Artykuł metodologiczny

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

DOI:

10.3791/51188

⸱

12 marca 2014

 ,  , 
1Department of Biology, Concordia University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania dzielących się komórek w rozwijających się zarodkach Caenorhabditis elegans. W szczególności protokół ten koncentruje się na obrazowaniu dzielących się neuroblastów, które znajdują się pod komórkami naskórka i mogą być ważne dla morfogenezy naskórka. Tworzenie tkanek ma kluczowe znaczenie dla rozwoju metazoanów i opiera się na zewnętrznych sygnałach z sąsiednich tkanek. C. elegans jest doskonałym organizmem modelowym do badania morfogenezy tkanek in vivo ze względu na swoją przezroczystość i prostą organizację, dzięki czemu jego tkanki są łatwe do zbadania za pomocą mikroskopii. Obudowa brzuszna to proces, w którym brzuszna powierzchnia zarodka jest pokryta pojedynczą warstwą komórek nabłonkowych. Uważa się, że zdarzenie to jest ułatwione przez leżące u jego podstaw neuroblasty, które dostarczają chemicznych wskazówek pośredniczących w migracji leżących nad nimi komórek nabłonkowych. Jednak neuroblasty są wysoce proliferacyjne, a także mogą działać jako mechaniczne podłoże dla brzusznych komórek naskórka. Badania z wykorzystaniem tego eksperymentalnego protokołu mogą odkryć znaczenie komunikacji międzykomórkowej podczas tworzenia tkanek i mogą zostać wykorzystane do ujawnienia ról genów zaangażowanych w podział komórek w rozwijających się tkankach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż istnieją protokoły opisujące, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku C. elegans, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórki w tkance podczas środkowej embriogenezy. Jednym z głównych wyzwań związanych z obrazowaniem organizmów w trakcie opracowywania była ich wrażliwość na fototoksyczność. Jednak zwiększona dostępność mikroskopów konfokalnych z wirującym dyskiem lub mikroskopów pola przemiatającego pozwoliła na szersze zastosowania obrazowania. Oba systemy wykorzystują lasery na ciele stałym i światło rozproszone, ograniczając poziomy promieniowania UV, na które narażone są organizmy. Jednak statywy szerokokątne mogą być nadal używane do obrazowania in vivo, zwłaszcza jeśli są wyposażone w kamery o wysokiej czułości (np. EMCCD), kontroli przysłony i sterowania oświetleniem (np. diody LED lub regulowane żarówki rtęciowe). Protokół ten opisuje, w jaki sposób można użyć systemu konfokalnego lub systemu szerokokątnego do obrazowania podziału komórek w rozwijających się zarodkach C. elegans. Jako przykład opisujemy, jak obrazować podział komórek neuroblastów. Neuroblasty mogą ułatwiać morfogenezę naskórka, dostarczając chemicznych lub mechanicznych wskazówek do leżących nad nim komórek naskórka i stanowią doskonały przykład znaczenia komunikacji międzykomórkowej w tworzeniu tkanek.

Caenorhabditis elegans jest idealnym organizmem modelowym do badań mikroskopowych ze względu na jego przezroczystość i prostą organizację tkanek1. Co więcej, C. elegans jest podatny na metody genetyczne i RNAi, a ponieważ wiele jego genów ma ludzkie homologi, może być wykorzystany do identyfikacji konserwatywnych mechanizmów tworzenia tkanek2-5. U C. elegans tworzenie się naskórka następuje w połowie embriogenezy, kiedy zarodek ma >300 komórek. Morfogeneza naskórka składa się z kilku głównych faz, podczas których zarodek jest zamknięty w warstwie komórek naskórka, które zwężają się i rozciągają, przekształcając zarodek z jajowatej formy w wydłużony kształt robaka6. Zamknięcie brzuszne opisuje jedno z tych zdarzeń morfogenetycznych, kiedy komórki naskórka brzusznego migrują w kierunku brzusznej linii środkowej, aby pokryć brzuszną powierzchnię zarodka (ryc. 1). Po pierwsze, dwie pary komórek położonych z przodu krawędzi natarcia migrują w kierunku brzusznej linii środkowej, gdzie przylegają i łączą się ze swoimi przeciwległymi sąsiadami6. Po tym następuje migracja komórek kieszonek znajdujących się z tyłu, które tworzą kształty przypominające klin, tworząc kieszeń brzuszną6-7. Mechanizm zamykający kieszeń nie jest dobrze poznany. Jedną z możliwości jest to, że nadkomórkowa struktura skurczowa miozyny aktyny wiąże komórki kieszonkowe w sposób podobny do sznurka torebki, podobnie jak w przypadku gojenia się ran8. Co ciekawe, w migracji niektórych komórek kieszonkowych pośredniczą określone podzbiory leżących u ich podstaw neuroblastów9 (prekursorów neuronalnych, które znajdują się pod naskórkiem; Rysunek 1B).

Poprzednie badania wykazały, że neuroblasty regulują migrację komórek naskórka i obudowę brzuszną. VAB-1 (receptor efryny) i VAB-2 (ligand efryny) są wysoko eksprymowane w neuroblastach i ułatwiają sortowanie neuroblastów przednich i tylnych od siebie, a mutacje w vab-1 lub vab-2 powodują fenotypy brzusznejobudowy 10-13. Jednak eksperymenty ratunkowe z promotorem wykazały, że vab-1 jest również wymagany w leżących nad nimi brzusznych komórkach naskórka, a receptory dla innych wskazówek wydzielanych przez neuroblasty ulegają ekspresji w komórkach naskórkabrzusznego 9. Chociaż mutacje w którymkolwiek z tych receptorów powodują fenotypy zamknięcia brzusznego, nie jest jasne, czy defekty powstają z powodu problemów z pozycjonowaniem neuroblastów, czy z powodu niezdolności komórek naskórka brzusznego do reagowania na sygnały naprowadzające14. Zmiana podziału neuroblastów bez wpływu na ich zdolność do wydzielania sygnałów naprowadzających może rzucić światło na rolę neuroblastów i ich zdolność do dostarczania bodźców mechanicznych podczas morfogenezy naskórka. Niedawno odkryto, że gen podziału komórek, ani-1 (anilina) jest silnie eksprymowany w neuroblastach (ryc. 2A), a jego wyczerpanie powoduje defekty podziału neuroblastów. Co ciekawe, zarodki te wykazują fenotypy brzusznego zamknięcia (Fotopoulos, Wernike i Piekny, obserwacje niepublikowane).

