparametryczne, jednocześnie mierząc cechy komórek (takie jak rozmiar, gęstość i fluorescencja wielobarwna). W ten sposób właściwości komórek mogą być skorelowane, przyczyniając się w ten sposób do zrozumienia heterogeniczności w obrębie kultury i istnienia odrębnych populacji komórek⁶. Bardziej wyspecjalizowane instrumenty umożliwiły sortowanie komórek według parametrów zdefiniowanych przez użytkownika. Na przykład mutanty mogą być poddawane badaniom przesiewowym. Po sortowaniu takie zmutowane komórki mogą być hodowane w celu dalszej charakterystyki. Okazało się to już przydatne m.in. w celu poprawy produktywności szczepów^7,8. Dysze cytometrów przepływowych zazwyczaj pozwalają na przejście komórek o maksymalnej średnicy około 10 μm. Dlatego osady paciorkowców nie mogą być analizowane za pomocą zwykłych cytometrów przepływowych. Można je jednak analizować za pomocą Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS). Podobnie jak zwykłe cytometry przepływowe, COPAS może pozyskiwać wieloparametryczne dane o cząstkach w sposób wysokoprzepustowy. W zależności od rodzaju COPAS można analizować cząstki o wielkości 10-1 500 μm. Ponadto pozwala na sortowanie pojedynczych cząstek, które można wykorzystać do hodowli lub dalszych analiz, takich jak izolacja DNA, RNA lub białek. COPAS został początkowo zaprojektowany do analizy i sortowania małych organizmów wielokomórkowych, takich jak nicienie Caenorhabditis elegans⁹ oraz zarodki i larwy Drosophila ¹⁰. Instrumenty te zostały również wykorzystane w przypadku danio pręgowanego¹¹ i grzybów strzępkowych^12,13. Te ostatnie organizmy tworzą również osady grzybni, które są jeszcze większe niż te tworzone przez bakterie nitkowate. Niedawno wykazaliśmy, że zastosowanie COPAS jest również możliwe w przypadku Streptomycetes⁴. Opisujemy tutaj eksperymentalną procedurę wykorzystania COPAS do oceny niejednorodności osadów u Streptomyces coelicolor, w tym szczegóły dotyczące metodologii sortowania osadów według wielkości. Należy jednak pamiętać, że metoda ta może być również stosowana do analizy innych paciorkowców tworzących osady.

Protocol

Procedura analizy i sortowania granulek Streptomyces z dwudniowej kultury uprawianej w płynie jest schematycznie przedstawiona na rysunku 1. Szczegóły dotyczące metody podano poniżej.

1. Wzrost (w tym przygotowanie pożywek i)

1. Przygotować 1 l 10 x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na₂HPO₄, 2,4 g KH₂PO₄ w 1 l wody destylowanej dostosowanej do pH 7,4). W momencie użycia dodać 100 ml 10x PBS do 900 ml wody destylowanej, aby uzyskać 1 L PBS.
2. Przygotuj 1 l pożywki YEME (3 g ekstraktu drożdżowego Difco, 5 g peptonu Bacto, 3 g ekstraktu słodowego Oxoid, 10 g glukozy, 340 g sacharozy, woda destylowana do 1 l) i 100 ml 2,5 M MgCl₂. Wysterylizuj oba roztwory w autoklawie. Należy pamiętać, że można również stosować inne podłoża Streptomyces ^4,14.
3. Dodać 100 ml pożywki YEME i 0,2 ml 2,5 M MgCl₂ do sterylnej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml wyposażonej w metalowe sprężyny zwijane. Przygotuj tyle kolb, ile próbek bakterii do badania.
4. Zaszczepić każdą kolbę^10-8 zarodnikami Streptomyces, aby uzyskać stężenie przetrwalników 10-6 zarodników/ml. Hodować bakterie przez 2 dni w temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 180 obr./min.

