Pomiary właściwości przewodnictwa nerwowego in vivo są przykładem potężnego narzędzia do charakteryzowania różnych zwierzęcych modeli chorób nerwowo-mięśniowych. Tutaj przedstawiamy łatwy i niezawodny protokół, za pomocą którego można przeprowadzić analizę elektrofizjologiczną nerwów kulszowych znieczulonych myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In vivo (in vivo) Pomiary elektrofizjologiczne nerwów kulszowych myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania elektrofizjologiczne pozwalają na racjonalną klasyfikację różnych chorób nerwowo-mięśniowych i są pomocne, wraz z technikami neuropatologicznymi, w zrozumieniu leżącej u podstaw patofizjologii1. Tutaj opisujemy metodę wykonywania badań elektrofizjologicznych na nerwach kulszowych myszy in vivo.
Zwierzęta są znieczulane izofluranem w celu zapewnienia analgezji dla badanych myszy i niezakłóconego środowiska pracy podczas pomiarów, które trwają około 30 minut na zwierzę. Stała temperatura ciała wynosząca 37 °C jest utrzymywana przez płytę grzewczą i stale mierzona za pomocą sondy termicznej doodbytniczej2. Dodatkowo podczas pomiarów rutynowo rejestrowany jest elektrokardiogram (EKG) w celu ciągłego monitorowania stanu fizjologicznego badanych zwierząt.
Zapisy elektrofizjologiczne wykonywane są na nerwie kulszowym, największym nerwie obwodowego układu nerwowego (PNS), zaopatrującym tylną kończynę myszy zarówno w motoryczne, jak i czuciowe kanały światłowodowe. W naszym protokole nerwy kulszowe pozostają in situ i dlatego nie muszą być usuwane ani odsłaniane, co pozwala na pomiary bez żadnych niekorzystnych podrażnień nerwów wraz z rzeczywistymi zapisami. Za pomocą odpowiednich elektrod igłowych3 wykonujemy zarówno stymulację nerwu proksymalnego, jak i dystalnego, rejestrując przekazywane potencjały za pomocą elektrod detekcyjnych w mięśniach brzuchatych łydki. Po przetworzeniu danych można uzyskać wiarygodne i wysoce spójne wartości prędkości przewodzenia nerwowego (NCV) i złożonego potencjału czynnościowego motorycznego (CMAP), kluczowych parametrów do ilościowego określenia funkcjonowania nerwów obwodowych.
Wprowadzenie
Pomiary elektrofizjologiczne są niezbędnym narzędziem do badania funkcjonalnej integralności nerwów obwodowych zarówno w środowisku klinicznym, jak i laboratoryjnym. U ludzi duża liczba zaburzeń nerwowo-mięśniowych i neuropatii diagnostycznie opiera się na pomiarach elektrofizjologicznych. Mierząc właściwości nerwów, takie jak prędkość przewodzenia lub potencjalne amplitudy sygnału, można scharakteryzować przybliżone pochodzenie chorób nerwów obwodowych.
Prędkość przewodnictwa nerwowego jest wysoce zależna od szybkiej propagacji sygnału, która jest możliwa dzięki mielinizacji. Dlatego procesy demielinizacyjne na ogół wykazują zmniejszone prędkości przewodzenia4. Złożony potencjał czynnościowy motoryczny (CMAP) - skorelowany z liczbą funkcjonalnych aksonów - jest wskaźnikiem uszkodzenia aksonów, gdy jest znacznie zmniejszony5.
Tak więc, za pomocą metod elektrofizjologicznych można rozróżnić etiologię uszkodzenia nerwów obwodowych, np. dla dziedzicznych neuropatii6,7, neuropatii cukrzycowych8,9, przewlekłych zapalnych polineuropatii demielinizacyjnych (CIDP)10 lub neuropatii metabolicznych11.
Normalnie, w aplikacji dla ludzi preferowane są nieinwazyjne nagrania nerwu łydkowego lub łokciowego. U myszy łatwo jest przeanalizować właściwości nerwowe nerwów kulszowych, największego nerwu obwodowego układu nerwowego (PNS) zawierającego zarówno duże, jak i małe aksony układu motorycznego i czuciowego.
