Monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez kohodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie

Podsumowanie

Bakterie mogą gromadzić zarówno szkodliwe, jak i korzystne mutacje w ciągu swojego życia. W populacji komórek osobniki, które zgromadziły korzystne mutacje, mogą szybko prześcignąć swoich pobratymców. W tym miejscu przedstawiamy prostą procedurę wizualizacji konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych w czasie przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych osobników.

Streszczenie

Wiele mikroorganizmów, takich jak bakterie, rozprzestrzenia się bardzo szybko i populacje mogą osiągać wysokie zagęszczenie komórek. Małe frakcje komórek w populacji zawsze mają nagromadzone mutacje, które są albo szkodliwe, albo korzystne dla komórki. Jeśli efekt dopasowania mutacji zapewnia subpopulacji silną selektywną przewagę wzrostu, osobniki tej subpopulacji mogą szybko prześcignąć, a nawet całkowicie wyeliminować swoich bezpośrednich pobratymców. Tak więc niewielkie zmiany genetyczne i sterowana selekcją akumulacja komórek, które nabyły korzystne mutacje, mogą prowadzić do całkowitej zmiany genotypu populacji komórek. W tym miejscu przedstawiamy procedurę monitorowania szybkiej ekspansji klonalnej i eliminacji korzystnych i szkodliwych mutacji, odpowiednio, w populacji komórek bakteryjnych w czasie poprzez kohodowlę znakowanych fluorescencyjnie osobników modelu Gram-dodatniego Bacillus subtilis. Metoda jest łatwa do wykonania i bardzo obrazowa, aby pokazać wewnątrzgatunkową konkurencję między osobnikami w populacji komórek bakteryjnych.

Wprowadzenie

Bakterie glebowe są zazwyczaj wyposażone w elastyczne sieci regulacyjne i szerokie zdolności metaboliczne. Obie cechy umożliwiają komórkom dostosowanie swoich szlaków katabolicznych i anabolicznych do konkurowania z innymi mikroorganizmami i innymi mikroorganizmami o składniki odżywcze, które są dostępne w danej niszy ekologicznej¹. Jeśli jednak bakterie nie są w stanie przystosować się do środowiska, za przetrwanie gatunku mogą odpowiadać inne mechanizmy. Rzeczywiście, ponieważ wiele bakterii rozmnaża się szybko, a populacje mogą osiągać wysokie zagęszczenie komórek, subpopulacje mogą spontanicznie gromadzić korzystne mutacje, które zapewniają komórkom selektywną przewagę wzrostu, a tym samym zwiększają ich przydatność. Co więcej, ogniska mutacji i mutageneza adaptacyjna wywołana stresem mogą ułatwiać ewolucję nieprzystosowanej bakterii^2,3. Tak więc akumulacja mutacji i wzrost w wyniku ciągłej selekcji jest źródłem ogromnej różnorodności mikrobiologicznej, nawet w obrębie tego samego rodzaju^4,5. Podobnie jak w naturze, kształtowanie genomów bakteryjnych zachodzi również w laboratorium ze względu na ciągłą hodowlę w ramach selekcji. Przykładem tego jest udomowienie bakterii Gram-dodatniej B. subtilis, która jest stosowana na całym świecie w badaniach podstawowych i w przemyśle. W latach czterdziestych XX wieku B. subtilis poddano działaniu niszczących DNA promieni rentgenowskich, a następnie wyhodowano w określonych warunkach wzrostu⁶. Mutacje, które nagromadziły się w bakteriach podczas ich udomowienia, odpowiadają za utratę wielu cech wzrostu, tj. szczep laboratoryjny B. subtilis 168 utracił zdolność do tworzenia złożonych kolonii^7,8.

