Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

13.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51201

⸱

10 marca 2014

 ,  , 
1Research Group Phagosome Biology, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Division of Mycobacterial Research, National Institute for Medical Research

W tym artykule

Streszczenie

Komórki fagocytarne odgrywają główną rolę we wrodzonym układzie odpornościowym, usuwając i eliminując atakujące mikroorganizmy w swoich fagosomach. Dojrzewanie fagosomu to złożony i ściśle regulowany proces, podczas którego powstający fagosom przechodzi drastyczną transformację poprzez dobrze zaaranżowane interakcje z różnymi organellami komórkowymi i przedziałami w cytoplazmie. Proces ten, który jest niezbędny dla fizjologicznej funkcji komórek fagocytarnych poprzez nadanie fagosomom właściwości litycznych i bakteriobójczych, kończy się fuzją fagosomów z lizosomami i biogenezą fagolizosomów, która jest uważana za ostatni i krytyczny etap dojrzewania fagosomów. W niniejszym raporcie opisujemy opartą na obrazowaniu żywych komórek metodę jakościowej i ilościowej analizy dynamicznego procesu dostarczania zawartości lizosomów do fagosomów, co jest cechą charakterystyczną biogenezy fagolizosomów. Podejście to wykorzystuje mikrogranulki pokryte IgG jako model fagocytozy i cząsteczki dekstranu sprzężone z fluoroforem jako luminalną sondę ładunkową lizosomalną, w celu śledzenia dynamicznego dostarczania zawartości lizosmalnej do fagosomów w czasie rzeczywistym w żywych makrofagach przy użyciu obrazowania poklatkowego i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. W tym miejscu szczegółowo opisujemy tło, etapy przygotowania i konfigurację eksperymentalną krok po kroku, aby umożliwić łatwe i precyzyjne wdrożenie tej metody w innych laboratoriach. Opisana przez nas metoda jest prosta, solidna, a co najważniejsze, można ją łatwo dostosować do badania interakcji fagosomalnych i dojrzewania w różnych systemach i w różnych warunkach eksperymentalnych, takich jak użycie różnych typów komórek fagocytarnych, eksperymenty z utratą funkcji, różne sondy i cząstki fagocytarne.

Wprowadzenie

Profesjonalne fagocyty, w tym makrofagi, odgrywają kluczową rolę w układzie odpornościowym. Oprócz tego, że są pierwszą linią obrony we wrodzonym układzie odpornościowym, odgrywają również kluczową rolę w aktywacji odporności adaptacyjnej poprzez swoją sygnalizację i rolę prezentującą antygen1-3. Podczas gdy funkcja profesjonalnych fagocytów jest wieloaspektowa, dojrzewanie fagosomów jest krytycznym szkieletem funkcji bakteriobójczej i przetwarzania antygenów przez profesjonalne fagocyty4,5. Po wchłonięciu i wychwycie za pośrednictwem receptora celu fagocytarnego, takiego jak bakterie, powstający fagosom przechodzi przez złożoną i dobrze zaaranżowaną sekwencję interakcji i wymiany z przedziałami sieci endocytarnej i kilkoma innymi organellami komórkowymi6. Charakter związków wymienianych z tymi jednostkami komórkowymi, a także regulacja i czas zdarzeń fuzji determinuje środowisko fagosomalne światła i skład błony fagosomalnej, a tym samym7, los dojrzewającego fagosomu8.

Fizjologiczne znaczenie dojrzewania fagosomu jest zilustrowane przez różnorodne strategie stosowane przez różne patogeny wewnątrzkomórkowe do ucieczki, zatrzymania lub zakłócenia dojrzewania fagosomu9. Większość z tych strategii bezpośrednio lub pośrednio zapobiega końcowemu i krytycznemu etapowi procesu dojrzewania fagosomu: fuzji fagosomu z późnymi przedziałami endosomalnymi / lizosomalnymi, co wyposaża je w większość enzymów hydrolitycznych i czynników przeciwbakteryjnych dojrzałego fagosomu7,8,10. Analiza tego ostatniego i krytycznego kroku może zatem dostarczyć nam silnych wskaźników dotyczących stanu dojrzewania fagosomów i tego, czy naturalny stan fizjologiczny ulega pozytywnemu czy negatywnemu wpływowi w określonych warunkach eksperymentalnych, które są wykorzystywane.