Anilina jest niezbędna do podziału komórek, a szczególnie do cytokinezy, która opisuje proces, w którym komórka macierzysta fizycznie dzieli się na dwie komórki potomne. Cytokineza jest napędzana przez tworzenie pierścienia kurczliwego aktomiozyny, który musi być ściśle kontrolowany w czasie i przestrzeni, aby zapewnić prawidłowe sprzężenie z segregacją chromatyd siostrzanych. Głównym regulatorem cytokinezy metazoan jest RhoA (RHO-1 w C. elegans), mała GTPaza, która jest aktywna w swojej postaci związanej z GTP. GEF Ect2/ECT-2 aktywuje RhoA, po czym RhoA-GTP oddziałuje z dalszymi efektorami, które tworzą pierścień skurczowy i pośredniczą w jego wnikaniu15. Anilina jest białkiem wielodomenowym, które wiąże się z RhoA poprzez swój C-koniec oraz z aktyną i miozyną poprzez N-koniec. Anilina jest wymagana do ustabilizowania położenia pierścienia kurczliwego w komórkach S2 ssaków lub Drosophila16. Wyczerpanie aniliny powoduje, że pierścienie skurczowe ulegają oscylacjom bocznym, a cytokineza ostatecznie zawodzi, tworząc komórki wielojądrowe17-19. Co ciekawe, chociaż C. elegans ani-1 koordynuje kurczliwość aktomiozyny we wczesnym zarodku, nie jest ona niezbędna do cytokinezy. Jednak, jak opisano powyżej, ani-1 jest niezbędny do cytokinezy neuroblastów podczas środkowej embriogenezy (Fotopoulos, Wernike i Piekny, obserwacje niepublikowane). Niepowodzenie cytokinezy zmieniłoby liczbę i położenie neuroblastów i mogłoby wpłynąć na lokalizację chemicznych wskazówek naprowadzających lub mogłoby zmienić właściwości mechaniczne tkanki. Oba modele podkreślają nieautonomiczną rolę neuroblastów w zamykaniu układu brzusznego oraz znaczenie komunikacji tkankowo-tkankowej podczas rozwoju embrionalnego.

Ten eksperymentalny protokół opisuje, jak obrazować podział komórek podczas środkowej embriogenezy C. elegans za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Większość doświadczeń badających mechanizmy podziału komórek przeprowadzono w pojedynczych komórkach w obrębie szalek hodowlanych (np. HeLa lub komórki S2) lub we wczesnych zarodkach z ograniczoną liczbą komórek (np. zarodki jednokomórkowe C. elegans, zarodki Xenopus lub szkarłupnie). Jednak ważne jest, aby badać również podział komórek w tkankach, ponieważ istnieją zewnętrzne sygnały, które mogą wpływać na czas i umiejscowienie płaszczyzny podziału. Co więcej, komórki mogą dostarczać chemicznych lub mechanicznych wskazówek, aby wpływać na rozwój sąsiednich tkanek i ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób komunikacja międzykomórkowa pomaga w tworzeniu się tkanek podczas rozwoju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie płytek do utrzymania szczepów robaków i wykonywania RNAi