Obecnie, dla najlepiej zbadanych bakterii modelowych Escherichia coli i B. subtilis, dostępnych jest wiele potężnych narzędzi do genetycznego manipulowania ich genomami w celu rozwiązania konkretnych pytań naukowych. Czasami inaktywacja interesującego genu powoduje poważną wadę wzrostu, która jest wtedy wyraźnie widoczna na standardowej pożywce^{wzrostowej 9}. Natomiast mutacje, które powodują słaby defekt wzrostu, a tym samym tylko nieznacznie wpływają na przydatność szczepu, są często ignorowane. Jednak w obu przypadkach przedłużona inkubacja i pasażowanie zmutowanych szczepów przez kilka pokoleń zwykle prowadzi do akumulacji mutantów supresorowych, które przywróciły fenotyp szczepu rodzicielskiego^2,9. Charakterystyka mutantów supresorowych i identyfikacja mutacji, które przywróciły wadę wzrostu rodzicielskiego zmutowanego szczepu, jest bardzo pomocnym podejściem, które pozwala na wyjaśnienie ważnych i często nowych procesów komórkowych^10,11.

Jesteśmy zainteresowani kontrolą homeostazy glutaminianu u B. subtilis¹². Podobnie jak E. coli, B. subtilis reaguje na zaburzenie homeostazy glutaminianu (tj. blokuje degradację glutaminianu²) przez akumulację mutantów supresorowych. Wykazano, że zmiany genomowe w tych mutantach supresorowych, które zostały nabyte w wyniku spontanicznej mutacji, szybko przywracają homeostazę glutaminianu^9,13. Dlatego nie jest zaskakujące, że adaptacja B. subtilis do określonych warunków wzrostu podczas udomowienia bakterii znajduje odzwierciedlenie w syntezie enzymów i w wyewoluowanych aktywnościach enzymatycznych, które są zaangażowane w metabolizm glutaminianu¹². Zasugerowano, że brak egzogennego glutaminianu w pożywce wzrostowej podczas procesu udomowienia był siłą napędową powstania i utrwalenia się genu CR dehydrogenazy glutaminianu (GDH) w szczepie laboratoryjnym 168^2,14. Hipoteza ta jest poparta naszą obserwacją, że zmniejszona ilość aktywności GDH w szczepie laboratoryjnym zapewnia bakteriom selektywną przewagę wzrostu, gdy egzogenny glutaminian jest rzadki². Co więcej, hodowla szczepu B. subtilis, syntetyzującego GDH GudB, przy braku egzogennego glutaminianu powoduje akumulację mutantów supresorowych, które inaktywowały gen gudB ². Oczywiście obecność katabolicznie aktywnego GDH jest niekorzystna dla komórki, ponieważ endogennie wytwarzany glutaminian, który w przeciwnym razie mógłby być wykorzystany do anabolizmu, jest degradowany do amonu i 2-oksoglutaranu (ryc. 1). W przeciwieństwie do tego, gdy glutaminian jest dostarczany przez pożywkę, szczep B. subtilis wyposażony w wysoki poziom aktywności GDH ma selektywną przewagę wzrostu nad szczepem, który syntetyzuje tylko jeden funkcjonalny GDH. Rozsądne jest założenie, że wysoki poziom aktywności GDH pozwala bakteriom na wykorzystanie glutaminianu jako drugiego źródła węgla oprócz innych źródeł węgla dostarczanych przez pożywkę² (patrz rysunek 1). Tak więc aktywność GDH silnie wpływa na kondycję bakterii, w zależności od dostępności egzogennego glutaminianu.

Tutaj prezentujemy bardzo obrazową metodę monitorowania i wizualizacji wewnątrzgatunkowej konkurencji między dwoma szczepami B. subtilis, które różnią się pojedynczym locus na chromosomie (Rysunek 2). Dwa szczepy zostały oznaczone genami yfp i cfp kodującymi fluorofory YFP i CFP i były współhodowane w różnych warunkach żywieniowych. Poprzez pobieranie próbek w czasie i poprzez posiewanie odpowiednich rozcieńczeń na płytkach agarowych, osoby, które przeżyły w każdej z kultur, mogą być łatwo monitorowane za pomocą zwykłego mikroskopu stereofluorescencyjnego. Procedura opisana w tym artykule jest łatwa do wykonania i odpowiednia do wizualizacji szybkiej ekspansji klonalnej i eliminacji korzystnych i szkodliwych mutacji, odpowiednio, w populacji komórek w czasie.