Późne przedziały endosomalne/lizosomalne są ogólnie uważane za końcowe przedziały szlaku endocytarnego, zdefiniowane i odróżnione od wczesnych przedziałów endocytarnych przez obecność różnych, specyficznych dla stadium cząsteczek markerowych. Na przykład enzymy hydrolityczne lub składniki błonowe, takie jak między innymi białka błonowe związane z lizosomami (LAMP)11. Końcowe przedziały endocytarne - odtąd nazywane po prostu lizosomami - służą również jako główne miejsce dla końcowych etapów trawienia na końcu szlaku fagocytarnego / endocytarnego12. W ten sposób niestrawne sondy mogą być ładowane przez endocytozę i makropinocytozę ze środowiska zewnątrzkomórkowego i transportowane szlakiem endocytarnym do lizosomów, gdzie gromadzą13,14 po wykonaniu określonego cyklu wychwytu i pościgu. Sondy sprzężone z fluoroforem do mikroskopii fluorescencyjnej, takie jak organiczny niestrawny polimer dekstran, są powszechnie stosowane jako sondy endocytarne15-17.

W tej metodzie, opisujemy wykorzystanie mikrokulek pokrytych IgG jako ładunku fagocytarnego do badania dojrzewania fagosomu poprzez analizę dostarczania lizosomalnej zawartości światła do fagosomów. Używając sondy dekstranu sprzężonego z fluoroforem jako łatwo wykrywalnego markera lizosomów w żywych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM) i obrazowania wideo poklatkowego za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego laserowego, śledzimy dynamiczny proces dostarczania ładunku do fagosomów z wysoką rozdzielczością czasową. Następnie opisujemy, w jaki sposób zebrane dane z obrazowania poklatkowego mogą być oceniane za pomocą otwartego i ogólnodostępnego oprogramowania do analizy obrazu, Fiji (lub ImageJ), analizowane statystycznie za pomocą programu Microsoft Excel i prezentowane za pomocą oprogramowania GraphPad Prism14,18.

Zgodnie z opisem naszej metody, analogiczne eksperymenty mogą być zaprojektowane przy użyciu zmodyfikowanych ustawień i czynników w celu zbadania ich wpływu na dojrzewanie fagosomów; praktycznie każdy inny typ przylegających pierwotnych lub linii komórkowych komórek fagocytarnych, eksperymenty genetycznej utraty funkcji, w tym nokaut i knock-down, mutanty lub ekspresja białek fuzyjnych, cele fagocytarne, związki powlekające mikrogranulki, sondy endosomalne/lizosomalne i czynniki takie jak cytokiny, inhibitory chemiczne, czyli między innymi siRNA, to zmienne, które można zastosować do podstawowego podejścia tej metody.

Definiujemy cel i podstawowe wymagania tej metody w następujący sposób:

  • Cel metody: umożliwienie bezpośredniej, ilościowej i jakościowej obserwacji i analizy dojrzewania fagosomów z wysoką rozdzielczością czasową w żywych komórkach fagocytarnych.
  • Ładunek fagocytarny: Odpowiednio pokryta mikrocząstka lub cel biologiczny. Tutaj używamy sferycznych mikrocząstek polistyrenu o grubości 3 μm pokrytych IgG, które są łatwo internalizowane przez fagocytozę za pośrednictwem receptora Fc-γ. Alternatywnie można użyć dowolnego mikroorganizmu lub mikrocząstki powlekanej, dla której receptor fagocytarny jest obecny na komórkach.
  • Komórki fagocytarne: Przylegające komórki fagocytarne wyrażające odpowiednie receptory fagocytarne. Tutaj używamy mysich pierwotnych BMM, które obficie eksprymują receptory Fc-γ. Alternatywnie można zastosować komórki dendrytyczne (DC), monocyty lub komórki nabłonka fagocytarnego lub ich mutanty genetyczne lub warianty knock-out.
  • Ładunek lizosomalny: Fluorescencyjnie znakowana sonda lizosomalna. Tutaj teksański dekstran o mocy 70 000 kilodaltonów (Dex70kD) jest używany jako ładunek świetlny lizosomów. Alternatywnie, dowolny wykrywalny fluorescencyjnie marker przedziału komórkowego lub organelli lub odpowiednia sonda właściwości fagosomalnych, takich jak kwasowość lub zdolność degradacji, może być wykorzystana do badania postępu dojrzewania fagosomu.
  • Czynniki wpływające: Na przykład cząsteczki sygnałowe, związki chemiczne, knock-down genów lub przejściowa ekspresja zmutowanych białek mogą. W tym miejscu zrezygnowaliśmy z użycia takiego czynnika ze względu na prostotę, ale niedawny przykład z ekspresją zmutowanych białek i czynnikami wpływającymi na knock-down można znaleźć w Kasmapour et al. 18 Każdy czynnik, który może wpływać na fagocytozę lub okoliczności i ruchliwość fagosomów i/lub przedziałów, które oddziałują z dojrzewającymi fagosomami, może być potencjalnie wykorzystany.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opieka nad zwierzętami i wszystkie procedury w tym protokole są zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi.