  1. Płytki do hodowli nicieni
    1. Płyty
      1. Przygotuj płytki z pożywką do wzrostu nicieni (NGM) w celu utrzymania szczepów robaków i przeprowadzenia krzyżówek genetycznych. Połączyć 3 g NaCl, 17 g agaru i 2,5 g Bactopeptone z 1 l wody destylowanej w kolbie o pojemności 2 litrów i dodać metalową mieszadło.
      2. Kolbę należy sterylizować w autoklawie, aby rozpuścić agar i wysterylizować pożywkę. Następnie umieścić kolbę na płytce mieszającej i pozostawić podłoże do ostygnięcia, mieszając.
      3. Gdy podłoże ostygnie i będzie jeszcze nieco ciepłe w dotyku (45-50 °C), dodać 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg/ml roztworu cholesterolu i 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu (PPB; przepis w tabeli odczynników/materiałów; przefiltrować wysterylizować roztwory podstawowe) i natychmiast wlać pożywkę do małych szalek Petriego (60 mm x 15 mm; napełnić naczynia ~3/4 do góry lub 13 ml/płytkę za pomocą automatycznego dozownika). Uwaga: W celu długotrwałego utrzymania niektórych szczepów do płytek można dodać tetracyklinę (12,5 μg/ml), aby umożliwić inaktywację genu bakteryjnego RNAZA III transpozonem Tn10.
      4. Pozwól pożywce zestalić się przez noc w temperaturze pokojowej. Uwaga: Płytki należy przechowywać w okapie biologicznym lub w miejscu laboratorium, które jest mniej podatne na zanieczyszczenie. Usuń również kondensację, która nagromadziła się na pokrywkach (np. wyczyść bibułą), aby ograniczyć zanieczyszczenie grzybami. Jeśli do płytek dodaje się również tetracyklinę, przykryj je folią aluminiową, ponieważ ten antybiotyk jest wrażliwy na światło.
      5. Następnego dnia wysiać suche płytki NGM zawiesiną E. coli (szczep OP50; patrz sekcja 1.1.2), która została delikatnie zawirowana. Aby zrobić płytki do krycia, dodaj ∼50 μl OP50 do środka każdej płytki (aby utworzyć mały okrąg). Aby wykonać płytki do utrzymywania szczepów robaków, wysiewaj każdą płytkę NGM ∼100-200 μl OP50 (aby upewnić się, że pokrywa większą powierzchnię płytki).
      6. Pozwól wysianym talerzom wyschnąć O/N w temperaturze pokojowej.
      7. Następnego dnia odwróć wysuszone płytki NGM do góry nogami i ułóż je w plastikowych pojemnikach do przechowywania w temperaturze 4 °C. Uwaga: Płytki nadają się do użytku do ∼3-4 tygodni. Płytki zawierające tetracyklinę należy przechowywać w ciemności.
    2. żywność
      1. Użyj E. coli OP50 [z Caenorhabditis Genetics Center (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] jako źródła pożywienia dla C. elegans. Uwaga: OP50 może być przechowywany w postaci zapasów glicerolu w temperaturze -80 °C (stosunek 1:1 do 50% v/v glicerolu).
      2. Aby zrobić OP50 dla płytek NGM, należy wykonać płytkę smugową, używając małej porcji glicerolu (<10 μl; użyć sterylnej końcówki do pipety). Rozprowadzić bakterie na płytce agarowej LB (przepis w tabeli odczynników/materiałów) i pozostawić w temperaturze 37 °C na ~16 godzin. Uwaga: Jeśli występują problemy z zanieczyszczeniem, można użyć opornej na streptomycynę OP50, a streptomycynę można dodać do płytek agarowych LB (50 μg/ml).
      3. Następnego dnia wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep 100 ml płynnej pożywki LB (przepis w tabeli odczynników/materiałów) w kolbie o pojemności 500 ml.
      4. Pozwól kulturze wyrosnąć w temperaturze O/N w temperaturze 37 °C, potrząsając.
      5. Następnego dnia użyj zawiesiny bakteryjnej do wysiewu płytek NGM. Uwaga: OP50 można przechowywać w probówkach stożkowych o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C przez ∼4-6 tygodni.
  2. RNAi
    Karmienie jest jednym z głównych sposobów przeprowadzania interferencji za pośrednictwem RNA (RNAi; w celu powalenia określonego produktu genowego) u C. elegans. Hermafrodyty C. elegans mogą być karmione szczepem E. coli HT115 przekształconym za pomocą wektora żywieniowego, który wyraża dsRNA po indukcji. Ten dsRNA (lub jego fragmenty) jest przekazywany do gonady, co zwykle prowadzi do znacznego knockdownu określonego genu docelowego.
    1. Płytki RNAi
      1. Przygotować płytki NGM w sposób opisany powyżej (patrz sekcja 1.1.1), ale także dodać 1 ml 1 M IPTG (izopropylotio-beta-D-galaktozyd; w celu wywołania ekspresji dsRNA) i 500 μl 50 mg/ml ampicyliny (Amp; wektory wyrażające dsRNA są odporne na Amp) do ciepłej pożywki (45-50 °C).
      2. Po wyschnięciu płytek zasiej je ~50-100 μl E. coli HT115 (patrz sekcja 1.2.2). Uwaga: Talerze bez nasion można przechowywać w temperaturze 4 °C przez ~4-5 tygodni.
      3. Pozostaw wysiane talerze do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.
      4. Następnego dnia odwróć wysuszone płytki RNAi do góry nogami i przechowuj je w plastikowym pojemniku do przechowywania w temperaturze 15-20 °C. Uwaga: Płytki z nasionami zachowują wydajność RNAi do ∼2-3 tygodni.
    2. RNAi Żywność
      1. Należy użyć E. coli HT115 (z CGC; patrz sekcja 1.1.2) przekształconego za pomocą wektora pokarmowego L4440 lub L4440 zawierającego cDNA do interesującego genu. Uwaga: Biblioteki zasilające, które są ukierunkowane na większość otwartych ramek odczytu w genomie, zostały już stworzone i są dostępne (klony w L4440 przekształcone w HT115; np. zawierający fragment z Y49E10.19 dla ANI-1 20-21; http://www.gurdon.cam.ac.uk/~ahringerlab/pages/rnai.html). Uwaga: HT115 może być przechowywany w postaci zapasu glicerolu w temperaturze -80 °C (stosunek 1:1 do 50% v/v glicerolu).
      2. Aby wygenerować nowy konstrukt ukierunkowany na gen będący przedmiotem zainteresowania, zobacz mapę wektorów L4440 i sklonuj cDNA między flankującymi promotorami T7, które są indukowane przez IPTG.
      3. Przekształć HT115 za pomocą konstruktu L4440 przy użyciu standardowego protokołu transformacji (np. wytworzyć chemicznie kompetentne bakterie i przeprowadzić transformację szoku cieplnego).
      4. Jak opisano dla OP50 (patrz sekcja 1.1.2), na płytce agarowej LB należy rozsiać bakterie smugowe z glicerolu, ale płytka powinna również zawierać 50 μg/ml ampicyliny. Uwaga: Jeśli używasz wcześniej istniejącej konstrukcji L4440, pomiń sekcje 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. Wybrać pojedynczą kolonię i zaszczepić 5 ml pożywki LB zawierającej 5 μl ampicyliny z wywaru 50 mg/ml (LB Amp) i umieścić ją w temperaturze 37 °C, wstrząsając.
      6. Po ~16 godzinach zaszczepić 5 ml świeżej pożywki LB Amp 50 μl kultury O/N i hodować kulturę przez 7-8 godzin z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C.
      7. Odwirować bakterie przez 1 minutę przy 4,000-8,000 x g, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl świeżej pożywki LB Amp.
      8. Użyj tego roztworu bakteryjnego do wysiewu płytek RNAi, jak opisano powyżej (patrz sekcja 1.2.1). Uwaga: HT115 należy zużyć natychmiast i nie należy go przechowywać.