2. Pobieranie próbek

1. Przenieść 5 ml próbki z każdej kultury do 15 ml probówki Falcon za pomocą sterylnej pipety o pojemności 5 ml. Delikatnie potrząśnij kulturą podczas pobierania próbki, aby upewnić się, że próbka jest reprezentatywna dla całej kultury.
2. Gdy próbki są analizowane natychmiast za pomocą COPAS, nie są konieczne żadne etapy przygotowania próbki. Utrzymuj próbkę na lodzie i przejdź do kroku 3.1 niniejszego protokołu. Gdy próbki są analizowane w późniejszym czasie, należy utrwalić granulki zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.5 niniejszego protokołu. Należy pamiętać, że mocowanie zapobiega również rozwojowi bakterii w systemie przewodów, gdy nie jest odpowiednio czyszczony po analizach. Upewnij się, że utrwalenie formaldehydem nie utrudnia dalszych analiz. Na przykład RNA nie można było wyizolować z granulek grzybów po utrwaleniu formaldehydem. Natomiast RNA udało się wyizolować po utrwaleniu z 70% etanolem¹².
3. Dodać 600 μl 37% formaldehydu do 5 ml próbki i wymieszać odwracając probówkę 3x. Utrwalić próbki na lodzie na 30 minut.
4. Odwirować próbki o masie 2 500 x g w stałym wirniku w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i przemyć granulki 5 ml PBS.
5. Powtórz krok 2.4, aby granulki zostały umyte PBS 2x. Próbki mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.

3. Analiza COPAS

1. Upewnij się, że COPAS Plus, pompa, komputer i laser argonowy 488 nm są włączone i uruchom oprogramowanie Biosort. Mimo że laser jest włączony, nadal będzie w trybie czuwania.
2. Sprawdź, czy butelka z płynem w osłonie jest pełna, a butelka na odpady jest pusta.
3. Kliknij "START", a następnie "URUCHOM", aby przełączyć laser argonowy 488 nm z trybu czuwania na włączony. Po około 60 sekundach, gdy laser jest włączony, kliknij "GOTOWE".
4. Sprawdź manometry. Naciski dla "Pochwy", "Próbki", "Sortera" i "Czystej" powinny wynosić odpowiednio około 4,0, 0,5, 2,7 i 10,9.
5. Kliknij pole wyboru obok opcji "Ciśnienie OK". Następnie system zalewa komórkę przepływową i jest gotowy do użycia.
6. Zakłada się, że ustawienia standardowe są ustawione z "Opóźnieniem" na 11 i "Szerokością" 7. Progi ustalono na poziomie 50 dla "sygnału" i 40 dla "minimum TOF", przy czym TOF oznacza czas przelotu. (Dla kompletności: wszystkie "Wzmocnienia" są ustawione na 1, wyzwalacz jest ustawiony na EXT (Extinction) i w zakładce "Konfiguracja" w sekcji "Wybierz szybkość skanowania" wybiera się 2.50 MHz. Zbieżność jest ustawiona na "Wzmocniona").
7. Usunąć resztki wody z kubka na próbkę i dodać do kubka 0,1 ml próbki Streptomyces z kroku 2.2 lub 2.5 razem z PBS (około 50 ml). Upewnij się, że kubek na próbkę jest prawidłowo zamknięty.
8. Kliknij "Pobierz", aby rozpocząć zbieranie danych. Zarządzaj prędkością przepływu, aby uzyskać od 30 do 50 zdarzeń na sekundę. Jeśli przepływ jest zbyt duży, dodać PBS do kubka na próbkę. Jeśli prędkość przepływu jest zbyt niska, dodaj więcej próbki.
9. Po zebraniu co najmniej 2 500 zdarzeń kliknij przycisk "STOP". Aby zapisać wszystkie dane, kliknij "Zapisz" i zapisz plik do późniejszej analizy statystycznej. Oprogramowanie Biosort zapisze dane w czterech plikach, z których tylko .txt plik zostanie wykorzystany do późniejszej analizy.
10. Oczyścić kubek na próbkę, wyjmując próbkę strzykawką o pojemności 50 ml i przemywając wodą 2x.
11. Powtarzaj kroki 3.7-3.10, aż wszystkie próbki zostaną przeanalizowane.