Przygotuj wcześniej przygotowania, które są oznaczone symbolem "Π-".

1. Przygotowanie BMM

  1. Wykonaj ubój myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Usuń kości udowe i piszczelowe, uwolnij kości z tkanek i przytnij oba końce, aby zapewnić dostęp do szpiku kostnego.
  3. Trzymaj kości w lodowatym PBS lub lodowatym podłożu DMEM (uzupełnionym 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, na lodzie do następnego kroku.
    Uwaga: Wykonaj następujące kroki w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.
  4. Przepłukać jamę szpikową zimnym PBS + penicyliną/streptomycyną za pomocą igły 26 G (0,45 mm) dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.
  5. Komórki osadu przez delikatne odwirowanie przy 350 x g przez 10 minut, ponownie zawiesić osad w pożywce BMM i płytce na sterylnych mikrobiologicznych niepowlekanych szalkach Petriego.
    1. Przygotowanie podłoża BMM
      • Zmodyfikowane Orły Dulbecco Średni DMEM
      • 10% inaktywowany SKO
      • 20% supernatant hodowli linii komórkowej mysich fibroblastów L929 (źródło czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów, M-CSF)
      • 5% surowicy końskiej
      • 2 mM glutaminy
    2. Przygotowanie pożywki do hodowli linii komórkowych L929;
      • RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 średni
      • 10% inaktywowany SKO
      • 2 mM glutaminy
    3. Przygotowanie supernatantu hodowli linii komórkowej fibroblastów myszy L929;
      • Zlewające się komórki L929 podzielono w stosunku 1:4, hodowano w kolbach o długości 175 cm2 przez 2 dni przy użyciu 20 ml pożywki L929, a po 48 godzinach zebrano supernatant hodowlany, przefiltrowano i dodano do pożywki BMM
  6. Inkubować komórki wypłukane z kości udowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2
    7. .
  7. Po każdych 48 godzinach (maksymalnie 72 godzinach) inkubacji należy odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką BMM na okres do 10 dni. Ponad 95% komórek było dodatnich na obecność CD14, co zostało przetestowane za pomocą cytometrii przepływowej. CD14 jest receptorem rozpoznawania wzorców, wyrażanym głównie przez makrofagi. Określając odsetek komórek dodatnich dla tego receptora, wygenerowano czystą kulturę przylegających BMM.

Uwaga: przygotuj i hoduj komórki odpowiednio, jeśli używane są inne typy komórek.

2. Powlekanie mikrogranulek jako ładunku fagocytarnego

  1. Do przygotowania 1 ml zawiesiny perełkowej należy użyć 400 μl 2,5% 3 μm karboksylowanych mikrocząstek polistyrenu lub alternatywnych mikrocząstek.
  2. Przenieść zawiesinę kulek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, przemyć 3x PBS i dodać 100 μl 500 mM soli sodowej kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego, buforu MES o pH 6,7 do granulki kulki.
  3. Rozpuścić 50 μg mysiej IgG (przeciwciało poliklonalne IgG) w 50 μl sterylnego ddH2O i dodać do zawiesiny kulek.
  4. Napełnić zawiesinę do 1 ml jałowym ddH2O (450 μl).
  5. Inkubować roztwór przez 15 minut na obracającym się kole w temperaturze pokojowej.
  6. Przygotować środek sieciujący EDAC, chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimidu w stężeniu 10 mg/ml i dodać 14 μl do zawiesiny kulek.
    Uwaga: EDAC sieciuje grupy aminowe IgG z grupami karboksylowymi na powierzchni kulek i ułatwia unieruchomienie IgG na powierzchni kulki. Ma to kluczowe znaczenie dla wchłaniania perełek i dlatego roztwór powinien być przygotowany na świeżo.
  7. Inkubować zawieszenie na obracającym się kole przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Dodać 14 μl środka sieciującego EDAC i inkubować zawiesinę na obracającym się kole przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  9. Odwirować zawiesinę o stężeniu 10 000 x g przez 2 minuty w mikrowirówce.
  10. Przemyć kulki 3x w buforze zatrzymującym (1% Triton-X 100 w 10 mM Tris, pH 9,4) w celu zatrzymania reakcji sieciowania, poprzez ponowne zawieszenie osadu w buforze zatrzymującym i wirowanie roztworu o sile 10 000 x g przez 2 min.
  11. Umyj kulki 3x w PBS i ponownie zawieś granulat w 1 ml PBS.
    Opcjonalnie: Przygotować robocze porcje 30-50 μl.
  12. Zawiesinę ze stopkami pokrytymi IgG należy przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 4 tygodnie i nigdy nie dopuszczać do zamrożenia zawiesiny.