2. Uprawa szczepów robaków

Utrzymuj szczepy C. elegans zamówione z CGC na płytkach NGM zgodnie ze standardowym protokołem1. Szczepy używane w tym protokole obejmują: C. elegans var Bristol, typ dziki (identyfikator szczepu w CGC N2); UNC-119(TM4063); wgIs102 [ham-1::TY1::EGFP::3xFLAG + unc-119(+)] (identyfikator szczepu w CGC OP102); UNC-119(ED3); ltIs44pAA173 [pie-1p-mCherry::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)] (identyfikator odkształcenia w CGC OD70); AJM-1(OK160); jcEx44 [ajm-1::GFP + rol-6(su1006)] (ID szczepu w CGC SU159); UNC-119(ED3); xnIs96 [pJN455(hmr-1p::hmr-1::GFP::unc-54 3'UTR + unc-119(+)] (identyfikator odkształcenia w CGC FT250).

  1. Wybierz ~ 3 młode dorosłe hermafrodyty, które wykazują prawidłowy fenotyp na świeżej płytce NGM. Uwaga: N2 (var. Bristol; typ dziki) może być utrzymywany w temperaturze 15-25 °C, ale szybciej osiąga gęstość w wyższych temperaturach. Nowe zapasy należy robić, gdy zagęszczenie robaków jest wysokie.
  2. Wszystkie szczepy fluorescencyjne (np. GFP i/lub robaki wykazujące ekspresję mCherry) należy przechowywać w temperaturze 20–25 °C w celu uzyskania optymalnej ekspresji białek fluorescencyjnych. Nowe zapasy należy robić, gdy zagęszczenie robaków jest duże, a pokarm niski.
  3. Do zbierania robaków użyj szpikulca wykonanego z ciągniętej szklanej pipety z platynowym drutem stopionym na wyciągniętym końcu (o długości ~3-5 cm). Spłaszcz drut o gładkiej krawędzi. Użyj kilofa, aby "zgarnąć" hermafrodyty i przenieść je na nowe talerze. Podpal drut między użyciem, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego szczepów.