4. Analiza danych

1. Otwórz plik .txt i odrzuć dane z EXT mniejszym niż 25 (używając na przykład MS Excel). Odpowiada to szczątkom i luźnym fragmentom strzępek (w przypadku Aspergillus niger wszystkie dane o EXT niższym niż 150 są odrzucane)^4,12. Następnie zapisz wszystkie TOFy w jednej kolumnie w zwykłym pliku '.txt' (dla wielu plików danych można to zautomatyzować w języku programowania R, dostępnym pod adresem: http://www.r-project.org).
2. Upewnij się, że SciLab (wersja 5.3.2 lub nowsza z http://www.scilab.org/) jest zainstalowany razem z biblioteką 'fittools', która jest dostępna, wraz z instrukcją, pod adresem:
   http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip
   http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual%20fittools.pdf
3. Uruchom SciLab i uruchom niezbędne funkcje biblioteki fittools do modelowania danych. W skrócie: Zainstaluj bibliotekę fittools, jak pokazano w instrukcji (potrzebne tylko raz).
   1. Załaduj bibliotekę fittools.
   2. Wczytaj dane (plik '.txt') do SciLab.
   3. Log przekształca dane (logarytm naturalny jest domyślną funkcją logarytmu).
   4. Dopasuj model 2 populacji do danych.
   5. Narysuj wykres z histogramem i modelem (opcjonalnie).
   6. Uruchom dane (1 000 replikacji).
   7. Dopasuj model do początkowych zestawów danych.
   8. Uzyskaj oszacowania przedziałów ufności dla 5 parametrów. Dostarczy to informacji na temat ułamka partycypacji (p) populacji, ich 2 średnich (μ₁ i μ₂) oraz towarzyszących im odchyleń standardowych (α₁ i α₂). Co więcej, 95% przedziały ufności są określane przez ponowne dopasowanie do modelu po bootstrappingu (1 000 powtórzeń)^12,13,15. Gdy przedziały ufności średnich nie nakładają się na siebie, a przedział ufności p mieści się w przedziale 0,025-0,975, zbiór danych można wyjaśnić jako kombinację dwóch populacji rozkładów normalnych. (Zauważ, że udział małych granulek wynosi p, podczas gdy udział dużych granulek wynosi 1-p.) Zależność między TOF a średnicą osadu Streptomyces wynosi 0,57 × TOF + 159 μm⁴.
4. W przypadku znalezienia dwóch populacji, należy użyć średnich TOF-ów jako parametrów sortowania w COPAS jako górnej i dolnej granicy, aby następnie posortować małe i duże granulki. Należy pamiętać, że w zależności od wymagań użytkownika można wybrać również inne parametry sortowania.

5. Sortowanie granulek

1. Załaduj próbkę Streptomyces, którą należy posortować, zgodnie z opisem w kroku 3.7.
2. Ustaw "Limity sortowania" i podaj szczegółowe informacje o minimalnych (Lo) i maksymalnych (Hi) wartościach TOF. Alternatywnie, ustaw obszar, wybierając "Regiony", a następnie "Zdefiniuj region bramy", aby wybrać granulki o żądanych wymiarach lub właściwościach.
3. Umieść probówkę o pojemności 50 ml, aby zebrać wiele granulek, które spełniają parametry sortowania. Alternatywnie, do sortowania pojedynczych granulek można użyć płytki z mikromiareczkowaniem. Do ekstrakcji DNA i białek potrzebnych jest wiele granulek (10,^4-10,⁵). Pojedyncza osadówka jest wystarczająca do analizy ekspresji genów qPCR, ale do sekwencjonowania RNA potrzebnych jest wiele osadów.
4. Zdecyduj i ustaw liczbę granulek, które należy posortować, a następnie kliknij "Sortuj ręcznie", aby posortować według wybranych parametrów. Po osiągnięciu ustawionej ilości granulek sortowanie kończy się automatycznie.
5. Usunąć resztki próbki za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml z kubka na próbkę i umyć kubek wodą 2x. Powtórzyć kroki 5.1-5.5, jeśli konieczne jest sortowanie innych próbek.
6. Przed wyłączeniem COPAS przepłukać kubek na próbkę wodą, aby usunąć pozostałe granulki i oczyścić kubek na próbkę 70% EtOH i/lub 2% podchlorynem w wodzie. Uruchom próbkę chlorowanej wody, aby wyczyścić cały system i powtórz to z wodą. Opróżnij pojemnik przelewowy i wyczyść lub wymień filtr, który znajduje się w tym pojemniku.
7. Po zakończeniu kliknij "STOP", aby zwolnić ciśnienie z systemu. Gdy silnik się zatrzyma, zamknij program i kliknij "Wyłącz bez czyszczenia". Następnie wyłącz komputer, COPAS, laser i pompę.