Uwaga: Do zawiesiny można dodać środek konserwujący, taki jak azydek sodu o końcowym stężeniu 0,02% (w/v), aby zapobiec rozwojowi bakterii i skażeniu. W takim przypadku należy przeprowadzić mycie kulek przed ich użyciem, aby uniknąć cytotoksycznego działania środka konserwującego. Odwirować porcję zawiesiny o sile 10 000 x g przez 2 minuty i umyć kulki poprzez ponowne zawieszenie osadu w PBS. Powtórz pranie 3x.

3. Przygotowanie roztworu podstawowego sondy Dekstranu

  1. Rozpuść Texas Red 70 000 kilodaltonów Dekstran (Dex70kD) w PBS w stężeniu 20 mg/ml i przechowuj w temperaturze -20 °C, zgodnie z instrukcjami producenta.
    Uwaga: Utrzymuj zapasy w temperaturze -20 °C przez okres do kilku miesięcy lub w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni, zapoznaj się z dokumentacją producenta.
  2. Przygotować roztwór dekstranu do eksperymentu z podstawowego roztworu, rozcieńczając go w kompletnej pożywce do hodowli komórkowych DMEM (DMEM, 10% FCS, 2 mM L-glutamina) o stężeniu około 1 mg/ml (kilkakrotnie stężony roztwór, który zostanie rozcieńczony do końcowego stężenia roboczego 20 μg/ml przed dodaniem do komórek).
  3. Użyj ultradźwiękowej łaźni wodnej do sonikacji podwielokrotności dekstranu przez 5 minut, aby homogenizować roztwór i rozpuścić agregaty, które mogą później prowadzić do powstania artefaktów podczas obrazowania.
  4. Wirować z maksymalną prędkością g przez 5 minut w mikrowirówce, aby usunąć wszelkie nierozpuszczone grudki lub zanieczyszczenia z roztworu.
  5. Ostrożnie przenieść supernatant do świeżej probówki, unikając osadu na dnie probówki i rozcieńczyć roztwór do końcowego stężenia roboczego 20 μg/ml w kompletnej pożywce do hodowli komórkowych DMEM.
  6. Przefiltruj roztwór za pomocą filtra zamontowanego w strzykawce 0,2 μm.

4. Wstępne ładowanie dekstranu

  1. Komórki nasienne w naczyniu ze szklanym dnem do obrazowania żywych komórek i inkubować przez co najmniej 12 godzin (w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2) w celu zapewnienia przyłączenia i aklimatyzacji.
    Uwaga: Dostępne są segmentowe naczynia ze szklanym dnem, które umożliwiają przeprowadzanie wielu eksperymentów (do czterech przegródek) na naczynie.
  2. Przygotować dekstran w roztworze DMEM zgodnie z opisem w protokole 3. Podgrzać przygotowany dekstran w roztworze DMEM, używając łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Ostrożnie odessać pożywkę i dodać roztwór dekstranu do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 2-8 godzin w celu wchłonięcia.
    Uwaga: Zaplanuj i zoptymalizuj protokół w oparciu o używaną sondę i typ komórki i ściśle przestrzegaj tego czasu podczas powtarzania eksperymentów. Ma to zasadnicze znaczenie dla profilu akumulacji dekstranu w szlaku endocytarnym, a tym samym dla powtarzalności eksperymentów.
  4. Umyj komórki 3x wstępnie podgrzaną, kompletną pożywką DMEM; odessać pożywkę i ostrożnie spłukać komórki świeżą pożywką.
  5. Inkubować komórki z kompletną pożywką DMEM przez 4-12 godzin w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2
    6. .
  6. Umyj komórki raz podgrzanym, kompletnym, przefiltrowanym, wolnym od czerwieni fenolowej pożywką DMEM.
  7. Aby uzyskać optymalne wyniki obrazowania, należy zmienić na wstępnie podgrzaną, całkowicie przefiltrowaną, wolną od czerwieni fenolowej pożywkę DMEM co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem obrazowania. Czerwień fenolowa może powodować wygaszanie sygnałów fluorescencyjnych, zwiększanie szumów tła, a tym samym zmniejszanie kontrastu i klarowności obrazu.

Uwaga: Ustaw wcześniej mikroskop i ustawienia obrazowania, zgodnie z wcześniej zaplanowanym i zoptymalizowanym protokołem opartym na typie sondy i komórek, które są używane.