3. RNAi

  1. Wykonywanie RNAi
    1. Najpierw umieść ~8 hermafrodytów L4 na niewysiewanej płytce NGM na ~30-60 minut, aby usunąć bakterie OP50 z robaków.
    2. Następnie umieść 8 hermafrodytów na płytce NGM Amp IPTG wysianej HT115, która przenosi plazmid L4440 eksprymujący dsRNA do interesującego genu (np. ANI-1; patrz 1.2) przez ~24 godziny. Uwaga: W zależności od interesującego genu lub pożądanych fenotypów (które mogą zależeć od siły knockdownu), robaki można pozostawić na płytkach RNAi na krótsze lub dłuższe okresy czasu (po 24 godzinach umieść hermafrodyty na świeżych płytkach RNAi).
    3. W celu kontroli ujemnej umieść robaki na płytce RNAi wysianej HT115 niosącej pusty wektor L4440. Uwaga: Te zarodki nie powinny mieć fenotypów.
    4. W celu kontroli pozytywnej umieść robaki na płytce RNAi z ekspresją dsRNA, która jest ukierunkowana na gen o dobrze scharakteryzowanych fenotypach. Uwaga: W przypadku rho-1 (Y51H4A.3) zarodki są w 100% śmiertelne po 24 godzinach, a hermafrodyty są bezpłodne po 48 godzinach.
  2. Skuteczność RNAi
    Należy zbadać poziomy knockdownu przez RNAi, zwłaszcza że niektóre tkanki mogą być bardziej odporne niż inne. We wczesnej środkowej embriogenezie większość tkanek jest wrażliwa na RNAi, ale w późnym zarodku lub larwie neurony są odporne na RNAi. Różne szczepy mogą być stosowane w celu poprawy wrażliwości RNAi (np. rrf-3) lub do generowania tkankowo specyficznego RNAi (np. sid-1 w połączeniu z transgenem ulegającym ekspresji przez promotor neuronalny UNC-119).
    1. Western Blotting
      Immunoblotting przy użyciu białek C. elegans można przeprowadzić zgodnie ze standardowym protokołem22.
      1. Po wykonaniu RNAi zebrać ~10 grawitacyjnych (wypełnionych zarodkami) hermafrodytów w probówce mikrowirówkowej, dodać 20-30 μl 1x bufor próbki SDS-PAGE i poddać lizie przez gotowanie przez ~ 2 min. Podobnie, zbierz robaki N2 w osobnej probówce dla próbki kontrolnej. Uwaga: Liczba hermafrodytów może się różnić w zależności od wrażliwości przeciwciał pierwszorzędowych.
      2. Utworzyć rozcieńczenia próbki kontrolnej (np. 3-100%) w buforze próbki. Załaduj próbki kontrolne i RNAi i uruchom za pomocą SDS-PAGE zgodnie ze standardowym protokołem (% żelu będzie się różnić w zależności od wielkości białka będącego przedmiotem zainteresowania).
      3. Przenieś żel do błony i wykonaj immunoblotting zgodnie ze standardowym protokołem. Uwaga: Należy stosować różne rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych zgodnie z zaleceniami dla każdego przeciwciała.
      4. Rozwinąć (np. w przypadku stosowania chemiluminescencji) lub zeskanować (np. w przypadku stosowania fluorescencji) immunoblot i porównać gęstość prążków na liniach N2 z pasami RNAi i określić poziom knockdownu (np. gęstość pasa RNAi odpowiada 12% pasowi kontrolnemu, co sugeruje, że białko jest zmniejszone o 88%). Uwaga: Aby zobaczyć skuteczność knockdown ANI-1, zobacz Maddox et al.23
    2. Barwienie immunologiczne
      Barwienie immunologiczne u C. elegans można przeprowadzić zgodnie ze standardowym protokołem22.
      1. Po wykonaniu RNAi należy zebrać grawitacyjne hermafrodyty i pobrać zarodki jedną z dwóch metod. W przypadku jednej z metod umieścić hermafrodyty w buforze M9 (przepis w tabeli odczynników/materiałów) w 1,5 ml silikonowanych probówek do mikrowirówek i osadzać przez wirowanie (1,000-4,000 x g). Uwaga: Podobnie zbieraj hermafrodyty ciężarne N2.
      2. Usuń roztwór M9.
      3. Wydalić zarodki, dodając 1 ml roztworu wybielającego (1 M NaOH, 5% wybielacza) do probówki mikrowirówkowej na 3 minuty. Podobnie wybielaj hermafrodyty N2, aby uzyskać szkiełka kontrolne.
      4. Delikatnie wymieszać, a następnie natychmiast otoczkować zarodki przez odwirowanie (4 000-8 000 x g) i usunąć roztwór wybielający. Uwaga: Całkowity czas inkubacji robaków z wybielaczem nie powinien przekraczać 5 minut.
      5. Przemyj zarodki 3x buforowaną solą fizjologiczną Tris (TBS; 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl) i przenieś zarodki za pomocą szklanej pipety Pasteura na szkiełko mikroskopowe pokryte poli-L-lizyną. Uwaga: Aby pokryć szklane szkiełko mikroskopowe poli-L-lizyną, najpierw przetrzyj szkiełko, a następnie dodaj kroplę (~20-30 μl) poli-L-lizyny i rozprowadź ją równomiernie na powierzchni i pozostaw do wyschnięcia. Aby uzyskać optymalne rezultaty, pokryj szkiełka jeszcze dwa razy. Alternatywną metodą pobierania zarodków (sekcje 3.2.2.1-3.2.2.5) jest umieszczenie kropli M9 na szkiełku mikroskopowym pokrytym poli-L-lizyną i pobranie do kropli ~10 grawitacyjnych hermafrodytów.
      6. Dodaj szkiełko nakrywkowe na wierzchu każdego szkiełka mikroskopowego (do obszaru, w którym znajduje się większość zarodków) i umieść szkiełka w ciekłym azocie. Uwaga: W przypadku hermafrodytów umieszczonych bezpośrednio w kropli, należy docisnąć szkiełko nakrywkowe, aby rozbić hermafrodyty i wydalić zarodki.
      7. Zamknąć zarodki, strzepując szkiełka nakrywkowe natychmiast po zamrożeniu ich w ciekłym azocie.
      8. Umieść szkiełka w lodowatym metanolu na 20 minut, aby utrwalić zarodki. Uwaga: W przypadku niektórych antygenów preferowany może być utrwalacz sieciujący, taki jak paraformaldehyd. Patrz protokół z Duerr22.
      9. Ponownie nawodnić i przepuszczalnie zarodki, myjąc szkiełka 4x buforowaną solą fizjologiczną Tris zawierającą Tween-20 (TBST; 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20) przez 10 minut każda.
      10. Wysuszyć każde szkiełko wokół obszaru, w którym znajduje się większość zarodków i narysować okrąg wokół zarodków za pomocą pisaka blokującego płyn (np. pisaka PAP).
      11. Dodać ~100 μl TBST z 5% normalną surowicą osła (NDS; blok) do każdego szkiełka (obszar zakreślony) i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Uwaga: Umieść szkiełka w "mokrej komorze" (np. naczyniu z pokrywką zawierającą mokre ręczniki papierowe).
      12. Usuń blok, dodaj ~50-100 μl przeciwciał pierwszorzędowych (rozcieńczonych w TBST) do każdego szkiełka (obszar zakreślony) i inkubuj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Uwaga: W zależności od przeciwciała czas rozcieńczenia i inkubacji może się różnić. Aby wykryć GFP, używamy pierwotnego przeciwciała anty-mysiego anty-GFP w rozcieńczeniu 1/200. Do wykrycia ANI-1 używamy pierwszorzędowego przeciwciała anty-króliczego anty-ANI-1 w rozcieńczeniu 1/1600 (uprzejmie dostarczone przez Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill). W celu wydłużenia czasu inkubacji należy umieścić szkiełka w temperaturze 4 °C.
      13. Usuń przeciwciała pierwotne (jeśli to możliwe, zachowaj do wykorzystania w przyszłości) i myj szkiełka 3x TBS przez 5 minut każda.
      14. Usuń ostatnie płukanie i dodaj ~50-100 μl przeciwciał drugorzędowych (rozcieńczonych w TBST) do każdego szkiełka (obszar zakreślony) i inkubuj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Uwaga: W zależności od przeciwciała rozcieńczenie może się różnić. Do wykrycia GFP używamy przeciwciała drugorzędowego przeciwko myszom Alexa Fluor 488 w rozcieńczeniu 1/250. Do wykrycia ANI-1 używamy przeciwciała drugorzędowego anty-królika Alexa Fluor 568 w rozcieńczeniu 1/250.
      15. Usuń przeciwciała wtórne i przemyj szkiełka 3x TBS przez 5 minut każda. Uwaga: Aby wybarwić DNA, dodaj ~ 50-100 μl DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol; 1 mg / ml) w rozcieńczeniu 1/500 w TBST przez 5 min.
      16. Usuń DAPI i umyj szkiełka 2x z TBS po 5 min każda. Uwaga: Jeśli barwienie DAPI nie zostanie wykonane, pomiń ten dodatkowy krok prania.
      17. Wykonaj jedno szybkie płukanie 0,1M Tris (pH 9), wyjmij i dodaj ~15 μl podłoża montażowego podgrzanego do 37 °C (4% 3,4.5-trihydroksybenzoesanu n-propylu (galusan propylu), 50 mM Tris, pH 9 w 50% glicerolu) do każdego szkiełka (obszar zakreślony).
      18. Dodaj szkiełko nakrywkowe do każdego szkiełka (na wierzchu nośnika montażowego w zakreślonym obszarze), odchodź nadmiar płynu i uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci. Uwaga: Preparaty można przechowywać w temperaturze -20 °C.
      19. Obserwuj zarodki na szkiełkach za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego lub laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Co ważne, dostosuj ustawienia, aby zbierać obrazy o optymalnej intensywności pikseli przy użyciu zarodków kontrolnych (N2 lub nie-RNAi). Następnie zbierz obrazy z zarodków RNAi przy użyciu tych samych ustawień. Przykłady obrazów pobranych do kontroli zarodków vs. ani-1 RNAi przedstawiono na rycinie 2B.