Protokół

1. Przygotowanie płytek agarowych, pożywek hodowlanych, kriozapasów i prekultur

1. Przygotować pożywkę wzrostową i wymagane odczynniki (patrz tabela materiałów i odczynników).
2. Prążkować szczepy B. subtilis (np. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) i BP52 (rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp) wykazujące ekspresję odpowiednio jednego i dwóch aktywnych GDH)², które zostaną użyte w eksperymencie konkursowym na płytkach agarowych SP w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
3. Weź pojedyncze kolonie i zaszczep sterylne probówki hodowlane zawierające 4 ml płynnej pożywki LB. Hoduj bakterie przez noc w temperaturze 28 °C i 220 obr./min.
4. Hodować kultury przez noc w temperaturze 28 °C, aby uniknąć lizy lub zarodnikowania komórek.
5. Zmierzyć gęstość optyczną kultur przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀) za pomocą standardowego spektrofotometru.
6. Jeśli kultury osiągnęły OD₆₀₀ 2,0, zmieszać 0,75 ml kultur z 0,75 ml sterylnego 50% roztworu glicerolu w 1,5 ml probówkach reakcyjnych. Końcowa wartość OD₆₀₀ powinna wynosić 1,0, aby uzyskać kriozasoby zawierające około 10⁸ komórek/ml.
7. Przechowywać probówki w temperaturze -80 °C.
8. Wykonaj trzy prekultury każdego szczepu oznaczone genami fluoroforu kodującymi cfp i yfp. Zaszczepić prekultury (sterylne probówki hodowlane zawierające 4 ml płynnej pożywki LB) 1 μl komórek z kriozapasu o temperaturze -80 °C. Inkubować kultury przez noc w temperaturze 28 °C i 220 obr./min.

2. Współhodowla bakterii, pobieranie próbek i przechowywanie próbek

1. Świeżo przygotować 100 ml minimalnej pożywki C-Glc i CE-Glc (patrz tabela odczynników i materiałów) i przenieść 20 ml każdej pożywki do sterylnych kolb wstrząsowych o pojemności 100 ml.
2. Weź 0,1 ml kultur wstępnych, które były hodowane przez noc, rozcieńcz je 0,9 ml pożywki LB w kuwecie o pojemności 1,5 ml i oznacz OD₆₀₀.
3. Do eksperymentu konkursowego weź te prekultury różnych szczepów, które mają podobny OD₆₀₀ w zakresie 1,0-1,5.
4. Aby otrzymać mieszane populacje komórek, należy rozcieńczyć komórki prekultur, które miały odpowiedni OD₆₀₀ do OD₆₀₀ 0,05 w 20 ml minimalnej pożywki C-Glc i CE-Glc uzupełnionej w 100 ml kolbach do wytrząsania. W eksperymencie konkursowym oba szczepy należy wymieszać w stosunku 1:1.
5. Pobrać 10 ml próbek z kolb, przenieść je do plastikowych probówek o pojemności 15 ml, zebrać komórki przez odwirowanie przez 10 minut przy 4 000 x g w standardowej wirówce stołowej i odrzucić supernatant.
6. Ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml świeżej pożywki LB i przenieść komórki do sterylnego kubka reakcyjnego o pojemności 1,5 ml. Dodać 0,5 ml 50% sterylnego glicerolu, wymieszać zawiesinę przez rygorystyczne wirowanie i przechowywać próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki.
7. Inkubować komórki pozostawione w kolbach do wytrząsania przez okres do 24 godzin w temperaturze 37 °C i 220 obr./min. Kolby do wytrząsania należy przechowywać w ciemności, aby zapobiec fotobieleniu fluoroforów.
8. Kolejne próbki o objętości 0,1 ml należy pobrać po 7 godzinach i 24 godzinach wzrostu. Zmierzyć i zanotować OD₆₀₀ rozcieńczeń 1:10 (w minimalnym podłożu C-Glc lub CE-Glc) próbek.
9. Weź odpowiednią ilość komórek z każdej kultury, aby wytworzyć kriomagazyny, które mają OD₆₀₀ równe 1,0. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki.