5. Dodawanie koralików pokrytych IgG

  1. Zrównoważyć podwielokrotność wstępnie przygotowanej 1% zawiesiny kulek z RT i poddać sonikacji w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 2-3 minuty.
  2. Dodać 1-6 μl 1% zawiesiny kulek do kompletnego, przefiltrowanego, wolnego od czerwieni fenolowej pożywki DMEM pod komorą bezpieczeństwa biologicznego klasy II, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia (dobre stężenie początkowe to 1 μl/2 cmpowierzchni naczynia).
    Uwaga: W tym przypadku BMM wysiewano w ilości 25 000 komórek/dołek, a do podłoża w naczyniu dodano 6 μl 1% zawiesiny kulek zapasowych. Odpowiada to w przybliżeniu stosunkowi kulek do komórki wynoszącemu 15:1. Stosunek ten należy dostosować do rodzaju używanych komórek i do materiału ściegu; tj. kulki lateksowe mają niską gęstość i nie opadają szybko na dno, podczas gdy kulki polistyrenowe toną i stykają się z przylegającymi komórkami znacznie szybciej, a tym samym w większych ilościach.
    Uwaga: W zależności od eksperymentu korzystne może być wcześniejsze wybranie regionu, który będzie obserwowany. Zawiesina perełek może być następnie dodana tylko do tego konkretnego obszaru naczynia ze szklanym dnem, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo zaobserwowania korzystnych zdarzeń wchłaniania.
  3. Gęstą chmurę kulek można rozproszyć, delikatnie pipetując zawiesinę w naczyniu ze szklanym dnem.
  4. Poczekaj, aż kulki opadną na dno naczynia ze szklanym dnem i znajdą się mniej więcej w tej samej płaszczyźnie co przylegające komórki fagocytarne.
  5. Skoncentruj się na obszarze zainteresowania (ROI) i rozpocznij obrazowanie poklatkowe.

Uwaga: Może być konieczne precyzyjne dostrojenie ostrości podczas obrazowania, w zależności od używanego systemu obrazowania, jego stabilności i ruchliwości obserwowanych komórek. Należy jednak pamiętać, że może to uniemożliwić prawidłową analizę fagosomów, które w wyniku ponownego skupienia mocno odbiegają od płaszczyzny ostrości.

6. Obrazowanie

Postępuj zgodnie z poniższymi ogólnymi wskazówkami, aby uzyskać optymalną jakość obrazowania;

  1. Użyj systemu obrazowania konfokalnego, takiego jak skaning laserowy lub system wirującego dysku.
    Uwaga: Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Leica TCS SP5 AOBS sterowany przez oprogramowanie Leica LAS AF i wyposażony w komorę kontroli środowiska został tutaj użyty do obrazowania filmów poklatkowych.
  2. Zoptymalizuj ustawienia obrazowania, takie jak prędkość skanowania, powiększenie, rozdzielczość itp., w taki sposób, aby umożliwić szybkość klatki co 7-20 sekund, w zależności od używanego systemu.
    Uwaga: W tym przypadku prędkość skanowania 200 Hz, 2-krotny zoom skanera i uśrednianie linii 2-3x przy rozdzielczości 512 x 512 pikseli dały czas nagrywania między 3-5 sekund/ramę. Szybkość klatki na 10 sekund była używana do nagrywania filmów poklatkowych o czasie trwania co najmniej 120 minut.
  3. Stosować odpowiednie ustawienia wzbudzenia/emisji w oparciu o używany system obrazowania i sondę(y).
    1. Zoptymalizuj ustawienia, aby zapobiec nadmiernemu wybielaniu fotograficznemu.
      Uwaga: W tym przypadku Texas Red Dextran 70 kD został wzbudzony za pomocą lasera DPSS (561 nm), a światło emisyjne zostało wykryte przez hybrydowy detektor Leica (HyD) przy 600-650 nm ze szczytem emisji przy 610 nm. Natężenie lasera musi być dostosowane do intensywności sygnału i utrzymywane na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować fotowybielanie fluoroforu (fluoroforów) i fototoksyczny wpływ światła laserowego na komórki. Ogólnie rzecz biorąc, ważne jest, aby zrównoważyć prędkość skanowania, uśrednianie linii, rozdzielczość skanowania, interwał klatek i czas trwania obrazowania, aby uzyskać odpowiednią i stabilną intensywność sygnału oraz uchwycić pełny czas trwania procesu wychwytu kulek i dojrzewania fagosomu.
  4. Dołącz kanał jasnego pola (BF) do obserwacji koralików, jeśli nie są one sprzężone z fluoroforem.
    Uwaga: Oprócz kanału Texas Red, kanał BF został użyty do wizualizacji koralików, ten sam laser DPSS został użyty jako źródło światła, a sygnał został wykryty za pomocą detektora powielacza zdjęć (PMT).
    Uwaga: Upewnij się, że stosujesz identyczne ustawienia nagrywania podczas pobierania danych, które mają zostać zestawione. Najważniejszymi parametrami są: intensywność wzbudzenia lasera, ustawienie detektora, ustawienia akwizycji, powiększenie i odstępy między klatkami. Niestosowanie identycznych interwałów między klatkami będzie wymagało etapu uśredniania krzywych, ponieważ punkty danych obserwacji nie będą się nakładać (np. w celu zestawienia obserwacji z ramkami uzyskanymi co 7 sekund z innym zestawem z ramkami co 12 sekund). Zwiększyłoby to liczbę kroków wymaganych do oceny danych i wymagałoby dodatkowego oprogramowania z funkcją uśredniania krzywych, takiego jak oprogramowanie statystyczne Origin Pro firmy OriginLab (http://www.originlab.com/).
  5. Najlepiej zapisać film poklatkowy w natywnym formacie pliku używanego systemu obrazowania i unikać eksportowania w formatach skompresowanych.