4. Przygotowanie preparatów do obrazowania na żywo i pobierania zarodków

  1. Przygotowanie padów agarozowych do obrazowania na żywo
    1. Umieść czyste, wstępnie ogrzane szkiełko mikroskopowe między dwoma innymi szkiełkami, z których każde ma 1-2 paski taśmy.
    2. Za pomocą szklanej pipety Pasteura dodaj jedną kroplę 2% w/v agarozy (rozpuszczonej w podgrzanej wodzie destylowanej) do szkiełka.
    3. Szybko umieść drugie, czyste szkiełko mikroskopowe na pierwszym szkiełku w prostopadły sposób, aby spłaszczyć kroplę agarozy. Uwaga: Taśma na sąsiednich slajdach określa grubość podkładki.
    4. Pozostaw wacik agarozowy do wyschnięcia na 1-2 minuty przed wyjęciem górnego szkiełka. Ostrożnie zsuń górną prowadnicę, aby uniknąć złamania podkładki agarozowej pod spodem. Uwaga: Czasami podkładka jest przenoszona na górny suwak i nadal nadaje się do użytku, o ile pozostaje nienaruszona.
    5. W ciągu kilku minut po przygotowaniu należy przenieść zarodki na płatek agarozowy, jak opisano poniżej (patrz krok 4.2). Uwaga: Podkładka powinna mieć nieprzezroczysty wygląd; Gdy jest klarowny, jest zbyt suchy, aby go użyć.
  2. Pobieranie zarodków
    1. Do pobierania zarodków do obrazowania na żywo należy stosować następujący protokół, który pochodzi z Sulston i wsp. 24
    2. Zbierz około 4-6 grawitacyjnych dorosłych (nie zagłodzonych) z płytek NGM lub RNAi i umieść je w 20-30 μl buforu M9 w studzience na szkiełku depresyjnym.
    3. Użyj wysterylizowanego skalpela, aby przeciąć robaki po obu stronach spermateki (lub alternatywnie w pobliżu sromu), aby uwolnić zarodki do roztworu.
    4. Użyj gumowego węża z ustnikiem podłączonego do szklanej kapilary/pipety pociągniętej do małego otworu i odsysaj zarodki przez pipetowanie doustne. Alternatywnie, zbierz zarodki za pomocą szklanej rurki kapilarnej, która jest przymocowana do gumowej gruszki pipety Pasteura.
    5. Przenieś odessane zarodki do drugiej studzienki, również zawierającej bufor M9, aby pomóc oddzielić je od resztek robaków.
    6. Następnie odessać zarodki na świeżo przygotowaną podkładkę z agarozy (patrz krok 4.1).
    7. Zlepiaj zarodki razem za pomocą rzęsy (przyklejonej do wykałaczki), aby zwiększyć liczbę zarodków, które można sfilmować w jednej płaszczyźnie x, y. Uwaga: Aby uniknąć niedoboru tlenu, nie należy łączyć ze sobą więcej niż 10 zarodków.
    8. Następnie przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym i częściowo zamknij je podgrzanym płynem VALAP (wazelina, lanolina i parafina; stopione i połączone w stosunku 1:1:1), aby zapobiec odwodnieniu zarodków podczas obrazowania. Uwaga: Do elektrody można dodać dodatkowy bufor M9, aby upewnić się, że zarodki mają wystarczającą ilość płynu do obrazowania. Zamiast VALAP, wazelina może być używana do częściowego uszczelniania szkiełek nakrywkowych, ale jest mniej sztywna, co powoduje ślizganie się szkiełek nakrywkowych i może dostać się na obiektywy mikroskopu.