Procedura, jak pokazano tutaj, jest szybką, łatwą i niezawodną metodą pomiaru wszystkich standardowych wartości istotnych dla elektrofizjologii nerwów obwodowych u nienaruszonej myszy. Wykonywanie nagrań z zakonserwowanego organizmu gwarantuje fizjologiczne warunki środowiska nerwowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Niniejsze badanie zostało przeprowadzone zgodnie z ustawą o ochronie zwierząt Republiki Federalnej Niemiec (Tierschutzgesetz der Bundesrepublik Deutschland) i zostało zatwierdzone przez Turyngijski Państwowy Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności i Ochrony Konsumentów (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
1. Przygotowanie pomiarów
- Zanurz myszy w narkozie poprzez inhalację izofluranu/O2 – w celu wprowadzenia w stan znieczulenia stosuje się 3%, a w celu podtrzymania 2% izofluranu w 100% tlenie (Rysunek 1). Potwierdź wystąpienie odpowiedniego stopnia znieczulenia, testując proste odruchy, takie jak odruchy ruchowe oraz badając wrażliwość na ból o niskim natężeniu. Zaleca się stosowanie maści do oczu w celu zapobiegania ich wysychaniu podczas znieczulenia, choć nie jest to niezbędne, ponieważ procedura trwa zazwyczaj łącznie tylko 30 min/zwierzę. W przypadku eksperymentów z przeżyciem, podaj w odpowiednim czasie długo działające leki przeciwbólowe w celu opanowania bólu pooperacyjnego.
- Strzyż sierść pokrywającą kończyny tylne za pomocą strzygarki elektrycznej i przeprowadź depilację dostępnym w handlu kremem do usuwania włosów, gdy zwierzęta znajdują się już pod wpływem leków przeciwbólowych. Aby utrzymać status wolny od patogenów w trakcie całej procedury, używaj rękawiczek aseptycznych i zawsze korzystaj z narzędzi dokładnie oczyszczonych 70% etanolem.
- Kontroluj stabilność temperatury ciała za pomocą płyty grzewczej z regulacją sprzężeniem zwrotnym i rektalnej sondy termicznej (Rysunek 2). W razie potrzeby użyj sterylnej tkaniny do przykrycia płyty grzewczej pomiędzy zwierzętami, aby zachować sterylne środowisko eksperymentalne. Ponadto zaleca się stosowanie płyty grzewczej sterowanej elektronicznie poprzez zintegrowany czujnik, aby ograniczyć temperaturę grzania do ≤40 °C i uniknąć uszkodzenia tkanek.
Rysunek 1. Układ eksperymentalny przedstawiający znieczuloną mysz z ogolonymi kończynami tylnymi. - Wykonaj zapis elektrocardiograficzny (EKG), aby monitorować częstość akcji serca jako parametr życiowy. Zainstaluj trzy elektrody do zapisu EKG w następujący sposób: jedną elektrodę pod skórą każdej kończyny przedniej i jedną elektrodę pod skórą w okolicy szyi.
- Umieść elektrody pierścieniowe, używając żelu kontaktowego dla zapewnienia optymalnej przewodności / rezystancji przeniesienia. Elektrodę pomiarową (oznaczoną na czarno) umieszcza się w miejscu, w którym mięsień brzuchaty łydki ma maksymalną średnicę. Elektrodę referencyjną (oznaczoną na czerwono) umieszcza się bezpośrednio pod elektrodą pomiarową.
Uwaga: Szczegóły dotyczące sprzętu znajdują się w „Tabeli materiałów”. - Zaznacz prawidłowe pozycje pomiarowe, zachowując ustalone, ale spójne odległości między proksymalną a dystalną stymulacją nerwu kulszowego a elektrodą prowadzącą. Propozycja eksperymentalna: stymulacja dystalna odbędzie się w odległości 4 mm od elektrody pomiarowej. Stymulacja proksymalna zostanie przeprowadzona w odległości 16 mm od elektrody pomiarowej (Rysunek 2).