Uwaga: Tutaj filmy poklatkowe zostały zapisane w natywnym formacie Leica LAS AF (. LIF), które następnie zostały bezpośrednio zaimportowane w celu otwarcia na Fidżi. Fiji jest w stanie odczytać natywne formaty plików od większości producentów mikroskopów za pomocą dołączonej wtyczki importera formatów biologicznych. Eksportowanie pliku filmu poklatkowego w serii obrazów w formacie JPG lub TIFF lub jako pliku wideo w formacie kontenera AVI nie jest konieczne ani zalecane. Oprócz zachowania najlepszej możliwej jakości obrazu z oryginalnej obserwacji poprzez unikanie algorytmów kompresji stratnej (e.g. JPEG), użycie natywnego formatu pliku mikroskopu gwarantuje, że metadane pliku (znaczniki czasu, powiększenie, intensywność lasera i akwizycji, ustawienia detektora itp.) zostaną zachowane i dostępne dla Fidżi. Jeśli jednak z jakiegokolwiek powodu pliki wideo poklatkowe muszą zostać wyeksportowane w innym formacie do analizy, upewnij się, że już na tym etapie używasz nieskompresowanych formatów plików, takich jak serie obrazów TIFF i oddzielne kanały kolorów RGB (czerwony, zielony, niebieski), ponieważ Fidżi często nie może skutecznie oddzielić kanału BF od innych kanałów kolorów w eksportowanych plikach. Należy również pamiętać o zachowaniu oryginalnych plików mikroskopu jako odniesienia.