5. Obrazowanie na żywo

  1. Aby uwidocznić neuroblasty, uzyskaj szczep robaka, który wyraża białko specyficzne dla neuroblastów przyłączone do białka fluorescencyjnego (np. HAM-1:GFP, identyfikator szczepu w CGC OP102). Aby wykryć błony komórkowe, użyj szczepu robaka, który również wyraża domenę białkową, która rozpoznaje lipidy przyłączone do innego białka fluorescencyjnego (np. mCherry:PH, identyfikator szczepu w CGC OD70).
  2. Pobrać zarodki z fluorescencyjnych hermafrodytów trzymanych na płytkach kontrolnych lub płytkach RNAi ani-1 (patrz Protokoły 3 i 4) i przygotować preparaty zgodnie z powyższym opisem (patrz Protokół 4).
  3. Obrazowanie zarodków w 4D (x, y, z i poklatkowe) za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Użyj systemu szerokokątnego [zautomatyzowany mikroskop fluorescencyjny z filtrami do GFP i TexasRed, obiektywy do 60X lub 100X), kamerę CCD (urządzenie sprzężone z ładunkiem) o wysokiej rozdzielczości), stolik o wysokim zmotoryzowanym silniku (np. Piezo Z) i specjalistyczne oprogramowanie do akwizycji] lub mikroskop konfokalny pola zamiatania livecan [zautomatyzowany fluorescencyjny mikroskop skaningowy z laserami 488 nm i 561 nm, obiektywami do 100X, kamerą EMCCD (CCD zwielokrotniającą elektrony), wysoce zmotoryzowanym stolikiem (np. Piezo Z) i specjalistycznym oprogramowaniem do akwizycji]. Uwaga: W przypadku systemu szerokokątnego użycie diod LED i kamery EMCCD ograniczy fototoksyczność. Można również użyć mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem zamiast systemu pola zamiatania.
  4. Aby zobrazować podział komórek neuroblastów w dowolnym układzie, znajdź ramki x, y zarodków za pomocą obiektywów 10X lub 20X i wybierz optymalną ramkę x, y, w której zarodki przechodzą interkalację grzbietową (krok przed zamknięciem brzusznym; Rysunek 1A) lub znajdują się we wczesnych stadiach zamknięcia brzusznego (∼350 min po pierwszym podziale komórki; Rysunek 1A).
  5. Na mikroskopie pola przemiatanego użyj laserów 488 nm i 561 nm o mocy 100 mW ze szczeliną 50%. W systemie szerokokątnym należy używać filtrów GFP i TexasRed o natężeniu światła o niskim i średnim natężeniu (jeśli można je kontrolować). Uwaga: W przypadku systemu szerokokątnego diody LED mają niską fototoksyczność i są preferowane.
  6. W obu systemach należy użyć obiektywów zanurzeniowych 60X lub 100X i zebrać 20 stosów Z po 0,2 μm co 2 minuty, co daje łącznie 10 minut. Uwaga: Chociaż sondy HAM-1:GFP i mCherry:PH wyrażają się na stosunkowo wysokich poziomach, czasy naświetlania dla każdej sondy będą musiały być zoptymalizowane dla różnych mikroskopów. Uwaga: W przypadku systemu szerokokątnego zaleca się mniejszą liczbę stosów Z, aby ograniczyć fototoksyczność, a w przypadku obrazowania w dłuższych okresach czasu należy używać mniejszej liczby punktów czasowych.
  7. Aby zminimalizować fototoksyczność spowodowaną ekspozycją zarodków na światło UV w systemie szerokokątnym (w przypadku korzystania z żarówki rtęciowej), zamknij przysłonę do 30% i zmniejsz natężenie światła (za pomocą regulowanego systemu oświetlenia). Uwaga: Chociaż wzmocnienie nie jest wymagane w żadnym z systemów, inne mikroskopy mogą mieć źródła światła o mniejszej intensywności lub obiektywy o różnych aperturach numerycznych, co może wymagać użycia wzmocnienia w celu uzyskania obrazów o optymalnej intensywności pikseli. Zbadać warunki przy użyciu zarodka kontrolnego, aby upewnić się, że żadne zaobserwowane fenotypy nie są spowodowane sztuczną fototoksycznością.