Rysunek 2. Reprezentatywne zdjęcie przedstawiające sytuację eksperymentalną bezpośrednio przed rozpoczęciem pomiarów. Biała strzałka wskazuje położenie elektrody pomiarowej (czarnej) i referencyjnej (czerwonej) na mięśniu brzuchatym łydki lewej kończyny tylnej. Stymulacja za pomocą elektrod igłowych zostanie przeprowadzona w określonych pozycjach w stosunku do czarnej elektrody pomiarowej. Punkt stymulacji dystalnej (czarny znacznik z napisem „d.s.” na lewej kończynie tylnej) znajduje się w odległości 4 mm od elektrody pomiarowej; miejsce stymulacji proksymalnej (czarny znacznik z napisem „p.s.”) znajduje się 16 mm dalej. Czerwona linia na prawej kończynie tylnej pokazuje przybliżony anatomiczny przebieg nerwu kulszowego. Ponadto, jako punkty orientacyjne, zaznaczono przybliżone położenie istotnych mięśni kończyny tylnej. Gwiazdka wskazuje rektalną sondę termiczną.
2. Pomiar
- Zasada: Wykonaj serię stymulacji nerwu za pomocą repetycyjnie generowanych pojedynczych impulsów prostokątnych o czasie trwania 0,1 msec przy użyciu jednobiegunowych jednorazowych elektrod igłowych 28 G (częstotliwość powtórzeń 200 msec; patrz Rysunek 3A). W celu analizy danych w trybie off-line zaleca się jednoczesną akwizycję sygnałów stymulacji wraz z krzywą odpowiedzi funkcji nerwowo-mięśniowej (Rysunek 3B) wywołaną stymulacją nerwu. Oblicz średnią z serii maksymalnych odpowiedzi („reprezentatywna odpowiedź funkcji nerwowo-mięśniowej”) do późniejszej analizy danych. Aby uzyskać wiarygodne dane, zarejestruj, a następnie wyciągnij średnią z co najmniej 3 niezależnych, optymalnych krzywych odpowiedzi dla każdego miejsca stymulacji i każdego zwierzęcia.
Rysunek 3. Procedura akwizycji i analizy danych (przedstawienie schematyczne). Repetycyjnie generowane impulsy są przyłożone do nerwu kulszowego za pomocą elektrod igłowych (górny rząd na Rysunku 3A). Jednocześnie rejestrowanych jest kilka odpowiadających im krzywych odpowiedzi nerwowo-mięśniowej (dolny rząd na Rysunku 3A). Po uśrednieniu i powiększeniu, krzywe odpowiedzi nerwowo-mięśniowej wywołane impulsami stymulującymi (górny rząd na Rysunku 3B) wykazują następujące charakterystyczne właściwości (dolny rząd na Rysunku 3B): Wskazano latencję odpowiedzi sygnałowej oraz czas trwania i amplitudę sygnału, które mogą zostać uzyskane do późniejszych obliczeń i statystyk. Nieregularne przewodzenie sygnału i/lub suboptymalne zapisy zazwyczaj skutkują różnymi deformacjami sygnału z więcej niż jednym wychyleniem dodatnim i jednym ujemnym lub deformacją sygnału (kształt bimodalny) o zmniejszonej amplitudzie (Rysunek 3C). - Wykonaj stymulację proksymalną elektrodą igłową w wyznaczonym miejscu („p.s.” na Rysunku 2).
- Aby uzyskać najlepsze warunki rejestracji z maksymalnymi amplitudami, wizualizuj aktualne krzywe odpowiedzi równolegle z procesem stymulacji. Dzięki temu eksperymentator może natychmiast ocenić kształt krzywych odpowiedzi oraz wartość amplitudy.
- W razie potrzeby, lekko i ostrożnie zmień pozycję i/lub kąt igły stymulującej względem nerwu kulszowego. Ta delikatna optymalizacja warunków stymulacji pozwala na osiągnięcie stałych amplitud o jak największej wartości oraz krzywej odpowiedzi o typowym kształcie dwufazowym (Rysunek 4).
- Wykonaj stymulację dystalną elektrodą igłową w wyznaczonym miejscu („d.s.” na Rysunku 2).