Results

Pomiary COPAS granulek Streptomyces
Paciorkowce tworzą granulki grzybni w płynnych kulturach o szerokim zakresie rozmiarów. Aby przeanalizować rozkład wielkości osadów, 2-dniową hodowlę Streptomyces coelicolor hodowaną w płynie poddano cytometrii przepływu dużych cząstek przy użyciu profilera COPAS Plus wyposażonego w dyszę 1 mm. Typowymi danymi wyjściowymi COPAS jest wykres punktowy, taki jak pokazany na rysunku 2A. Oś x reprezentuje czas przelotu (TOF), który koreluje z rozmiarem kulki (tj. większe kulki potrzebują więcej czasu, aby przejść przez wiązkę laserową). Oś y pokazuje ekstynkcję, która reprezentuje gęstość optyczną obiektu. Każdy punkt na wykresie punktowym odpowiada pojedynczemu zdarzeniu, czyli pojedynczemu śrutowi przechodzącemu przez wiązkę lasera. Co ważne, gdy próbka jest zbyt skoncentrowana (tj. gdy laser wykrywa więcej niż 100 zdarzeń na sekundę), COPAS często nie wykrywa pojedynczych granulek. Prowadzi to do fałszywych wartości DOF, które są zbyt wysokie. Rozcieńczanie próbki zmniejsza średnie wartości TOF, aż do punktu, w którym dalsze rozcieńczanie nie ma już wpływu na TOF. Ten punkt jest osiągany, gdy analizowano około 100 granulek/s.

Wykreślenie punktów danych na histogramie wskazuje, że rozmiary nie są normalnie rozłożone (Rysunek 2B). Rozkład wydaje się być przekrzywiony w prawo. Przekształcenie logarytmiczne zestawu danych również nie doprowadziło do powstania rozkładu normalnego (Rysunek 2C). Aby ocenić, czy rozkład wielkości można wyjaśnić, zakładając mieszaninę dwóch rozkładów normalnych, dane zostały zamodelowane matematycznie^12,15. Modelowanie rzeczywiście wykazało, że rozkład wielkości można wyjaśnić, zakładając istnienie dwóch odrębnych populacji granulek. Populacja małych granulek składała się z 92% wszystkich granulek o średniej wielkości 248 μm, podczas gdy populacja dużych granulek (8% wszystkich granulek) miała średnią wielkość 319 μm (należy zauważyć, że zakłada się, że dwie populacje istnieją, gdy frakcja partycypacyjna wynosi od 2,5 do 97,5%).
Sortowanie granulek Streptomyces według wielkości