6. Analiza danych mikroskopowych

  1. Aby przeanalizować obrazy, wyeksportuj pliki jako TIFF i otwórz je jako stos za pomocą specjalistycznego oprogramowania, takiego jak program do przetwarzania obrazów oparty na języku Java (np. ImageJ, NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/). Uwaga: W zależności od oprogramowania do pobierania użytego do zebrania obrazów, pliki mogą być przechowywane w oryginalnej formie i otwierane w ImageJ. Jest to preferowane, ponieważ metadane są przechowywane wraz z plikami.
  2. Podziel stos na "obrazy" i wybierz punkty czasowe i płaszczyzny Z zgodnie z potrzebami. Uwaga: Chociaż pobiera się stos 20 płaszczyzn Z, wiele neuroblastów ma grubość <1 μm podczas średnio późnej embriogenezy i potrzeba tylko kilku płaszczyzn Z.
  3. Ułóż ponownie wybrane płaszczyzny Z dla każdego punktu czasowego i utwórz osobne rzuty stosu Z. Następnie ułóż projekcje dla każdego punktu czasowego razem, aby utworzyć sekwencję czasową.
  4. Dostosuj jasność/lub kontrast dla każdego kanału.
  5. Następnie wybierz interesujący Cię obszar, przytnij (i obróć, jeśli to konieczne) region.
  6. Twórz scalone obrazy za pomocą funkcji "scalone kanały" i wybierz inny kolor dla każdego kanału. Konwertuj scalone obrazy na RGB.
  7. Odwróć obrazy w skali szarości dla każdego kanału z kroków 6.3 lub 6.4 (użyj funkcji "odwróć" w sekcji "edytuj"), aby bardziej przejrzysta wizualizacja obrazów.
  8. Zapisz wszystkie końcowe obrazy jako 8-bitowe pliki TIFF, aby tworzyć figury w programach wektorowych lub jako pliki Quicktime, aby tworzyć filmy.
  9. Jeśli potrzebne są pomiary rozmiaru piksela (np. w celu dołączenia skali do obrazów), użyj ImageJ lub innego oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby zmierzyć rozmiar zarodka. Uwaga: obrazy zebrane przy użyciu różnych celów będą miały różne rozmiary pikseli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten eksperymentalny protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w zarodkach C. elegans podczas środkowej embriogenezy. W szczególności opisano, w jaki sposób obrazować neuroblasty, które mogą ułatwiać morfogenezę naskórka. Morfogeneza naskórka zachodzi w wyniku połączenia zmian kształtu komórek naskórka, migracji i adhezji, ale opiera się również na chemicznych lub mechanicznych sygnałach z leżących poniżej neuroblastów (ryc. 1B). Neuroblasty wydzielają sygnały naprowadzające, które są odbie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje zastosowanie różnych rodzajów mikroskopii do obrazowania podziałów komórkowych podczas środkowej embriogenezy. W szczególności protokół ten podkreśla, w jaki sposób można obrazować podział neuroblastów, komórek, które mogą ułatwiać morfogenezę naskórka. Komunikacja komórka-komórka jest ważna dla tworzenia tkanek podczas rozwoju metazoan , a C. elegans jest doskonałym modelem do badania tworzenia tkanek in vivo. Jednym ze zdarzeń, które ładnie obrazuje wzajemne oddziaływanie tkanek, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną potwierdzić, że ta praca była wspierana przez grant Kanadyjskiej Rady ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarBioShop Kanada Inc.#AGR001.1Do wytwarzania płytek C. elegans NGM i RNAi
AgarBio Basic Inc.#9002-18-0Do produkcji bakteryjnych płytek agarowych LB
AgaroseBioShop Canada Inc.#AGA001.500
Przeciwciało przeciw myszom Alexa Fluor 488Life Technologies Corporation (Invitrogen#A11029
Przeciwciało anty-mysie anty-GFPRoche Applied Science#11814460001
Przeciwciało przeciw królikowi Alexa Fluor 568Life Technologies Corporation (Invitrogen#A11011
AmpicillinBioShop Canada Inc.#AMP201.5Przechowuj proszek w temperaturze 4 stopni; C i rozpuszczoną ampicylinę w temperaturze -20 & stopni; C
Bactopetone  (pepton-A)Bio Basic Inc.
CaCl2 (chlorek wapnia)BioShop Canada Inc.#C302.1
CholesterolBioShop Kanada Inc.#CHL380.25Rozpuścić w etanolu
DAPI Sigma-Aldrich#D9542Służy do barwienia kwasów nukleinowych (DNA)
GlycerolBioShop Canada Inc.#GLY001.1
IPTG (izopropylotio-β-galaktozyd)Bio Basic Inc.#367-93-1Przechowywać proszek i rozpuszczony IPTG w temperaturze -20 stopni; C
KH2PO4 (fosforan potasu, monozasadowy)BioShop Canada Inc.#PPM666.1
K2HPO4 (fosforan potasu, dwuzasadowy)BioShop Canada Inc.#PPD303.1
L4440  (wektor karmienia)Addgene#1654Utrzymuj zapas glicerolu na poziomie -80 ° C
MgSO4    (siarczan magnezu)BioShop Kanada Inc.#MAG511.500
NaCl (chlorek sodu)Bio Basic Inc.#7647-14-5
Na2HPO4 (fosforan sodu, dwuzasadowy)Bio Basic Inc.#7558-79-4
Normalna surowica osła (NDS)Bioprodukty żubra#035-110
n-propylo-3,4,5-trihydroksybenzoesan (galusan propylu)Alfa Aesar#A10877
Poli-L-lizynaSigma-Aldrich#P8920Dla uzyskania optymalnych rezultatów trzykrotnie pokryj szkiełka mikroskopowe 
StreptomycynaBioShop Kanada Inc.#STP101.50Przechowywać proszek w temperaturze 4 stopni; C i rozpuszczona streptomycyna w temperaturze -20 & deg; C
TetracyklinaBioShop Kanada Inc.#TET701.10Przechowywać proszek w temperaturze 4 stopni C i rozpuszczoną tetracyklinę w temperaturze -20 & stopni; C
Tween-20Bio Basic Inc.CAS#9005-64-5
TryptonBioShop Kanada Inc.#TRP402.500
Ekstrakt drożdżowyBio Basic Inc.#8013-01-2
#G213

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  3. C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  4. Pennisi, E. Worming secrets from the C. elegans genome. Science. 282, 1972-1974 (1998).
  5. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
  6. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).
  7. Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue. Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).
  8. Kiehart, D. P. Wound healing: the power of the purse string. Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).
  9. Ikegami, R., et al. Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans. Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).
  10. Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans. C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).
  11. Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph. Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).
  12. Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor. Development. 129, 5499-5510 (2002).
  13. Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis. Development. 132, 3679-3690 (2005).
  14. Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex. PLoS Genet. 8, (2012).
  15. Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. Cytokinesis: welcome to the Rho zone. Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).
  16. Piekny, A. J., Maddox, A. S. The myriad roles of Anillin during cytokinesis. Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).
  17. Zhao, W. M., Fang, G. Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis. J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).
  18. Piekny, A. J., Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis. Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).
  19. Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis. J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).
  20. Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  21. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  22. Duerr, J. S. Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).
  23. Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo. Development. 132, 2837-2848 (2005).
  24. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).
  25. Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans. Trends Genet. 16, 544-551 (2000).
  26. Zhang, H., Labouesse, M. Signaling through mechanical inputs – a coordinated process. J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).
  27. Guenther, C., Garriga, G. Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates. Development. 122, 3509-3518 (1996).
  28. Audhya, A., et al. A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).
  29. Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow. Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).
  30. Dorn, J. F., et al. Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans. Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).
  31. Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia fluorescencyjnamikroskopia szerokopolowamikroskopia konfokalnainterferencja RNAmarkery transgenicznezamkni cie brzusznemorfogeneza nask rkapodzia kom rki

Powiązane artykuły