- Po zakończeniu pomiaru przenieś badaną mysz do osobnej klatki, aż odzyska ona wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję na brzuchu. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez nadzoru i w towarzystwie innych zwierząt do czasu pełnego wybudzenia z narkozy. Podaj odpowiednio wcześnie długo działające leki przeciwbólowe w celu opanowania bólu pooperacyjnego. Zaleca się systemiczne podawanie niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) i opioidów przez 1-3 dni.
- Alternatywnie, uśmierć wciąż znieczuloną mysz w sposób szybki i humanitarny, bez powodowania dalszego bólu u zwierzęcia, np. poprzez zwichnięcie karku.
Rysunek 4. Ilustracja wyznaczania rejestracji CMAP o maksymalnych amplitudach. Przedstawiono pełną serię rejestracji. (a) Punkt wprowadzenia z minimalną odpowiedzią CMAP. (b) Nieznaczny ruch igły stymulującej skutkuje rejestracją CMAP o maksymalnych amplitudach. (c) Dodatkowe zmiany w ułożeniu igły powodują rejestrację CMAP o różnych amplitudach, w tym amplitudach bliskich maksymalnym. (d) Ponowne wprowadzenie igły stymulującej z seryjną rejestracją CMAP o amplitudach bliskich maksymalnym. Uwaga: Podczas powtarzanej stymulacji w optymalnym miejscu stymulacji może wystąpić typowy spadek amplitud CMAP12,13. Gwiazdkami oznaczono rejestracje CMAP o maksymalnych amplitudach wykorzystane do uśredniania.
3. Analiza
- Wyodrębnij parametry przewodnictwa nerwowego na podstawie reprezentatywnego zestawu danych odpowiedzi funkcji nerwowo-mięśniowej, korzystając z odpowiedniego pakietu oprogramowania (np. AtisaPro).
Uwaga: Wyznaczanie danych związanych z czasem należy przeprowadzić ze szczególną ostrożnością, ponieważ określenie punktów przegięcia początku i zakończenia złożonego potencjału czynnościowego ruchowego (CMAP) może być trudne. Procedura o zweryfikowanej powtarzalności przedstawiona jest na Rysunku 3B, gdzie wykorzystuje się styczne do odchyleń sygnału po początku i przed zakończeniem. - Oblicz wartości „opóźnienia sygnału” oraz „CMAP”.
- „Opóźnienie” reprezentuje zwłokę czasową między stymulacją a początkiem CMAP, natomiast przedział czasowy od początku pierwszego ujemnego odchylenia CMAP do pierwszego powrotu do linii bazowej nazywany jest „czas trwania CMAP”. Aby obliczyć prędkość przewodzenia, wykorzystaj różnicę między opóźnieniem dystalnym a proksymalnym oraz odległość między miejscami stymulacji dystalnej i proksymalnej.
prędkość przewodzenia = opóźnienie / odległość między miejscami stymulacji - Amplituda „CMAP” (złożonego potencjału czynnościowego ruchowego) reprezentuje wielkość między maksymalnym dodatnim a ujemnym punktem zwrotnym sygnału CMAP (podawaną w mV).
