Komórki fagocytarne odgrywają główną rolę we wrodzonym układzie odpornościowym, usuwając i eliminując atakujące mikroorganizmy w swoich fagosomach. Dojrzewanie fagosomu to złożony i ściśle regulowany proces, podczas którego powstający fagosom przechodzi drastyczną transformację poprzez dobrze zaaranżowane interakcje z różnymi organellami komórkowymi i przedziałami w cytoplazmie. Proces ten, który jest niezbędny dla fizjologicznej funkcji komórek fagocytarnych poprzez nadanie fagosomom właściwości litycznych i bakteriobójczych, kończy się fuzją fagosomów z lizosomami i biogenezą fagolizosomów, która jest uważana za ostatni i krytyczny etap dojrzewania fagosomów. W niniejszym raporcie opisujemy opartą na obrazowaniu żywych komórek metodę jakościowej i ilościowej analizy dynamicznego procesu dostarczania zawartości lizosomów do fagosomów, co jest cechą charakterystyczną biogenezy fagolizosomów. Podejście to wykorzystuje mikrogranulki pokryte IgG jako model fagocytozy i cząsteczki dekstranu sprzężone z fluoroforem jako luminalną sondę ładunkową lizosomalną, w celu śledzenia dynamicznego dostarczania zawartości lizosmalnej do fagosomów w czasie rzeczywistym w żywych makrofagach przy użyciu obrazowania poklatkowego i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. W tym miejscu szczegółowo opisujemy tło, etapy przygotowania i konfigurację eksperymentalną krok po kroku, aby umożliwić łatwe i precyzyjne wdrożenie tej metody w innych laboratoriach. Opisana przez nas metoda jest prosta, solidna, a co najważniejsze, można ją łatwo dostosować do badania interakcji fagosomalnych i dojrzewania w różnych systemach i w różnych warunkach eksperymentalnych, takich jak użycie różnych typów komórek fagocytarnych, eksperymenty z utratą funkcji, różne sondy i cząstki fagocytarne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach
W tym artykule
Streszczenie
Wprowadzenie
Profesjonalne fagocyty, w tym makrofagi, odgrywają kluczową rolę w układzie odpornościowym. Oprócz tego, że są pierwszą linią obrony we wrodzonym układzie odpornościowym, odgrywają również kluczową rolę w aktywacji odporności adaptacyjnej poprzez swoją sygnalizację i rolę prezentującą antygen1-3. Podczas gdy funkcja profesjonalnych fagocytów jest wieloaspektowa, dojrzewanie fagosomów jest krytycznym szkieletem funkcji bakteriobójczej i przetwarzania antygenów przez profesjonalne fagocyty4,5. Po wchłonięciu i wychwycie za pośrednictwem receptora celu fagocytarnego, takiego jak bakterie, powstający fagosom przechodzi przez złożoną i dobrze zaaranżo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opieka nad zwierzętami i wszystkie procedury w tym protokole są zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi.
Przygotuj wcześniej przygotowania, które są oznaczone symbolem "Π-".
1. Przygotowanie BMM
- Wykonaj ubój myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Usuń kości udowe i piszczelowe, uwolnij kości z tkanek i przytnij oba końce, aby zapewnić dostęp do szpiku kostnego.
- Trzymaj kości w lodowatym PBS lub lodowatym podłożu DMEM (uzupełnionym 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, na lodzie do następnego kroku.
Uwaga: Wykonaj następujące kroki w komor....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Prawidłowe przygotowanie komórek i kulek do obrazowania jest kluczowe. Rysunek 1 przedstawia schemat etapów wysiewania, ładowania sond oraz wstępnego obrazowania w tej metodzie, opracowany na podstawie naszego zoptymalizowanego protokołu dla BMM. Niezbędne jest zatem przetestowanie i zoptymalizowanie parametrów protokołu w zależności od rodzaju wykorzystywanych komórek i sond.
Po dodaniu kulek pokrytych IgG do uprzednio przygotowanych komórek, ważne jest wybranie pola widzenia.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W dalszej części omówimy krytyczne etapy prezentowanej metody i jej ograniczenia. Ponadto połączymy niektóre z typowych problemów z ich rozwiązaniami, wprowadzimy możliwe modyfikacje i rozważymy zalety naszej metody, a także odpowiednie metody uzupełniające dla tego podejścia.
Przygotowanie kulek, w tym sprzężenie IgG z powierzchnią kulki, ma kluczowe znaczenie i należy unikać stosowania nieświeżych preparatów. Ponadto bardzo ważne jest również, aby dekstran był przygotowywany z zamrożonego wy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy członkom Laboratorium Biologii Fagosomów za krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta jest wspierana przez grant Helmholtz Young Investigator (fundusze inicjatywy i sieci Stowarzyszenia Helmholtza) oraz grant Niemieckiej Rady ds. Badań Naukowych (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG) w ramach programu priorytetowego SPP1580).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium bez czerwieni fenolowej (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-glutamina | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicylina/Streptomycyna | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Naczynie ze szklanym dnem (35 mm &puste;, #1.5) | WillCo Wells, Holandia | GWSt-3522 | |
| Naczynie ze szklanym dnem CELLviewTM, 35 mm | Greiner Bio one, Niemcy | 627871 | Alternatywa: Dostępne jako segmentowe |
| karboksylowane mikrosfery lateksowe | Polysciences, USA | #09850 | Dostępne w różnych średnicach, użyliśmy 3 μ m |
| Mikrocząstki polistyrenu | Kisker Biotech, Niemcy | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Niemcy | 305.1.3 | |
| mysz cała IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| Sieciownik EDAC | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich, USA | T1503 | |
| Strzykawka 1 ml Omnifix -F | B.Braun, Niemcy | 9161406V | |
| 26 Igła G (0,45*25 mm) | B.Baun, Niemcy | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Surowica końska | Gibco, USA | 16050-122 | |
| Hydrat MES | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0,2 μ Filtr strzykawkowy M | Sartorius, Niemcy | 83.1826.001 |
Bibliografia
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhit....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