7. Analiza filmów poklatkowych

  1. Użyj ImageJ, Fiji lub dowolnego innego oprogramowania, które zapewnia możliwość analizy asocjacji sygnałów analogowych.
    Uwaga: W tym przypadku Fidżi zostało wykorzystane do analizy filmów poklatkowych. Fiji to dystrybucja ImageJ zawierająca pakiet do przetwarzania obrazów ze zreorganizowanymi menu narzędzi i dodatkowymi natywnymi wtyczkami, dostępna do bezpłatnego pobrania pod adresem http://fiji.sc. Proces opisany w tej sekcji przedstawiono na rysunku 2.
  2. Otwórz plik na Fidżi, klikając "Plik", "Otwórz" i wybierając plik lub przeciągając i upuszczając plik na Fidżi.
  3. Wybierz następujące opcje;
    1. Przeglądanie stosu: Wyświetlanie stosu za pomocą Hyperstack,
    2. Opcje kolorów: Tryb koloru Kolorowy,
    3. Podziel kanały na osobne okna: Podziel kanały (dla każdego zarejestrowanego kanału koloru RGB zostanie otwarte osobne okno).
  4. W przypadku, gdy ma być użyta seria obrazów, załaduj serię na Fidżi, przechodząc do "Plik", "Importuj", "Sekwencja obrazów" i wybierz dowolny plik obrazu w folderze zawierającym docelową serię obrazów.
    1. Ustaw filtry i warunki wczytywania wybranych obrazów w serii, na przykład;
      1. Liczba obrazów: ile ramek ma zostać załadowanych.
      2. Obraz początkowy: który obraz jest klatką początkową w serii.
      3. Przyrost: przyrost między klatkami do załadowania (co klatka, co druga klatka itd.).
      4. Nazwa pliku zawiera: filtrowanie dla określonego kanału za pomocą nazwy pliku (na przykład poprzez ustawienie "c001", co zwykle oznacza obrazy z "kanału 1" po separacji kolorów wielokanałowego filmu poklatkowego).
  5. Usuń skalowanie, przechodząc do "Analizuj", "Ustaw skalę...", zaznaczając pole "Globalne" i klikając "Kliknij, aby usunąć skalę".
    Uwaga: Ten krok umożliwia analizę obrazów na podstawie pikseli w przypadku, gdy dla różnych zestawów eksperymentalnych, które mają być oceniane, zastosowano różne powiększenia. Jeśli ustawienia powiększenia zawsze były stałe, a natywny plik mikroskopu został bezpośrednio zaimportowany na Fidżi, ten krok można pominąć, ponieważ Fidżi może zrozumieć i wykorzystać dane dotyczące powiększenia i skali z metadanych pliku mikroskopu.
  6. Ustaw parametry pomiaru, przechodząc do "Analizuj", "Ustaw pomiary" i zaznaczając następujące pola: "Obszar", "Odchylenie standardowe", "Gęstość zintegrowana", "Etykieta wyświetlacza" i "Średnia wartość szarości".
  7. Przekieruj do kanału koloru, który zawiera sygnał z sondy, która ma być mierzona i potwierdź przyciskiem "OK".
  8. Przejdź do ramki, w której mają zostać rozpoczęte pomiary i wybierz okno kanału BF klikając w górną krawędź okna.
  9. Użyj "narzędzia do zaznaczania owalu", aby wybrać obszar zainteresowania (ROI), tj. okrągły zwrot z inwestycji na zinternalizowanym koraliku. Upewnij się, że zaznaczenie jest ściśle dopasowane do zewnętrznej krawędzi ściegu, jak widać w kanale BF.
    Uwaga: Podczas korzystania z komputera przytrzymaj Shift podczas korzystania z narzędzia do zaznaczania, aby zapewnić okrągły zwrot z inwestycji.
  10. Rozpocznij pomiar optymalnie na kilka klatek przed zakończeniem pełnego pochłonięcia kulki i zwróć uwagę na ramkę, w której tworzy się w pełni uformowany powstający fasom-koralik, a miseczka fagocytarna jest zamknięta. Powinno to być stosunkowo wyraźnie dostrzegalne w kanale BF.
  11. Przejdź do "Analizuj" i kliknij "Zmierz", aby wykonać pomiar; wynik zostanie wyświetlony w osobnym oknie zatytułowanym "Wyniki".
  12. Przejdź do następnej ramki, dostosuj położenie ROI w przypadku, gdy koralik się przesunął, i powtórz pomiar. Wynik zostanie dodany do listy w oknie wyników; każdą analizowaną klatkę można zidentyfikować na podstawie wartości w kolumnie "Etykieta".
    Uwaga: Użycie skrótów (np. "M" dla miary) może znacznie przyspieszyć proces oceny; zobacz listę skrótów i przypisz te kostiumowe w menu "Wtyczki".
  13. Po zakończeniu pomiaru wszystkich odpowiednich ramek, wyniki można skopiować do aplikacji arkusza kalkulacyjnego, takiej jak MS Excel. Kolumna "IntDen" przedstawia natężenia wybranego obszaru w kanale, do którego został przekierowany pomiar.

8. Korekta wybielania

W zależności od użytej sondy i ustawień obrazowania, może wystąpić fotowybielanie. W zależności od jej zakresu może to mieć duży wpływ na wynik oceny. Efekt ten można jednak częściowo skorygować, stosując równą, ale przeciwną szybkość zmian do mierzonych wartości. Jeśli występuje, współczynnik fotowybielania można obliczyć, mierząc zależny od czasu spadek intensywności sygnału w całej klatce lub konkretnie przyciętym obszarze kadru w okresie istotnym dla analizy każdego fagosomu. Proces ten przedstawiono na rysunkach 3 i 4.

  1. W menu "Wtyczki" na Fidżi użyj wtyczki "Time Series Analyzer", aby określić ogólny spadek intensywności sygnału sondy w całej ramce lub ROI w czasie (Rysunek 3).
    Uwaga: Wtyczka Time Series Analyzer jest dostępna do pobrania pod adresem http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html, jeśli nie jest jeszcze dostępna w menu Wtyczki.
  2. Wykreśl pomiar w czasie (w sekundach) w MS Excel, tylko dla ramek, które odpowiadają ramkom analizowanego fagosomu.
  3. Do wykresu należy zastosować liniową linię trendu (Rysunek 4A); ujemne nachylenie sygnału malejącego wskazuje na obecność efektu fotowybielania.
  4. Zastosuj odwrócone nachylenie do wartości z analizowanego fagosomu (rysunki 4B i 4C): Skorygowana intensywność sygnału (SI) = surowe SI + (czas w sekundach * odwrotne nachylenie)

Uwaga: każdy analizowany fagosom będzie miał określony przedział czasowy (zaczynający się od pełnej klatki absorpcji) podczas nagranego filmu poklatkowego; fotowybielanie musi zostać ponownie obliczone dla tego konkretnego zakresu i będzie ważne tylko do skorygowania zmierzonych wartości z tego konkretnego fagosomu.

9. Ocena danych

  1. Zbierz dane i oblicz średni oraz błąd statystyczny wartości skorygowanych o bielenie w odpowiednim oprogramowaniu.
  2. Wykreśl oceniane dane w odpowiedniej formie.