CMAP = wartość „dodatniego punktu zwrotnego” - wartość „ujemnego punktu zwrotnego”
- „Opóźnienie” reprezentuje zwłokę czasową między stymulacją a początkiem CMAP, natomiast przedział czasowy od początku pierwszego ujemnego odchylenia CMAP do pierwszego powrotu do linii bazowej nazywany jest „czas trwania CMAP”. Aby obliczyć prędkość przewodzenia, wykorzystaj różnicę między opóźnieniem dystalnym a proksymalnym oraz odległość między miejscami stymulacji dystalnej i proksymalnej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W ramach niniejszego badania przeprowadziliśmy serię pomiarów elektrofizjologicznych in vivo na nerwach kulszowych łącznie u 12 myszy: po 6 zwierząt każdej płci. Pomiary wykonano zgodnie z przedstawionym protokołem, co przyniosło następujące wyniki:
Zarówno u samców, jak i u samic myszy średnia prędkość przewodzenia w nerwie kulszowym wynosi około 20 m/sec (Rycina 5). Jest to zgodne z innymi pomiarami dostępnymi w literaturze. Co więcej, nasze dane wskazują na brak is...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany protokół zapewnia łatwą i niezawodną metodę określania właściwości przewodnictwa nerwu kulszowego u znieczulonych myszy bez konieczności odsłaniania interesującego nerwu. Niemniej jednak ta eksperymentalna procedura powoduje uszkodzenie tkanki przez nakłucie igłą. Dlatego rozsądną opcją jest składanie zwierząt w ofierze po zakończeniu nagrań. Jednak w porównaniu z innymi, bardziej inwazyjnymi procedurami, które wymagają odsłonięcia nerwu przed zapisami, uszkodzenie tkanek jest stosunkowo niewielkie 3,14
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez SFB 604, DFG MO 1421/2-1 i Krebshilfe 107089 (do H.M.). A.S. jest laureatem nagrody Young Investigator Award przyznawanej przez Children's Tumor Foundation (Nowy Jork, USA).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Koncentryczne elektrody igłowe (stymulacja) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0901 | |
| Cyfrowe elektrody pierścieniowe (nagrywanie) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0302 | |
| ToM - Wieża pomiarowa (przetwornik A/C) | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Niemcy | ||
| AtisaPro, oprogramowanie do akwizycji i analizy danych | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Niemcy | ||
| Stymulator HSE T | Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten, Niemcy |
Bibliografia
- Kimura, J. 3rd ed. Electrodiagnosis in Diseases of Nerve and Muscle. , Oxford University Press. (2001).
- Rutkove, S. B. Effects of temperature on neuromuscular electrophysiology. Muscle Nerve. 24, 867-882 (2001).
- Xia, R. H., Yosef, N., Ubogu, E. E. Dorsal caudal tail and sciatic motor nerve conduction studies in adult mice: technical aspects and normative data. Muscle Nerve. 41, 850-856 (2010).
- Zielasek, J., Martini, R., Toyka, K. V. Functional abnormalities in P0-deficient mice resemble human hereditary neuropathies linked to P0 gene mutations. Muscle Nerve. 19, 946-952 (1996).
- Raynor, E. M., Ross, M. H., Shefner, J. M., Preston, D. C. Differentiation between axonal and demyelinating neuropathies: identical segments recorded from proximal and distal muscles. Muscle Nerve. 18, 402-408 (1995).
- Pareyson, D., Scaioli, V., Laura, M. Clinical and electrophysiological aspects of Charcot-Marie-Tooth disease. Neuromol. Med. 8, 3-22 (2006).
- Schulz, A., et al. Merlin isoform 2 in neurofibromatosis type 2-associated polyneuropathy. Nat. Neurosci. 16, 426-433 (2013).
- Lamontagne, A., Buchthal, F. Electrophysiological studies in diabetic neuropathy. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 33, 442-452 (1970).
- Andersen, H., Nielsen, J. F., Nielsen, V. K. Inability of insulin to maintain normal nerve function during high-frequency stimulation in diabetic rat tail nerves. Muscle Nerve. 17, 80-84 (1994).
- Magda, P., et al. Comparison of electrodiagnostic abnormalities and criteria in a cohort of patients with chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Arch. Neurol. 60, 1755-1759 (2003).
- Lindberg, R. L., et al. Motor neuropathy in porphobilinogen deaminase-deficient mice imitates the peripheral neuropathy of human acute porphyria. J. Clin. Invest. 103, 1127-1134 (1999).
- Massey, J. M. Electromyography in disorders of neuromuscular transmission. Sem. Neurol. 10, 6-11 (1990).
- Stalberg, E., Falck, B. The role of electromyography in neurology. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 103, 579-598 (1997).
- Osuchowski, M. F., Teener, J., Remick, D. Noninvasive model of sciatic nerve conduction in healthy and septic mice: reliability and normative data. Muscle Nerve. 40, 610-616 (2009).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neurosci. Lett. 483, 127-131 (2010).
- Dilley, A., Lynn, B., Pang, S. J. Pressure and stretch mechanosensitivity of peripheral nerve fibres following local inflammation of the nerve trunk. Pain. 117, 462-472 (2005).
- Vleggeert-Lankamp, C. L., et al. Electrophysiology and morphometry of the alpha- and beta-fiber populations in the normal and regenerating rat sciatic nerve. Exp. Neurol. 187, 337-349 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
