Rozciąganie komórek z mikrowzorem na błonie PDMS

Podsumowanie

Ten manuskrypt przedstawia technikę wywierania lub uwalniania sił na przylegające komórki lub tkanki za pomocą jednokierunkowego rozciągania.

Streszczenie

Siły mechaniczne wywierane na komórki i/lub tkanki odgrywają główną rolę w wielu procesach. Opracowaliśmy urządzenie do rozciągania komórek posianych na membranie PolyDiMethylSiloxane (PDMS), kompatybilne z obrazowaniem. Ta technika jest powtarzalna i wszechstronna. Membrana PDMS może być mikrowzorowana w celu ograniczenia komórek lub tkanek do określonej geometrii. Pierwszym krokiem jest wydrukowanie mikrowzorów na membranie PDMS techniką głębokiego UV. Membrana PDMS jest następnie montowana na napinaczach mechanicznych. Komora jest połączona z membraną biokompatybilnym smarem, aby umożliwić ślizganie się podczas rozciągania. Komórki są wysiewane i pozostawiane do rozprzestrzeniania się przez kilka godzin na mikrowzorach. Próbka może być wielokrotnie rozciągana i nierozciągana za pomocą mikrometrycznej. Wykonanie odcinka w pełnym zakresie zajmuje mniej niż minutę (około 30%). Przedstawiona tutaj technika nie obejmuje urządzenia z napędem, które jest niezbędne do szybkiego wykonywania powtarzających się cykli rozciągania i/lub rozciągania sterowanego komputerowo, ale można to wdrożyć. Rozciąganie komórek lub tkanek może być interesujące w przypadku pytań związanych z siłami komórkowymi, reakcją komórki na stres mechaniczny lub morfogenezą tkanek. Ta prezentacja wideo pokaże, jak uniknąć typowych problemów, które mogą pojawić się podczas wykonywania tego typu pozornie prostego eksperymentu.

Wprowadzenie

Komórki tworzące tkankę w organizmach wyższych podlegają mechanicznym naprężeniom i siłom rozciągającym pochodzącym albo ze środowiska zewnętrznego, albo z otaczających komórek^1,2. Komórki muszą przystosować się do tych sił i oprzeć się im, aby utrzymać integralność tkanek. Siły te są również ważne dla morfogenezy tkanek podczas rozwoju^3,4. Przyłożenie sił mechanicznych do hodowanych komórek jest sposobem na naśladowanie tego, co może się wydarzyć w tkance, ale z ilościową i niezależną kontrolą kształtu komórki i deformacji komórki^5,6. W tym celu można zastosować kilka technik. Można naciskać na komórki (całą komórkę lub jej część), na przykład za pomocą AFM lub pochodnych^7,8 lub rozciągać podłoże, na którym rosną komórki.

Metoda opisana w tym artykule pokazuje, jak rozciągnąć płaskie podłoże pokryte komórkami. Technika ta została pierwotnie opracowana w celu oceny roli sił wywieranych na mitotyczne komórki ssaków⁹. Komórki mitotyczne pozostają połączone z podłożem poprzez włókna retrakcyjne, a rozciąganie błony wywierało siłę na te włókna, co z kolei powodowało rotację wrzeciona mitotowego. Interes w łączeniu mikrowzorów adhezyjnych i rozciąganiu polega na uzyskaniu niezależnej kontroli sił i kształtu poszczególnych komórek. Możliwe jest na przykład rozciągnięcie jajowatej komórki do idealnie izotropowego okrągłego kształtu, podczas gdy stosuje się rozciąganie jednoosiowe. Jeśli komórki nie są platerowane na mikrowzorach, rozciąganie jednoosiowe powoduje wydłużenie komórek, przy czym większość komórek ma długą oś wyrównaną z osią rozciągania. Trudno jest wtedy oddzielić efekt wyrównania długiej osi od efektu rozciągnięcia zastosowanego do komórek.

Urządzenie nadaje się do dowolnego obrazowania żywych komórek, w tym do długotrwałej mikroskopii fluorescencyjnej, a podczas eksperymentu można dodawać leki. Metoda mikromodelowania w głębokim promieniowaniu UV¹⁰ została szczegółowo opisana w Azioune i wsp.¹¹ Wzorzec na PDMS został opisany w Azioune et al.¹² Obecny protokół rozciągania jest wersją wideo Carpi i wsp.¹³

Protokół

1. Pasywacja PDMS

1. Wytnij kawałek PDMS o wymiarach około 35 mm x 20 mm z gotowego arkusza (na przykład GelPak, zgodnie z tabelą materiałów).
2. Usuń górną i dolną warstwę ochronną z tworzywa sztucznego (jeśli to konieczne) i użyj pęsety, aby umieścić PDMS na plastikowej (nie poddanej hodowli komórkowej) szalce Petriego.
3. Myć PDMS 70% etanolem przez 5 minut na rotatorze przy 30 oscylacjach/min.
4. Osusz powierzchnię, przepływając po niej powietrze.
5. Oświetlać głębokim promieniowaniem UV (λ = 180 nm) przez 5 minut w odległości około 5 cm od żarówek UV (patrz karta materiałów w celu odniesienia do lampy; parametry będą się różnić dla różnych lamp).
6. Przygotuj 200 μl roztworu EDC/NHS dla każdej cząstki PDMS (należy to przygotować tuż przed użyciem, ponieważ reaktywność roztworu zanika w ciągu godziny). Na 1 ml 0,05 M MES + 0,5 M buforu NaCl o pH 6,0 dodać 11,5 mg Sulfo-NHS i 19,2 mg EDC.
7. Przenieść arkusze PDMS z szalki Petriego na pokrywę szalki Petriego, która nie została podświetlona. Zapewni to, że otoczenie PDMS będzie bardzo hydrofobowe i ułatwi kolejny krok.
8. Dodać roztwór EDC/NHS i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
9. Spłucz EDC/NHS wodą.
10. Dodać roztwór PLL-g-PEG (0,5 mg/ml w HEPES 10 mM pH 8,6) i inkubować od 3 godzin do nocy w temperaturze pokojowej.
11. Opłucz PLL-g-PEG wodą. Pasywowany PDMS (funkcjonalizowany za pomocą PLL-g-PEG) może być przechowywany przez kilka dni w temperaturze 4 °C.