3. Obróbka próbek, posiewanie i inkubacja do analiz ilościowych

1. Po pobraniu wszystkich próbek rozmrozić kriozapasy i rozcieńczyć komórki w 0,9% roztworze soli fizjologicznej (patrz tabela odczynników i materiałów) do ^10-3.
2. Umieścić 0,1 ml ^10-3 rozcieńczeń na pożywce SP na płytkach agarowych SP i rozprowadzić komórki za pomocą sterylnych szklanych pipet.
3. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C w ciemności, aż pojawią się pojedyncze kolonie.

4. Liczenie ocalałych za pomocą stereofonicznej mikroskopii fluorescencyjnej do analizy ilościowej

1. Podziel dolną część płytki agarowej czarnym pisakiem na cztery części, aby uzyskać lepszą orientację podczas liczenia osób, które przeżyły, pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym.
2. Umieść płytkę do góry nogami pod mikroskopem i ustaw ostrość kolonii za pomocą zimnego źródła światła.
3. Gdy kolonie są w ostrości, przełącz się na odpowiedni zestaw filtrów dla CFP, aby uwidocznić ocalałe komórki szczepu znakowanego CFP. Policz osoby, które przeżyły ten szczep, oznaczając kolonie długopisem i zanotuj liczbę.
4. Usuń etykiety z etanolem i przełącz się na zestaw filtrów YFP, aby uwidocznić ocalałe komórki szczepu znakowanego yfp. Policz ocalałych ponownie, oznaczając kolonie długopisem i zanotuj liczbę.

5. Obróbka próbek i mikroskopia do analiz półilościowych

1. Dla ilustracji, umieścić 10 μl rozcieńczenia ^10-4 (około 100 komórek) z kroku 3.1 na płytce agarowej SP (patrz rysunek 3).
2. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C w ciemności, aż pojawią się pojedyncze kolonie.
3. Umieść szalkę Petriego bez pokrywki pod mikroskopem i ustaw ostrość plamki za pomocą zimnego źródła światła.
4. Zrób zdjęcia miejsc na ilustracyjne postacie. Wybierz odpowiedni czas naświetlania do robienia zdjęć kolonii przy zimnym źródle światła.
5. Nie przesuwając płytki, zmień na zestaw filtrów CFP, wyreguluj czas naświetlania i zrób zdjęcie. Zrób to samo z zestawem filtrów YFP i zapisz zdjęcia do dalszych analiz.

6. Analiza danych

1. Korzystaj z oprogramowania takiego jak Excel do ilościowych analiz danych. Na podstawie zliczonych kolonii oblicz procent kolonii żółtych i niebieskich w stosunku do całkowitej liczby kolonii, które są ustawione na 100%.
2. Użyj obliczonych liczb, aby utworzyć skumulowany diagram słupkowy (patrz Rysunek 4 i Rysunek 5). Użyj programu do przetwarzania obrazów, takiego jak Adobe Photoshop, aby skonstruować scalone obrazy zdjęć zrobionych z różnych miejsc. Alternatywnie, do przetwarzania obrazu można użyć bezpłatnie dostępnego oprogramowania ImageJ, które można pobrać ze strony http://rsbweb.nih.gov/ij/.
3. Otwórz zdjęcia z jednego miejsca, które zostały zrobione za pomocą zestawu filtrów CFP i zestawu filtrów YFP. Zoptymalizuj kontrast i jasność, aby zredukować fluorescencję tła z nośnika.
4. Przejdź do jednego ze zdjęć i zaznacz wszystkie. Skopiuj zdjęcie i wklej je do drugiego obrazu.
5. Użyj funkcji "rozjaśnianie kolorów", aby scalić zdjęcia lub nałóż obrazy fluorescencyjne za pomocą zakładki kanały. Połączone zdjęcia kolonii z różnych pożywek i różnych punktów czasowych reprezentują wzrost różnych szczepów w płynnej kulturze.