Mikrokolonie z populacji dużych i małych granulek zostały posortowane. W tym celu wykorzystano średnie rozmiary granulek z obu populacji do określenia granic sortowania. Uważa się, że granulki mniejsze niż 248 μm pochodzą z małej populacji granulek, podczas gdy granulki większe niż 319 μm uznano za pochodzące z dużej populacji granulek (ryc. 3), aby ograniczyć sortowanie granulek z nakładającej się części dwóch rozkładów wielkości. Analiza mikroskopowa posortowanych granulek wykazała ich wyraźne rozmiary (ryc. 3). Zebrane granulki mogą być dalej wykorzystywane do izolacji DNA, RNA lub białek.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie układu doświadczalnego do pomiaru i analizy granulek Streptomyces przy użyciu COPAS. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz procedury eksperymentalne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 2. Niejednorodność wielkości osadów w płynnych kulturach Streptomyces. Analiza COPAS 2-dniowej kultury S. coelicolor YEME (A) wskazuje, że rozmiary pastylek (oznaczone jako wartości czasu przelotu) nie są normalnie rozmieszczone (B) i nie stają się takie po transformacji logarytmicznej (C). Zamiast tego wykryto dwie populacje granulek, które różnią się TOF (a tym samym wielkością). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 3. Frakcjonowanie granulek Streptomyces w zależności od wielkości. Granulki o rozmiarze mniejszym niż 248 μm (oznaczone na różowo) zostały uznane za małe granulki, podczas gdy granulki o wielkości większej niż 319 μm (oznaczone na niebiesko) zostały uznane za duże granulki. Analiza mikroskopowa potwierdziła różnicę w wielkości. Zauważ, że rozmiary te zostały obliczone na podstawie danych przekształconych logarytmicznie przy użyciu opisanej zależności między TOF a średnicą granulki Streptomyces, która wynosi 0,57 × TOF + 159 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Discussion

Cytometria przepływowa umożliwiła szybką analizę dużej liczby pojedynczych komórek, co przyczyniło się do lepszego zrozumienia heterogeniczności w populacjach klonów⁶. Regularna cytometria przepływowa nie jest możliwa do analizy wielokomórkowych osadów grzybni paciorkowców i grzybów. Nasze prace wykazały, że wysokoprzepustowa analiza granulek Streptomyces jest możliwa przy użyciu COPAS. Opisana tutaj procedura jest prosta, szybka i wysoce powtarzalna. Krytycznym parametrem, o którym należy pamiętać podczas pracy przyrządu, jest prędkość przepływu, która nie powinna przekraczać 100 zdarzeń/s (krok 3.8 tego protokołu). Jeśli stężenie granulek, a tym samym również prędkość przepływu, stanie się zbyt wysokie, wartości TOF zostaną błędnie obliczone, ponieważ przyrząd nie wykryje pojedynczych granulek. Wystarczające rozcieńczenie próbki przez dodanie PBS rozwiązuje ten problem.

Ograniczenia
Zastosowany tutaj COPAS Plus ma średnicę dyszy 1 mm, która nadaje się do pomiaru cząstek o wielkości w zakresie 30-700 μm. Dysza ta umożliwia zatem pomiar granulek utworzonych przez paciorkowce. W przypadku grzybów strzępkowych mikrokolonie mogą być większe, co ogranicza ogólne zastosowanie COPAS Plus. COPAS XL może mierzyć cząstki o wielkości do 1 500 μm, ale jego czułość w dolnym zakresie średnic jest mniejsza w porównaniu z COPAS Plus. Zarówno COPAS Plus, jak i COPAS XL nie mogą analizować cząstek mniejszych niż 30 μm. Oznacza to, że nie można analizować pojedynczych zarodników lub komórek drobnoustrojów. Ponadto, COPAS może nie analizować dokładnie małych agregatów zarodników i komórek lub bardzo małych mikrokolonii. W tym celu należy stosować zwykłe analizatory komórek. To ograniczenie jest pokonywane przez Biosorter firmy Union Biometrica, który może analizować cząstki w zakresie 1-1 500 μm. Nagroda za zakup jest jednak wyższa.