2. Wzorzec PDMS

1. Weź arkusz PDMS i umieść go na syntetycznej kwarcowej fotomasce z mikroelementami do tworzenia wzorów (patrz rysunek 1). Umieść stronę PDMS z PLL-g-PEG skierowaną w stronę chromowanej strony fotomaski.
2. Świecić przez 7 minut przez fotomaskę w odległości około 5 cm od żarówek UV.
3. Dodaj wodę do maski + PDMS i powoli oderwij PDMS od maski.
4. Inkubować z roztworem fibronektyny w stężeniu 50 mg/ml w buforze HEPES o pH 8,6 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Możliwe jest użycie innych białek ECM, ale nie zostały one przetestowane za pomocą tego protokołu.
5. Spłucz PBS.

3. Montaż urządzenia

1. Zamontuj wcześniej pasywowany PDMS na urządzeniu rozciągającym (patrz Dyskusja, aby zapoznać się z rozwiązywaniem problemów).
   1. Przymocuj jedną stronę PDMS do stałej części noszy.
   2. Przymocuj drugą stronę do ruchomej części noszy, nie zaciskając zbyt mocno arkusza PDMS.
2. Wytnij prostokąt PDMS (22 mm x 19 mm) w grubym dźgnięciu PDMS i wytnij kolejny prostokąt w środku, aby uzyskać pulę (lub ramkę), która zachowa komórki i nośniki (patrz Rysunek 2).
3. Dodaj smar silikonowy pod tę pulę PDMS i umieść go na wierzchu arkusza PDMS, aby utworzyć pulę retencyjną medium. Smar pozwoli na ślizganie się basenu po arkuszu PDMS podczas rozciągania.

4. Wzorowanie komórek

1. Odłączyć komórki od kolby hodowlanej o 50% konfluencji z Versenem.
2. Policz komórki i ponownie je zawieś w stężeniu 200 000 komórek/ml.
3. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do puli (dodatkowe informacje znajdują się w Dyskusji).
4. Pozwól komórkom związać się ze wzorami przez 10-30 minut (w zależności od typu komórki, komórki RPE-1 zajmą 10 minut, a komórki HeLa 20 minut).
5. Delikatnie przepłukać pływające komórki zrównoważonym podłożem (pożywka równoważąca w inkubatorze).
6. Pozwól komórkom rozprzestrzeniać się przez kilka godzin na wzorach (RPE-1 będzie potrzebował co najmniej 2 godzin; Komórki HeLa będą potrzebować 3 godzin).
7. Dodaj szkiełko nakrywkowe na wierzchu basenu, aby uniknąć parowania i wycieku medium w przypadku pęknięcia PDMS.
8. Umieść urządzenie na odwróconym mikroskopie i rozpocznij obrazowanie. Unikaj używania obiektywów zanurzeniowych w olejku, ponieważ nie będą one działać z powodu problemów z ostrością.

5. Rozciąganie

1. Przekręć mikrometryczną, jednocześnie korygując położenie stolika w osiach x, y i z (głównie x). Pozycja stolika musi zostać skorygowana, aby przeciwdziałać poszerzeniu PDMS i utracie ostrości. (Patrz akapit "Podczas rozciągania" w DYSKUSJI).

Wyniki

Technika przedstawiona w niniejszym protokole wideo umożliwiła przyłożenie sił do włókien retrakcyjnych w dzielących się komórkach ssaków. W rzeczywistości podczas podziału komórkowego, na etapie mitozy, komórki ssaków kurczą się, przyjmując kształt sfery i pozostawiając cienkie kabelki aktynowe otoczone błoną, które są przytwierdzone do podłoża. Kabelki te (włókna retrakcyjne) stanowią zapis geometrii komórki sprzed wejścia w fazę podziału. Tworzenie mikrowzorów za pomocą głębokiego UV przez fotomaskę na cienkiej warstw...

Dyskusja

Chociaż technika ta była wielokrotnie stosowana i jest dokładnie przetestowana, istnieje kilka krytycznych kroków, które mogą prowadzić do nieudanego eksperymentu.

O PDMS:

Do tej pracy wykorzystano GelPak, dostępny na rynku cienki arkusz PDMS. Alternatywnie arkusze PDMS mogą być odlewane bezpośrednio z PDMS mix. Zalecamy stosowanie GelPak, ponieważ jest on bardziej powtarzalny i mniej podatny na uszkodzenia w porównaniu z PDMS wykonanym na zamówienie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Dostępne są różne grubości/lepkość. Jedną z alternatyw może być przesyłanie PDMS  siebie.
Smar silikonowy	GE Bayer Silikony	Baysilone-Paste	Ten jest biokompatybilny
Urządzenie do rozciągania	GREM m mé	canique Nosze 2011
EDC (chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodiimide)	Sigma	3450	Stabilny 6 miesięcy w temperaturze -20 ° C
NHS (SÓL SODOWA N-hydroksysulfosbursztymidu)	Sigma	56485	Chronić przed wilgocią
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurych)
Syntetyczna kwarcowa fotomaska	Toppan		Weź standardową binarną fotomaskę z kwarcowej
fibronektyny z osocza bydlęcego	Sigma	F1141