7. Szczegółowe wskazówki: eksperyment z zamianą barwnika i wspólna uprawa szczepów izogenicznych oznaczonych cfp i yfp

Ekspresja jednego z dwóch genów kodujących fluorofory u B. subtilis może wpływać na dopasowanie, a tym samym na tempo wzrostu bakterii. Dlatego zaleca się przeprowadzenie następujących eksperymentów w celu wykluczenia, że eliminacja jednego konkurencyjnego szczepu z populacji komórek podczas hodowli jest po prostu spowodowana negatywnym wpływem fluoroforu:

1. Powtórz cały eksperyment i współhoduj odwrotnie znakowane szczepy (np. wcześniejszy szczep znakowany cfp jest teraz znakowany genem yfp i odwrotnie). Chociaż odwrotnie, uzyskane wyniki powinny być porównywalne z poprzednią obserwacją, że jeden szczep ma selektywną przewagę wzrostu nad drugim szczepem.
2. Powtórzyć całe doświadczenie i współhodować szczepy izogeniczne znakowane yfp i cfp (np. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) i BP41 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-cfp)). Oszacuj negatywny wpływ jednego z dwóch fluoroforów na przydatność bakterii, śledząc skład populacji komórek w czasie.

Wyniki

Opisana tutaj metoda została z powodzeniem zastosowana do wizualizacji wewnątrzgatunkowej konkurencji w populacji komórek składającej się ze szczepów B. subtilis, które zostały oznaczone genami cfp i yfp kodującymi odpowiednio fluorofory CFP i YFP. Jak pokazano na rysunku 3, metodę tę można wykorzystać do wizualizacji konkurencji wewnątrzgatunkowej w bardzo obrazowy sposób. Dzięki dostrzeżeniem próbek na małych obszarach, skład klonalny populacji komórek stał się widoczny na pi...