Rozwiązywanie problemów
COPAS to solidny przyrząd, który jest łatwy w obsłudze. Czasami jednak granulki nie są wykrywane po załadowaniu próbki do kubka na próbkę i rozpoczęciu pomiaru. Przyczyną jest zazwyczaj zatkana rura wejściowa, którą można łatwo rozwiązać, naciskając polecenie "wyczyść". Spowoduje to wypchnięcie granulek z powrotem z systemu rurek do kubka na próbkę. Alternatywnym powodem może być nieprawidłowe umieszczenie pokrywki na kubku na próbkę. Prowadzi to do utraty ciśnienia i jednoczesnej niemożności wykrycia granulek.

Znaczenie i kierunki na przyszłość
Skupiliśmy się tutaj na analizie wielkości granulek, ale konfiguracja COPAS jest również w stanie analizować i sortować na podstawie fluorescencji i gęstości. Detekcja fluorescencji umożliwia nam analizę ekspresji genów w oparciu o reportery, takie jak GFP. Ponadto można ocenić skład komórek. Jeszcze mocniejsza jest opcja oddzielania granulek zgodnie z tymi parametrami. Posortowane granulki mogą być wykorzystywane do dalszych analiz, w tym do wszystkich badań -omicznych. Rzeczywiście, wcześniej posortowaliśmy 60 000 dużych i 200 000 małych granulek i wykazaliśmy, że proteom znacznie różnił się między dużymi i małymi granulkami⁴. Technologia ta dostarcza zatem nowych wskazówek w celu ulepszenia paciorkowców jako fabryk komórek.

Kluczową korzyścią płynącą z technologii COPAS jest czas. Wcześniejsze badania nad granulkami komórkowymi były prowadzone przy użyciu mikroskopii, co ogranicza liczbę granulek, które można przeanalizować, do kilkuset¹⁶. Badania mikroskopowe sugerowały już istnienie dwóch populacji osadów w kulturach Streptomyces hodowanych w płynie¹⁶. Rzeczywiście, wykryto dwie populacje wypluwek niezależnie od warunków hodowli w dużej liczbie różnych Streptomycetes⁴. Ta niejednorodność wielkości nie ogranicza się do paciorkowców nitkowatych, ale zaobserwowano ją również u grzybów strzępkowych¹². We wszystkich przypadkach mechanizmy leżące u podstaw heterogeniczności nie są jeszcze znane. Możliwość sortowania granulek ze względu na wielkość i fluorescencję pozwala nam rozwikłać takie mechanizmy.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
COPAS Plus	Union Biometrica	PLUS	Cytometr przepływowy dużych cząstek wraz z laserami i oprogramowaniem
NaCl	Sigma Aldrich	S3014	PBS składnik
KCl	Sigma Aldrich	P9541	PBS składnik
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S3264	PBS składnik
KH2PO4	Sigma Aldrich	P9791	Składnik PBS
Ekstrakt drożdżowy Difco BD	Biosciences	210933	Składnik medialny
Bacto Peptone	BD Biosciences	211677	Składnik podłoża
Ekstrakt ze słodu oksoidowego	Fisher Scientific	OXLP0039B	Składnik podłoża
Glukoza	Sigma Aldrich	G8270	Media składnik
sacharoza	Sigma Aldrich	S9378	Podłoże składnik
MgCl2• 6H2O	Sigma Aldrich	M2670	Komponenty nośnikowe. Dodać po sterylizacji w autoklawie.
Roztwór formaldehydu	Sigma Aldrich	F8775	Utrwalanie granulek
Roztwór podchlorynu sodu	Sigma Aldrich	71696	Do czyszczenia instrumentu
EtOH	VWR	20816.367	Do czyszczenia instrumentu
Kolba Erlenmeyera (250 ml)	Fisher Scientific	214-1132	Kolba hodowlana do uprawy Streptomyces
Springs	Verenfabriek De Spiraal	Custom-Made	Używana w kolbie hodowlanej. RVS1.4401/Długość 210 mm/Średnica 17 mm/Podziałka 5 mm
Sterylna probówka wirówkowa (15 ml)	Sarstedt	62.554.002
Strzykawki (50 ml)	Sigma	Z683698