Uwaga: Tutaj użyto naukowego oprogramowania statystycznego i do tworzenia wykresów GraphPad Prism (http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/). Oprogramowanie Prism jest w stanie wygenerować i wykreślić średnią krzywą z odpowiednimi wskaźnikami błędów, o ile wszystkie dane mają tę samą liczbę klatek na sekundę (tj. wszystkie zostały pozyskane w tych samych odstępach czasu, np. jedna klatka co 10 sekund).

Uwaga: Duże różnice bezwzględnych wartości SI w powtórzeniach tego samego zestawu eksperymentów wprowadzą bardzo duży błąd statystyczny i spowodują, że dane staną się bezużyteczne. Może to mieć miejsce w przypadku, gdy protokół, np. ustawienia obrazowania, nie są ściśle identyczne dla różnych powtórzeń eksperymentu, które mają być zestawione.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prawidłowe przygotowanie komórek i kulek do obrazowania jest kluczowe. Rysunek 1 przedstawia schemat etapów wysiewania, ładowania sond oraz wstępnego obrazowania w tej metodzie, opracowany na podstawie naszego zoptymalizowanego protokołu dla BMM. Niezbędne jest zatem przetestowanie i zoptymalizowanie parametrów protokołu w zależności od rodzaju wykorzystywanych komórek i sond.

Po dodaniu kulek pokrytych IgG do uprzednio przygotowanych komórek, ważne jest wybranie pola widzenia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W dalszej części omówimy krytyczne etapy prezentowanej metody i jej ograniczenia. Ponadto połączymy niektóre z typowych problemów z ich rozwiązaniami, wprowadzimy możliwe modyfikacje i rozważymy zalety naszej metody, a także odpowiednie metody uzupełniające dla tego podejścia.

Przygotowanie kulek, w tym sprzężenie IgG z powierzchnią kulki, ma kluczowe znaczenie i należy unikać stosowania nieświeżych preparatów. Ponadto bardzo ważne jest również, aby dekstran był przygotowywany z zamrożonego wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy członkom Laboratorium Biologii Fagosomów za krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta jest wspierana przez grant Helmholtz Young Investigator (fundusze inicjatywy i sieci Stowarzyszenia Helmholtza) oraz grant Niemieckiej Rady ds. Badań Naukowych (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG) w ramach programu priorytetowego SPP1580).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)PAA, AustriaE15-009
Dulbecco's Modified Eagles Medium bez czerwieni fenolowej (D-MEM)PAA, AustriaE15-047
Płodowa surowica bydlęca (FBS)PAA, AustriaA15-151
L-glutaminaPAA, AustriaM11-004
PBSPAA, AustriaH15-002
Penicylina/StreptomycynaPAA, AustriaP11-010
WillCo-dish® Naczynie ze szklanym dnem (35 mm &puste;, #1.5)WillCo Wells, HolandiaGWSt-3522
Naczynie ze szklanym dnem CELLviewTM, 35 mmGreiner Bio one, Niemcy627871Alternatywa: Dostępne jako segmentowe
karboksylowane mikrosfery lateksowePolysciences, USA#09850Dostępne w różnych średnicach, użyliśmy 3 μ m
Mikrocząstki polistyrenuKisker Biotech, NiemcyPPs-3.0COOH
Triton-X 100ROTH, Niemcy305.1.3
mysz cała IgGRockland, USA010-0102
Sieciownik EDACSigma-Aldrich, USAE6383-1g
10 mM TrisSigma-Aldrich, USAT1503
Strzykawka 1 ml Omnifix -FB.Braun, Niemcy9161406V
26  Igła G (0,45*25 mm)B.Baun, Niemcy4657683
RPMI 1640PAA, AustriaE15-039
Surowica końskaGibco, USA16050-122
Hydrat MESSigma-Aldrich, USAM2933
0,2 μ Filtr strzykawkowy MSartorius, Niemcy83.1826.001

Bibliografia

  1. Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
  2. Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
  3. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  4. Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
  5. Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
  6. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
  7. Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
  8. Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
  9. Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
  10. Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
  11. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
  12. Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
  13. Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
  14. de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
  15. Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
  16. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
  17. Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
  18. Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
  19. Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
  20. Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
  21. Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
  22. Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
  23. Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
  24. Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
  25. Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
  26. Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
  27. Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
  28. Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
  29. Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
  30. Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
  31. Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).
  32. Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
  33. Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
  34. Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Dojrzewanie fagosomuobrazowanie żywych komórekmikroskopia konfokalnaobrazowanie poklatkowe (time-lapse)dostarczanie ładunku do lizosomówmikrokulki pokryte IgGsonda dekstranowamakrofagi szpiku kostnegomikroskopia fluorescencyjna
Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.