Dyskusja

Opracowano kilka metod analizy konkurencyjności bakterii¹⁶. W wielu przypadkach bakterie były znakowane różnymi kasetami oporności na antybiotyki¹⁷. Podobnie jak w przypadku naszego podejścia, znakowanie komórek za pomocą kaset oporności na antybiotyki pozwala na ocenę konkurencyjności bakterii podczas kohodowli w określonych warunkach wzrostu. Co więcej, metoda ta może być stosowana do określania dopasowania konkurencyjnego komórek, które różnią się od siebie określonym locus na chromosomie^17<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
(NH4)2SO4	Roth, Niemcy	3746
Agar	Difco, USA	214010
Cytrynian amonu żelazowego (CAF)	Sigma-Aldrich, Niemcy	9714
CaCl2	Roth, Niemcy	5239
Glucose	Applichem, Niemcy	A3617
Glycerol	Roth, Niemcy	4043
K2HPO4• 3H2O	Roth, Niemcy	6878
KCl	Applichem, Niemcy	A3582
KH2PO4	Roth, Niemcy	3904
KOH	Roth, Niemcy	6751
MgSO4• 7H2O	Roth, Niemcy	P027
MnCl2	Roth, Niemcy	T881
MnSO4• 4H2O	Merck Millipore, Niemcy	102786
NaCl	Roth, Niemcy	9265
Bulion odżywczy	Roth, Niemcy	X929
Glutaminian potasu	Applichem, Niemcy	A3712
Tryptone	Roth, Niemcy	8952
Aplikacja tryptofanu	, Niemcy	A3445
Ekstrakt drożdżowy	Roth, Niemcy	2363
1,5 ml Probówki reakcyjne	Sarstedt, Niemcy	72,690,001
2,0 ml Probówki reakcyjne	Sarstedt, Niemcy	72,691
15 ml Probówki plastikowe z nakrętką	Sarstedt, Niemcy	62,554,001
Szalki Petriego	Sarstedt, Niemcy	82.1473
1.5 ml Kuwety polistyrenowe	Sarstedt, Niemcy	67,742
15 ml Szklane probówki hodowlane	Marka, Niemcy	7790 22
100 ml Kolby do wytrząsania z aluminiowymi nakrętkami	Marka, Niemcy	928 24
Sterylne szklane pipety 10 ml	Marka, Niemcy	278 23
Inkubator (28 i 37 ° C)	New Brunswick	M1282-0012
(2-20 μ l, 10-100 μ l, 100-1,000 μ l)	Eppendorf, Niemcy	4910 000.034, 4910 000.042,
Wirówka stołowa do probówek reakcyjnych 1,5 i 2 ml	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Niemcy	75002425
Wirówka stołowa do probówek plastikowych 15 ml	Heraeus Biofuge Primo R, Niemcy	75005440
Standardowy spektrofotometr	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Niemcy	80-2112-21
Mikroskop stereofluorescencyjny	Zeiss SteREO Lumar V12, Niemcy	495008-0009-000
Zamrażarka (-20 i -80 ° C)	-
Lodówka (4 &stopnie; C)	-
Autoklaw	Zirbus, LTA 2x3x4,	Niemcy-pH-metr
	pH-metr 766, Calimatic, Knick, Niemcy	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Niemcy	3340000
Balance	CP2202S, Sartorius, Niemcy	zastąpiony
długopis (marker permanentny)	Staedler, Niemcy	317-9
Program Powerpoint		Microsoft, USA-Office
Program Excel	Microsoft, USA-Program		do przetwarzania danych
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	zastąpiony przez CS6, pobierz	Program komputerowy do przetwarzania obrazu
Komputer	PC lub	Mac-ZEN
pro 2011 oprogramowanie do mikroskopu	stereofluorescencyjnegoZeiss, Niemcy	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Uzyskany przez Zeiss
Przepisy na konkretne roztwory
SP Średni
8 g Bulion
0,25 mg MgSO4• 7H2O
1 g KCl
15 g agaru dla stałej pożywki			w razie potrzeby
dodać 1 l z autoklawem H2O			przez 20 minut w temperaturze 121 stopni; C
1 ml CaCl2 (0,5 M), sterylizowany przez filtrację
1 ml MnCl2 (10 mM), sterylizowany przez filtrację
2 ml cytrynianu amonu żelazowego (CAF, 2,2 mg/ml), sterylizowany przez filtrację
LB Medium
10 g Trypton
5 g ekstraktu
10 g NaCl
15 g agaru dla stałego podłoża			w razie potrzeby
dodać 1 l z autoklawem H2O			przez 20 minut w temperaturze 121 stopni; C
C-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x sole
10 ml L-tryptofanu (5 mg/ml), sterylizowane przez filtrację
10 ml cytrynianu amonowo-żelazowego (CAF, 2,2 mg/ml), sterylizowane przez filtrację
10 ml soli
25 ml Glukoza (20%)			Autoklawowane przez 20 min w temperaturze 121 stopni; C
dodać 1 L ze sterylnym H2O
CE-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x sole
10 ml L-tryptofanu (5 mg/ml), sterylizowane przez filtrację
10 ml cytrynianu amonowo-żelazowego (CAF, 2,2 mg/ml), sterylizowane przez filtrację
10 ml III’
20 ml glutaminianu (40%)
25 ml glukozy (20%), autoklawowane przez 20 min w temperaturze 121 stopni; C
dodać 1 L z jałowymi solami H2O
5 x C sole
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4• 3H2O
16,5 g (NH4)2SO4
1 l w sterylnym autoklawie H2O			przez 20 min w temperaturze 121 stopni; Sole
			III'
0,232 g MnSO4• 4H2O
12,3 g MgSO4• 7H2O
dodać 1 l sterylnym H2O, autoklaw przez 20 min w temperaturze 121 ° C
40% roztwór glutaminianu
200 g kwasu
dostosować pH do 7,0 dodając około 80 g KOH
dodać 0,5 l w sterylnym autoklawie H2O			przez 20 min w temperaturze 121 stopni; C
0,9% roztwór soli fizjologicznej (NaCl)
dodać 1 l w sterylnym autoklawie H2O			przez 20 min w temperaturze 121 stopni; C
50% Roztwór
295 ml Glicerol (87%)dodać
0,5 l w sterylnym autoklawie H2O			przez 20 min w temperaturze 121 stopni; C
Bakterie (Wszystkie szczepy są oparte na Bacillus subtilis szczep 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-yfp)	Laboratoryjne zbieranie
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-yfp)